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两独立样本 t 检验也称为成组 t 检验，用于判断两组之间的均数的差异是否显著。举一个简单的例子：比较男女之间的体重是否存在差异。
两独立样本 t 检验的前提是数据需满足独立性、正态性和方差齐性。如果不满足正态性和方差齐性，建议直接使用非参数秩和检验。
下面模拟一项研究，分析不同处理方法中实时荧光定量聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）检测两个靶标的阈值循环数（Cycle Threshold，Ct）值是否有差异，收集的变量有两个，数据见表2.1。其中：
□ 实验组：实验组的Ct值。
□ 对照组：对照组的Ct值。
表2.1 两种处理组PCR检测Ct值（部分）
（1）打开GraphPad Prism软件，如图2.1所示，在CREATE下选择Column选项。
图2.1 创建分析文件
（2）选中Data table下的Enter or import data into a new table单选按钮，再选中Options下的Enter replicate values，stacked into columns单选按钮。
（3）单击Create按钮，完成分析文件的创建。
将在Excel中整理好的数据直接复制进GraphPad Prism中，如图2.2所示。此处仅罗列部分数据，共有两列，分别是实验组和对照组，然后将其命名为data。
图2.2 输入数据并重命名
1）正态性检验
单击工具栏中的
按钮，弹出的对话框如图2.3（a）所示，选择Column analyses下的Normality and Lognormality Tests选项，单击OK按钮。弹出的对话框如图2.3（b）所示，GraphPad Prism提供了以下4种正态性检验的方法。
□ D'Agostino & Pearson正态性检验，其首先计算偏度和峰度，然后计算这些值与高斯分布预期值的差异，从而得到 P 值。如果 P 值较大，则数据符合正态分布；如果 P 值较小，则数据不符合正态分布。
图2.3 正态性检验
□ Anderson-Darling检验，其将数据的累积分布与累积高斯分布进行比较得到 P 值。考虑了累积分布曲线各部分的差异，是一种敏感且有效的方法。
□ Shapiro-Wilk正态性检验，当数据中的每个数值都唯一时，Shapiro-Wilk检验效果较好。若有多个数值相同，则效果可能会受到影响。该方法适用于小样本。
□ Kolmogorov-Smirnov检验，其比较数据的累积分布与累积高斯分布之间的最大差异，从而得到 P 值。该方法适用于大样本。
本例中保持默认设置，同时采用4种方法进行正态性检验，单击OK按钮。
正态性检验结果如图2.4所示，4种检验方法的结果并不一致。一般GraphPad Prism推荐以D'Agostino & Pearson法的结果为主。因此本案例数据可认为符合正态分布。
图2.4 正态性检验结果
2）进行成组 t 检验
单击工具栏中的
按钮，弹出的对话框如图2.5（a）所示，选择Column analyses下的t tests（and nonparametric tests），单击OK按钮，弹出新的对话框。
□ Experimental Design选项卡如图2.5（b）所示。选择Experimental design下的Unpaired单选按钮表示非配对设计。本案例的数据经正态性检验后均服从正态分布，所以在Assume Gaussian distribution中选择Yes, Use parametric test单选按钮，即 t 检验。在Choose test中默认选择Unpaired t test. Assume both populations have the same SD单选按钮，即先认为当前数据满足方差齐性，再根据后续的分析结果决定是否要重新选择方法。
□ Residuals选项卡如图2.5（c）所示。该选项卡可以绘制残差相关图形，帮助判断数据是否服从正态分布、是否满足方差齐性。这里保持默认，不选择任何选项。
□ Options选项卡如图2.5（d）所示。Calculations下的P value选项选择Two-tailed（recommended）单选按钮，即双侧检验。在Graphing options下勾选Graph CI of difference between means（Estimation Plot）复选框，绘制差值及其95%置信区间；在Additional results下勾选Descriptive statistics for each data set复选框，进行描述性统计。
□ 最后单击OK按钮。
如果数据没有通过正态性检验，可以在Assume Gaussian distribution下选择No, Use nonparametric test单选按钮，进行非参数秩和检验。在Choose test下选择Mann-Whitney test.Compare ranks单选按钮，确定进行曼-惠特尼秩和检验，如图2.6所示。秩和检验的结果建议绘制箱线图或小提琴图。
图2.5 两独立样本 t 检验方法选择与参数设置
3）结果解释
成组 t 检验输出结果如图2.7（a）所示。
□ 查看当前数据是否满足方差齐性，在F test to compare variances结果中，P value=0.2532＞0.05，表明数据满足方差齐性。如果方差齐性检验没有通过，则建议使用非参数秩和检验，而不要进行所谓的方差不齐校正或者变量变换。
□ 查看 t 检验结果， t = 2.448， P =0.0209＜0.05，即两种处理组PCR检测Ct值存在显著性差异。
□ 查看描述性结果，A列的均值为22.67，B列的均值为24.60。B列与A列的差值及其标准误为1.933±0.7896，差值的95%置信区间是0.3159～3.551。
另外，在Descriptive statistics结果中罗列了更加详细的结果，如图2.7（b）所示，分别提供了实验组、对照组各自的Minimum（最小值）、25% Percentile（第25百分位数）、Median（中位数）、75% Percentile（第75百分位数）、Maximum（最大值）、Mean（均数）、Std.Deviation（标准差）、Std.Error of Mean（均值标准误）、Lower 95% CI和Upper 95% CI（均值95%CI上下限）。
图2.6 非正态数据的非参数检验设置
图2.7 成组 t 检验输出结果
Estimation Plot结果如图2.8所示，差值的95%置信区间不包含0，亦说明两组之间存在显著性差异。如果上下误差线包含0，则表示两组之间不存在显著性差异。
图2.8 两样本均值差±95%置信区间
（1）单击图2.2导航栏Graphs下的New Graph，弹出的对话框如图2.9（a）所示，选择Mean/median & error选项卡下的第1个图形，在Column bar graph下设置Plot为Mean with SD，即均数和标准差，单击OK按钮生成柱状图草图，如图2.9（b）所示。
注意： 图2.9（a）中提供了多种图形，如散点图、箱式图、小提琴图、折线图等，限于篇幅无法一一罗列绘制步骤，读者在实操过程中可自行尝试，也可以参阅本书的配套视频，其中有详细介绍。
图2.9 图形选择及柱状图草图
（2）在草图的 x 轴任意一处双击，即可弹出 x 轴的设置对话框，如图2.10（a）所示。
□ Automatically determine the range and interval选项默认是被勾选的，表示自动化处理 x 轴的范围和刻度线等，此处取消勾选，进行手动设置。
□ Ticks direction选项设置为Down，表示 x 轴的刻度线朝下，即在图形外部。
□ Ticks length表示刻度线长度的设置，此处选择Short，即短刻度线。
□ 其他选项保持默认即可，单击OK按钮。关于坐标轴的详细设置参见1.4节。
（3）在草图的 y 轴任意一处双击，即可弹出 y 轴的设置对话框，如图2.10（b）所示。 y 轴的设置与 x 轴的设置完全相同，此处不再过多罗列。
□ Ticks direction选项设置为Left。
□ Ticks length选项设置为Short。
□ Minor ticks选项设置为2。
□ 其他选项保持默认即可，单击OK按钮。
图2.10 x 轴、 y 轴设置界面
（4）在草图中，双击图形内部实验组柱状图，弹出的对话框如图2.11（a）所示。
□ 在Bars and boxes系列选项中，在Fill选项中设置柱状图的填充色为绿色，在Border选项中设置柱状图的边框粗细为1/4pt，在Border color选项中设置柱状图的边框颜色为黑色。
□ 在Error bars系列选项中，在Color选项中设置误差线的颜色为黑色，在Style选项中设置误差线的类型为T型，在Dir选项中设置误差线的方向为Above，即上方。
□ 其他选项保持默认，单击OK按钮。
对照组柱状图的设置方法与此相同，如图2.11（b）所示，不再重复罗列。
（5）单击工具栏中的
按钮，自动添加显著性标记。通过双击显著性标记区域，弹出的对话框如图2.12所示，可以对显著性标记进行优化。
□ 在Display options下若选择P value（number）and brackets，则显示显著性差异 P 值。若选择Asterisks（P value classification）and brackets，则用星号表示显著性。
□ P value threshold选项用于显著性标记绘制的筛选，如果选择Only comparisons with P value less than or equal to 0.05，则只绘制 P ≤0.05的两两比较，而对于 P ＞0.05的两两比较则不绘制其显著性标记图。
此外，在Line/bracket and text options选项中还可以设置显著性连线的长度、形状和颜色等格式。
图2.11 柱状图设置界面
图2.12 显著性标记绘制和修改
最终将获得如图2.13（a）所示的效果。除了柱状图以外，还可以选择绘制其他类型的图形，如图2.13（b）～（f）所示，这些图形的绘制步骤见配书视频教程。
图2.13 美化后的成组 t 检验图形
注意： 在进行成组 t 检验时，需要满足一定的前提条件，即样本数据应来自正态分布或近似正态分布的总体，各观察对象间相互独立并且不能相互影响，两样本的方差应相等或至少相近。