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摘 要 目的：探讨间歇低氧暴露防治运动性贫血的效果，并从肾脏和血清促红细胞生成素（EPO）的变化探索低氧防治运动性贫血的机制。方法：雄性SD健康大鼠在6周递增负荷运动训练后，3周和6周递增负荷运动建立运动性贫血模型后3周在常压低氧环境下（氧浓度为14.5%）分别采用每天1h、2h和（1+1）h3种暴露方式进行刺激，实验结束后测试各组大鼠血红蛋白（Hb）、红细胞数量（RBC）和红细胞比容（Hct）等红细胞参数及肾脏、血清EPO含量，并分别与对照组比较。结果：①6周递增负荷运动后3周进行间歇低氧暴露的预防各组的与运动对照组比较，Hb均显著上升（ P ＜0.05），而RBC和Hct除运动低氧暴露1h预防组外，其他两组均显著增加（ P ＜0.05）；各组肾脏EPO显著性升高（ P ＜0.05），而各组血清EPO虽有上升，但均未见显著性差异（ P ＞0.05）；②1h、2h和（1+1）h3种低氧暴露方式均使运动性贫血大鼠的Hb、RBC和Hct显著高于常氧恢复组（ P ＜0.05， P ＜0.01）；低氧暴露各组运动性贫血大鼠肾脏、血清EPO水平均显著性高于常氧恢复组（ P ＜0.05）。结论：间歇低氧暴露能加速机体红细胞的生成，有助于防治运动性贫血，其作用机理可能与间歇低氧暴露提高肾脏和血清EPO有关。
关键词 间歇低氧；促红细胞生成素；红细胞参数；递增负荷运动；运动性贫血；大鼠
Abstract Objective：To explore the effect of prevention and treat sports anemia by intermittent hypoxic exposure，and study the mechanism of hypoxic exposure on preventing and treating sports anemia from the change of the kidney and serum erythropoietin（EPO）. Methods：①The rats of sportive groups were trained through 6-week treadmill exercise with progressive loading. Three groups were put in artificial hypoxic environment（the oxygen contentration was 14.5%）1hour，2 hours and（1+1）hour per day respectively for 3 weeks. ②A rat model of sports anemia was established through 6-week treadmill training with progressive loading. With the model，the rats were under hypoxic exposure with the same mode. Erythrocyte parameters，kidney EPO and serum EPO levels were investigated. Results ：①After 6-week treadmill exercise with progressive loading，the hemoglobin（Hb）levels of the intermittent hypoxic exposure groups increased significantly（ P ＜0.05），while red blood cell（RBC）and haematocrit（Hct）of other towhypoxia exposure groups increased significantly（ P ＜0.05）expect 1 hour group.The kidney EPO levels increased significantly（ P ＜0.05）. Serum EPO level revealed no significant difference（ P ＞0.05），though with an augmented tendency. ②After hypoxic exposure，the Hb，RBC and Hct levels increased significantly（ P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively）. The kidney EPO and serum EPO levels increased significantly（ P ＜0.05）. Conclusion：The hypoxic exposure can accelerate the production of erythrocyte，and treat sports anemia effectively. Enhancement of kidney and serum EPO is thought to be the possible mechanism.
Key words intermittent hypoxic，erythropoietin，erythrocyte parameter，exercise of progressive loading，sports anemia，sprague-dawly rats
红细胞生成素（EPO）是红细胞发育必需的生长因子，它作用于骨髓早期红细胞克隆形成单位（CFU-E），使其增殖、分化、成熟。人的正常红细胞生成素浓度在体内是处于持续低水平状态，贫血时体内EPO水平增加。当EPO水平升高时，红细胞的形成也随之增加，提示贫血可以用EPO纠正。临床表明，外源性EPO可以有效防治贫血，但对由于大负荷运动训练引起的血红蛋白（Hb）低下的运动员来说，这种方法有悖于奥林匹克精神而被列入兴奋剂之列。低氧是诱导内源性EPO分泌的刺激因素之一，那么能否借助低氧条件干预来防治运动性血红蛋白低下的现象。本研究在递增负荷运动训练中和建立运动性血红蛋白低下模型的基础上，探讨间歇低氧暴露对运动性血红蛋白低下状态时红细胞的生成和EPO的变化，了解间歇低氧防治运动性血红蛋白低下的效果，并从EPO的变化探索低氧防治运动性血红蛋白低下的机理。
实验对象为雄性SD健康大鼠100只，6周龄，体重（158±12）g，广东实验动物研究所提供。分笼饲养，自由饮食，饲料为全价营养颗粒饲料（铁含量为43mg/100g）。室温（23±2）℃，相对湿度40%～60%，自然昼夜节律变化光照。适应环境1周后进行实验。
将50只大鼠随机分为安静对照组、运动对照组、运动间歇低氧暴露1h组、运动间歇低氧暴露2h组和运动间歇低氧暴露（1+1）h组。每周运动6d，一周内每天运动时间比前一天增加5min，运动速度每周递增。第4周起运动低氧组开始进行低氧刺激。低氧暴露采用美国Hypoxico公司制造的低氧分压系统（HTS），造成人工的常压低氧环境，低氧浓度控制在14.5%左右。按分组分别每天在常压低氧舱进行1h、2h和（1+1）h低氧暴露，（1+1）h组中间间歇3h，其余时间在舱外常氧中自由活动，每周6d（治疗实验同），3周后测试大鼠血细胞参数和肾脏、血液EPO。
对另外40只大鼠进行6周递增负荷跑台运动建立运动性贫血模型后，随机分为常氧恢复组、低氧暴露1h组、低氧暴露2h组、低氧暴露（1+1）h组。低氧暴露方式与预防实验相同。3周后测试大鼠血细胞参数和肾脏、血液EPO。
在末次干预结束后24h左右，用10%水合氯醛溶液注射麻醉实验大鼠，分别用真空抗凝管和血清管进行腹主动脉取血，真空抗凝管混匀待测红细胞参数；血清管3 000r/min离心20min，取血清-20℃低温保存待测EPO。随后取大鼠肾脏，滤纸吸干血迹后经处理待测EPO。
红细胞参数采用德国Bayer公司生产的ADVIA120全自动六分类血球分析仪及其配套试剂测试，采样后0.5～2h内完成测试。血清、肾脏EPO采用酶联免疫吸附法，美国ADL公司试剂，仪器为美国产RT-2100C型多功能酶标仪。组织蛋白定量采用考马斯亮蓝法，由南京建成生物工程研究所提供试剂，比色仪器为722分光光度计。
实验数据以由平均值±标准差表示。采用SPSS11.0统计软件包进行独立样本T检验或One-way ANOVA检验，显著性水平为P＜0.05，极显著性水平为P＜0.01。
表1可见，6周实验结束后，与安静对照组对比，运动对照组大鼠肾脏、血清EPO有所升高，但没有统计学意义（ P ＞0.05），间歇低氧预防各组肾脏、血清EPO显著或极显著性升高（ P ＜0.05， P ＜0.01）。与运动对照组比较，间歇低氧预防各组肾脏EPO显著性升高（ P ＜0.05），其中低氧暴露（1+1）h预防组水平最高，而间歇低氧暴露预防各组血清EPO虽有上升，但均未见显著性差异（ P ＞0.05）。
表1 安静对照组和运动对照组与间歇低氧暴露预防各组大鼠血清、肾脏EPO比较
注：与安静对照组相比，*为 P ＜0.05，**为 P ＜0.01；与运动对照组相比，#为 P ＜0.05， ## 为 P ＜0.01。
表2可见，6周实验结束后，与安静对照组大鼠对比，运动对照组大鼠Hb、RBC和Hct均极显著下降（ P ＜0.01），而间歇低氧预防各组Hb未表现出显著性差异（ P ＞0.05）。与运动对照组比较，间歇低氧预防各组Hb均显著上升（ P ＜0.05），其中（1+1）h预防组水平最高，但各组间没有显著性差异（ P ＞0.05），而RBC和Hct除运动低氧暴露1h预防组外，其他两组均显著增加（ P ＜0.05）。
表2 安静对照组和运动对照组与间歇低氧暴露预防各组大鼠红细胞参数比较
注：与安静对照组相比，*为 P ＜0.05，**为 P ＜0.01；与运动对照组相比，#为 P ＜0.05， ## 为 P ＜0.01。
表3可见，低氧暴露对大鼠肾脏EPO水平影响较大，不论是低氧暴露1h治疗组还是低氧暴露2h治疗组、低氧暴露（1+1）h治疗组都显著性高于常氧恢复组（ P ＜0.05），尤以低氧暴露（1+1）h治疗组的水平最高，但各低氧暴露治疗组之间差异没有显著性（ P ＞0.05）；各组血清EPO变化与肾脏相似。
表3 安静对照组和间歇低氧暴露治疗各组大鼠肾脏、血清EPO比较
注：与常氧恢复组相比，*为 P ＜0.05，**为 P ＜0.01。
表4可见，3周低氧暴露后，与常氧恢复组相比，低氧暴露1h组、低氧暴露2h组和低氧暴露（1+1）h组3组大鼠的红细胞参数Hb、RBC和Hct均出现显著或极显著性升高（ P ＜0.05、 P ＜0.01），但低氧暴露各组间的红细胞各参数未见显著性差异变化（ P ＞0.05）。
表4 常氧恢复组和间歇低氧暴露治疗各组大鼠红细胞参数比较
注：与常氧恢复组相比，*为 P ＜0.05，**为 P ＜0.01。
EPO是一种调节红细胞生成的多肽类激素，1957年，Jacobson等发现肾脏是产生EPO的主要器官，EPO主要由浅表肾单位的肾小管周围毛细血管内皮细胞或成纤维细胞合成，也可由肝脏、巨噬细胞、有核红细胞产生，但不足总量的10%～15%。EPO可定向与红系祖细胞的特殊受体相结合，加速骨髓幼红细胞成熟、释放，并促使骨髓网织红细胞进入循环，使红细胞生成增加，并且刺激特异性血红蛋白的合成。EPO是由低氧诱导产生的，其基因的3’非翻译区包含有低氧诱导因子-1（HIF-1）反应元件，HIF-1作用于EPO 3’端的启动子，使启动子与强化子发生协同作用，上调靶基因，激活EPOmRNA的转录。任何引起肾脏氧供应不足的因素均可促进EPO的合成和分泌，使EPO的含量增加。研究表明，机体暴露低氧环境后30min，血清EPO即开始升高，处于缺氧环境中4h以上，即可引起EPO浓度急剧上升，24h达到高峰，随后EPO水平逐渐下降，但仍高于平原时对照水平。冯连世等测定了SD雄性大鼠在模拟不同海拔游泳训练后EPO mRNA的变化，结果显示海拔3 000m和4 000m对照组较平原对照组有显著性增加。林文弢等研究发现，SD大鼠经过1个月的运动训练和间歇低氧暴露后，EPO显著增加，常压模拟高住安静组EPO值高于低住安静组34.4%，常压模拟高住低练组高于低住低练组47.7%，均有极显著差异，表明间歇低氧环境能持续地提高安静组和运动组大鼠的血清EPO含量。
本实验研究结果显示：在递增负荷运动中后3周进行间歇低氧暴露，或是由运动诱导运动性血红蛋白低下后进行3周间歇低氧暴露，3周间歇低氧暴露结束后，不论是低氧暴露1h组还是低氧暴露2h组或低氧暴露（1+1）h组，其肾脏EPO含量均显著性高于运动对照组或常氧恢复组（ P ＜0.05），这与大多数研究结果相一致。血清EPO含量变化在治疗运动性血红蛋白低下实验各组与常氧对照组比较，则显著升高（ P ＜0.05），而运动低氧暴露预防各组与运动对照组比较虽有升高，但未见显著性差异，其中原因可能与递增负荷运动中EPO的利用和分解代谢加强有关。但是，以上结果仍然说明间歇低氧暴露能提高大鼠的肾脏、血清EPO含量。低氧暴露引起肾脏氧供应不足，上调肾脏EPOmRNA基因表达，促进肾脏分泌EPO，进入血液使血清EPO升高，从而促进造血干细胞和祖细胞的分化增殖，释放到外周血循环，从而使机体红骨髓内红细胞合成速率大大高于红细胞的破碎速率，导致红细胞水平和血红蛋白浓度上升，改善了血红蛋白下降的状况。
运动性血红蛋白低下是指运动训练或比赛使单位容积Hb、RBC和Hct低于自身基础值的现象，是机体对大负荷运动训练或比赛的应答。由于血红蛋白含量和红细胞数量直接决定血液的运氧能力，大负荷运动训练引起血红蛋白含量的下降，势必引起机体全身组织和器官发生不同程度的缺氧，影响运动员运动能力、训练效果以及运动后机能的恢复，也是导致过度训练和免疫机能下降的重要诱因。所以必须以预防为主，积极治疗。为探索间歇低氧暴露防治运动血红蛋白低下的效果，本实验采用SD大鼠作为研究对象，分布在大运动负荷期间和建立运动性血红蛋白低下模型的基础上，分别对1h、2h和（1+1）h3种低氧暴露模式对运动性血红蛋白低下的影响进行研究，结果发现：不论是在递增负荷运动中进行间歇低氧暴露，还是由运动诱导运动性血红蛋白低下后进行间歇低氧暴露，经过3周间歇低氧暴露后，除低氧预防组实验中1h组未见明显效果外，其余低氧暴露各组大鼠的Hb、RBC和Hct红细胞参数均比对照组大鼠显著或极显著性地升高（ P ＜0.05、 P ＜0.01），说明间歇低氧暴露有助于预防和治疗运动性血红蛋白低下的状况，并且与间歇低氧暴露方式有关。这可能与大鼠自身血红蛋白低下和低氧环境双重刺激而引起机体造血机能提高有关。研究表明，递增负荷运动引起红细胞数量减少是由于红细胞生成速度低于破坏速度的缘故，而红细胞破坏的增加与递增负荷运动中溶血、自由基生成等原因有关。低氧环境下加剧了递增负荷诱导下缺氧状态而诱导机体造血基质细胞、肾细胞、肝细胞等产生造血生长因子物质（如EPO等）。
另一方面，运动性贫血建模停止后，体内环境得到改善，EPO促进红细胞生成增加而破坏减少，使Hb、RBC和Hct水平提高，有利于满足机体对氧的需求，这也是机体自身调节的结果。当然，红细胞数量的增加也与低氧暴露下机体红细胞抗氧化能力增强，降低了红细胞的氧化损伤程度，使红细胞破碎减少有关。至于本实验中3种不同低氧暴露方式之间的红细胞参数没有显著性差异，可能与低氧暴露时间差异不大有关。但从变化趋势分析，无论是预防组还是治疗组，（1+1）h低氧暴露方式的效果相对较好，说明在应用间歇低氧暴露防治运动性血红蛋白低下时，应采用适宜时间的多次间歇暴露，其效果会相对较好。
间歇低氧暴露能显著或极显著提高递增负荷运动中和运动性血红蛋白低下大鼠的Hb、RBC和Hct水平，表明间歇低氧暴露对预防递增负荷运动引起的运动性血红蛋白低下和促进运动性血红蛋白低下的恢复，有一定的作用。
间歇低氧暴露能使递增负荷运动中和运动性血红蛋白低下大鼠的肾脏和血清EPO水平显著性升高。表明间歇低氧暴露对预防递增负荷运动引起的运动性血红蛋白低下和促进运动性血红蛋白低下的恢复与EPO有关。
3种低氧暴露方式之间对大鼠相关指标的影响未见明显差异，可能与低氧暴露时间差异不大有关。但从变化趋势分析，无论是预防组还是治疗组，（1+1）h低氧暴露方式的效果相对较好，表明在应用间歇低氧暴露防治运动性血红蛋白低下时应采用适宜时间的多次间歇暴露，其效果会相对较好。