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肛周脓肿的诊断一般并不困难，其诊断依据主要包括以下3个方面。
患者会感到肛门疼痛，这种疼痛甚至可能影响到坐卧及日常活动，并伴有发热、恶寒等症状。对于结核性肛周脓肿患者，还可能出现发热、盗汗、咳嗽等表现。部分患者可能疼痛不明显，主要表现为肛门坠胀感、小便不畅等。
在体格检查时，可见肛门局部出现红肿，触压时伴有疼痛，部分患者可能发生溃口溢脓情况。肛内指诊时，医生常能在内口部位扪及压痛或凹陷性硬结。通过探针探查，可以探知脓腔的大小，有时探针甚至能从肛内内口部探出。肛镜检查则可见内口部的肛窦充血、肿胀，有时稍加按压即有脓液溢出。
实验室检查、X线检查、B超检查等辅助检查手段是检查本病的重要依据。在确诊为肛周脓肿后，还需要进一步查明脓肿的类型，包括脓肿所在的腔隙、位置，与肛门腺及肛门括约肌的关系，以及脓肿是特异性还是非特异性等，以便全面掌握病情，制定合适的治疗方案。
该病好发于肛门周围与臀部皮下，脓肿位置较浅且病变范围广泛。患者皮肤会增厚变硬，出现急性小脓肿与慢性窦道并存的情况，脓肿可能穿透肛门及臀部，脓液黏稠呈白粉粥样，并伴有臭味。慢性病患者可能出现消瘦、虚弱等消耗症状。
这两种疾病好发于尾骨及肛周皮下，表现为肿胀略突出，有溢脓外口，外口内可见脓栓。肛内指诊时，通常无法触及内口。
该病有时与直肠后部脓肿相似。肛内指诊可发现直肠后肿块光滑，无明显压痛，且有囊性感。由于该病多为先天性，因此应详细询问病史。X线检查可见骶前肿物将直肠推向前方，并可能有散在钙化阴影。病理检查可确诊该病。
克罗恩病并发肛周脓肿约占结肠克罗恩病的20%。局部表现为红肿，多自行破溃。患者常伴有不典型的肛门皲裂和瘘道，但无明显疼痛。结合病史、全身症状及纤维结肠镜检查、病理检查，通常不难鉴别。
该病发于女性，表现为肛周表浅性隆起、漫肿。肿痛多与月经周期一致，且常继发感染化脓。通过详细询问病史并结合症状，通常可作出鉴别。病理检查可确诊该病。