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前面的 t 检验，主要针对两组连续型数据的均数比较。但当比较的组数大于2时， t 检验就不再适用了。因为对比的组数大于2，若仍用前面介绍的 t 检验分别进行两两比较，会增加一些错误的风险。此时可考虑使用方差分析，其是进行多个均数比较的常用方法。
常用的基本概念如下。
□ 因素：将试验对象随机分为若干组，加以不同的干预，称为处理因素，其是方差分析中需要检验的变量。
□ 水平：在同一因素下的不同变量。例如，比较不同学历的幸福指数，研究因素是学历，学历下面有高中、大学、研究生3个水平。
在进行单因素方差分析时，需要满足一些基本假设：
□ 每个总体均服从正态分布。
□ 每个总体的方差相同，即方差齐性。
□ 从每个总体中抽取的样本相互独立，不会相互影响。
本节模拟一项研究，将60名学生分成3组并接受不同的教学方式，分别是教学方式A、B、C。教学结束时对学生进行测验并记录成绩，以此评估教学方式对成绩的影响。数据如表2.3所示，其中：
□ A：教学方式A的成绩。
□ B：教学方式B的成绩。
□ C：教学方式C的成绩。
表2.3 不同培训组测验成绩情况（部分）
（1）打开GraphPad Prism软件，如图2.23所示，在CREATE下选择Column选项。
图2.23 创建分析文件
（2）选择Data table下的Enter or import data into a new table单选按钮，再选择Options下的Enter replicate values, stacked into columns单选按钮。
（3）单击Create按钮，完成分析文件的创建。
将原始数据录入GraphPad Prism中，并将数据表重新命名为data，如图2.24所示。
图2.24 单因素方差分析数据录入
（1）进行正态性检验。与前面成组
t
检验所用的正态性检验方法一样，单击工具栏中的
按钮，弹出的对话框如图2.25（a）所示，选择Column analyses下的Normality and Lognormaity Tests选项，其他保持默认，单击OK按钮。
在弹出的对话框中保持默认设置，即采用4种正态性检验方法，如图2.25（b）所示。
图2.25 正态性检验参数设置
正态性检验结果如图2.26所示，可以发现，4种方法的正态性检验结果并不完全一致，GraphPad Prism推荐以D'Agostino & Pearson text方法为主，此时数据满足正态性分布。
图2.26 正态性检验结果
（2）进行单因素方差分析。单击工具栏中的
按钮，弹出的对话框如图2.27（a）所示，选择Column analyses下的One-way ANOVA（and nonparametric or mixed），其他保持默认，单击OK按钮弹出新的对话框，如图2.27（b）所示。
□ 在Experimental Design选项卡的Experimental design下选择No matching or pairing单选按钮，表示非配对。
□ 因为正态性检验已经通过，所以在Assume Gaussian distribution of residuals中选择Yes, Use ANOVA选项。如果正态性检验没通过，则选择非参数检验，GraphPad Prism采用的是Kruskal-Wallis test方式，如图2.27（c）所示。Kruskal-Wallis test的结果建议绘制箱式图或小提琴图。
□ 在Assume equal SDs下选择Yes.Use ordinary ANOVA test单选按钮，即默认当前比较的各组总体方差相等。若后续结果显示方差不齐，则建议使用秩和检验，不要使用变量变换或方差不齐的校正方法。
□ 在Multiple Comparisons选项卡中，选中Compare the mean of each column with the mean of every other column单选按钮，将每列平均值均与其他列进行比较，如图2.27（d）所示。如果选中Compare the mean of each column with the mean of a control column选项，则将Control column设置为Column A，即将A列平均值与其他列进行比较。
□ 如图2.27（e）所示，在Options选项卡中选择多重比较的方法，在correct for multiple下的Test下拉列表框中选择Tukey（recommended）方法。在Graphing中勾选Graph confidence intervals复选框，将返回差值的置信区间图。在Output中将P value style选项设置为APA格式。其他选项保持默认，单击OK按钮。
图2.27 单因素方差分析参数设置
注意： GraphPad Prism提供了几种用于单因素方差分析多重比较的方法，假设方差齐时，可以使用Tukey、Bonferroni、Sidak和Holm-Sidak方法。
（3）结果解释。单因素方差分析结果如图2.28所示。GraphPad Prism提供了两种方差齐性检验的方法，一种是Brown-Forsythe test方法，适用于数据不满足正态分布的情况，另一种是Bartlett's test方法，适用于数据服从正态分布的情况。本案例数据经Brown-Forsythe test和Bartlett's test方法检验 P 值均大于0.1，说明满足方差齐性。当满足方差齐性时，才可查看单因素方差分析的结果。如果不满足方差齐性，可以在图2.27（b）中的Assume equal SDs下选择No.Use Brown-Forsythe and Welch ANOVA tests单选按钮，进行布朗-福西斯和韦尔奇检验。
图2.28 单因素方差分析结果
在本案例中，ANOVA summary显示 F = 21.40， P ＜0.001，表明方差分析存在显著性差异，即3种不同的教学方式的成绩存在显著性差异，如果要回答具体是哪两组之间存在显著性差异，则需要进一步查看多重比较的结果。
如图2.29所示，在Multiple comparisons分析结果中，Tukey多重比较结果显示，A组与B组的差值为-14.10，置信区间为-21.39～-6.814，存在显著性差异（Adjusted P value＜0.001），A组成绩小于B组。A组与C组的差值为-19.10，置信区间为-26.39～-11.81，存在显著性差异（Adjusted P value＜0.001），A组成绩小于C组。而B组与C组的差值为-5.0，置信区间为-12.29～2.286，尚不存在显著性差异（Adjusted P value=0.233）。
如图2.30所示，在Descriptive statistics结果中，分别提供了A、B、C的统计数据，包括Minimum（最小值）、25% Percentile（第25百分位数）、Median（中位数）、75% Percentile（第75百分位数）、Maximum（最大值）、Mean（均数）、Std.Deviation（标准差）、Std.Error of Mean（均值标准误）、Lower 95% CI和Upper 95% CI（均值95%CI上下限）。
图2.29 单因素方差分析多重比较结果
图2.30 单因素方差分析统计
（1）单击图2.24导航栏Graphs下的New Graph，弹出的对话框如图2.31（a）所示。其中，Table选项设置为data，Show选项设置为Column，选择Mean/median & error选项卡下的第1个图形，其他选项保持默认，单击OK按钮，之后弹出柱状图草图，如图2.31（b）所示。
（2）在草图的 x 轴任意一处双击，即可弹出 x 轴的设置对话框，如图2.32（a）所示。
□ Ticks direction选项设置为Down，表示 x 轴的刻度线朝下，即在图形外部。
□ Ticks length表示刻度线的长度，此处选择Short，即短刻度线。
□ 其他选项保持默认即可，单击OK按钮。关于坐标轴的详细设置可以参见1.4节。
（3）在草图的 y 轴任意一处双击，即可弹出 y 轴的设置对话框，如图2.32（b）所示。 y 轴的设置与 x 轴的设置完全相同，此处不再赘述。
□ Ticks direction选项设置为Left。
□ Ticks length选项设置为Short。
□ Minor ticks选项设置为2。
□ 其他选项保持默认即可，单击OK按钮。
图2.31 单因素方差分析柱状图草图
图2.32 x 轴和 y 轴设置对话框
（4）在草图中双击图内教学方法A的柱状图，弹出的对话框如图2.33（a）所示。
□ 在Bars and boxes系列选项中，在Fill选项中设置柱状图填充颜色为浅绿色，在Border选项中设置柱状图边框粗细为None，表示柱状图无边框。
□ 在Error bars系列选项中，在Color选项中设置误差线的颜色为黑色，在Style选项中设置误差线的类型为T型，在Dir选项中设置误差线的方向为Above即上方，在Thickness选项中设置误差线的粗细1/2pt。
□ 其他选项保持默认，单击OK按钮。
使用相同的方法对教学方法B、C的柱状图进行相应设置，此处不再重复叙述，参数设置如图2.33（b）和图2.33（c）所示。
图2.33 柱状图设置
（5）单击 x 轴名称后，再次单击即可修改 x 轴名称。 y 轴名称和图名称的修改方法与此相同，不再赘述。
（6）单击工具栏中的
按钮，自动添加显著性标记。双击图中出现的显著性标记，可进一步对显著性标记进行修饰，参见2.1.3节。最终的图形如图2.34（a）所示。图2.34（b）～图2.34（f）的详细步骤见配书视频，另外也可参考2.4节绘制折线图。
图2.34 单因素方差分析效果图
方差分析对原始数据的要求与 t 检验一样，即要求数据满足独立性、正态性和方差齐性。当原始数据不满足以上条件时，建议采用非参数秩和检验。
关于多重比较，一般只有当方差分析的 P ＜0.05时，认为各组总体均数不等或不全相等，才有必要进行两两比较，否则无须进行两两比较。两两比较不能直接用 t 检验，因为此时会增加一些错误风险。
单因素方差分析仅考虑一个独立因素的影响。在实际研究中，可能存在其他潜在的影响因素或协变量，因此在进行单因素方差分析的结果解释时应谨慎。