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核酸测序在分子生物学研究中是一项非常重要且意义重大的技术。测序技术最早可以追溯到20世纪70年代，1977年Sanger发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Maxam与Gilbert发明的化学降解法标志着第一代测序技术的诞生。以Sanger法为代表的新一代测序技术测序读长可达1000 bp，准确率高（可达99.999%），对生物学研究具有重要意义。人类基因组计划（HGP）就是基于第一代测序技术完成的。
第一代测序方法因通量低、成本高、速度慢，已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求。这促使了宏基因组下一代测序（mNGS）技术的诞生。mNGS的测序读长比第一代的测序读长短，但拥有通量高、周期短、成本低的优点。不同测序平台的测序方法有所不同，在读长和准确度方面各有优劣。其中世界上使用量最大的新一代测序仪是Illumina公司的Solexa和Hiseq，核心原理是边合成、边测序，其综合性价比较高，测序错误率在1%～1.5%，是临床常用的测序方法。
随着mNGS技术的不断发展，其在感染性病原体检测、病原生物学特征和分子流行病学分析中展现了独特的技术优势和广阔的应用前景。传统的病原微生物检测方法主要包括形态学检测、培养分离、生化检测、免疫学和核酸检测。因操作简单、快速、技术要求不高，同时具有一定的诊断敏感性和特异性，目前仍在临床上广泛使用。但传统的检测方法在敏感性、特异性、时效性、信息量等方面存在局限，而且对于未知或者罕见的病原微生物，无法快速识别。mNGS技术不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等），且无须特异性扩增，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。根据目前的临床经验、研究结果、mNGS技术的优势及专家共识，总结出mNGS技术6个主要适应证：①病情危重；②特殊患者，如免疫抑制宿主、合并基础疾病和反复住院的重症感染患者；③传统微生物检测结果反复阴性且治疗效果不佳；④疑似新病原体，临床上提示可能有一定的传染性；⑤疑似特殊病原体感染；⑥长期发热和/或伴有其他临床症状、病因不明的感染。符合以上适应证的患者，应尽快送标本进行检测。
mNGS技术的实验流程主要分为样本运输、建库与测序及生物信息分析。其中，建库与测序可以细化为样本前处理、样本总核酸的提取、核酸片段化处理、建立测序文库、上机测序及原始下机数据处理等流程；生物信息分析又可以细分为病原数据库比对（比对微生物检出的序列数、基因组覆盖度、测序深度和属种相对丰度等）、实验质控、判读并出具临床报告等流程。
mNGS技术由于灵敏度很高，故需要对临床样本的采集严格要求。样本采集原则：对于感染患者或原因不明的发热患者，应采集感染部位样本进行mNGS检测。样本类型主要有静脉血、脑脊液、肺泡灌洗液、痰液、胸腔积液、腹腔积液、咽部分泌物、局灶穿刺物等多种类型。为减少样本污染，标本收集需要注意以下原则。①严格执行无菌操作：采集无菌标本时应注意对局部及周围皮肤进行消毒，如使用消毒液消毒皮肤，应待其干燥后再采样，尽量收集第二管标本送检，采集的标本须用无菌容器盛装；②采集无菌部位的标本：无菌部位的标本具有更高的临床价值，应尽量送检无菌部位的标本；③选择合适的标本种类：原则上送检感染部位的体液或者组织标本，因其敏感性、特异性和可信度更高，如果感染部位的体液或者分泌物不易采集或者标本不理想，可以选择血液标本。
另外对于影响检验结果的关键过程，需要有相应的质控点，包括运输过程保持低温状态，保证核酸提取质量、文库出库浓度和片段分布大小、下机总数据量、有效数据量、测序质量及数据分析可靠性等。任何不符合质控标准的检测都应及时终止并重新检测，或者在无法重新检测的情况下提供预警，以供临床参考。
全流程的质控标准应包含但不限于如下几点：①每批次实验中都应该包括内参和/或阳性、阴性对照品；②内参和/或阳性对照品被有效检出且检测到的碱基序列片段数量应该满足实验预期的检测敏感度阈值；③对于不同类型的样本，建议设定基本的序列数据量；④为确保序列比对的准确性，避免因同源错配导致的序列比对错误，建议测序序列读长不少于50 bp（单端读长50个碱基）。
目前生物信息分析的平台和软件有很多，测序后的数据需要与微生物数据库进行对比，参考同批次阴性质控标本排除污染。根据丰度、检出的序列数、基因覆盖度等进行排序，根据检测阈值及临床数据筛选病原菌，最终得出检测报告。对于检测报告的解读，目前尚无单纯基于测序结果判断致病菌、污染菌或定植菌的标准，故对于测序结果的判读需结合临床综合判断。
目前mNGS技术作为病原体诊断新利器，对临床的帮助很大，但mNGS技术的病原体单次检测费用仍然较高，且基于成本、报销、时间及法规方面的考虑，临床的感染病原体检测仍然以常规检测技术为主，对疑难危重症、免疫缺陷等特殊患者进行mNGS的意义会更大。对于mNGS技术的更新与应用还有更大的发展空间，如进行定量检测、准确的耐药基因分析、毒力分析等，同时需进一步确定标准、规范的操作流程，制订结果分析指南，通过技术升级及改进降低检测成本，完善参考数据库信息，期待mNGS技术在感染性疾病诊治中有更深入、更广泛的应用。
（王强 沈君）
［1］宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用专家共识组. 宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识［J］. 中华急诊医学杂志，2019，28（2）：151-155.
［2］《中华传染病杂志》编辑委员会. 中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识［J］. 中华传染病杂志，2020，38（11）：681-689.