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纸色谱法是以滤纸为载体，以纸上所含水或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。供试品经展开后，可用比移值（ R f ）表示各组成成分的位置，由于影响比移值的因素较多，因而一般采用在相同实验条件下与对照品对比以确定其异同。进行制剂鉴别时，供试品在色谱中所显主斑点的位置、颜色（或荧光），应与对照品相同。此法由于展开时间长、分离效果差等原因，极少应用。
【例3-26】 化癥回生片中益母草的鉴别
组成：益母草、红花、花椒（炭）、水蛭（制）、当归等。
鉴别：取本品20片，研细，加80％乙醇50mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加1％盐酸溶液5mL使溶解，滤过，滤液加碳酸钠试液调节pH至8，滤过，滤液蒸干，残渣加80％乙醇3mL使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸水苏碱对照品，加乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照纸色谱法（2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0501）试验，吸取上述两种溶液各10～20μL，分别点于同一层析滤纸上上行展开，使成条状，以正丁醇-醋酸-水（4∶1∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，放置6小时。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
薄层色谱法（TLC）鉴别苗药制剂，通常是在同一块薄层板上点加供试品和对照品，在相同条件下展开，显色检出色谱斑点后，将所得供试品与对照品的色谱图进行对比分析，从而对制剂进行鉴别。
薄层色谱法作为目前苗药制剂鉴别最常用的方法之一，具有简便、快速、易普及等特点。该法具有分离和分析双重功能。为了保证试验的重现性、准确性及分离度，薄层色谱需要进行规范化操作。
（1）供试液的制备：薄层色谱法虽然有分离作用，但分离能力有限，有的被检成分含量相对较少，有的成分展开后可能仍与其他成分斑点混合在一起难以检出。因此，有必要对样品进行适当的提取和净化，以除去干扰成分，提高被检成分浓度，获得清晰的色谱图。
样品预处理的方法很多，有浸渍法、加热回流提取、超声提取、水蒸气蒸馏法提取和升华法分离等。对于提取液的进一步净化，可采用液液萃取法、固液萃取法（即用自制或商品化小型色谱柱，如中性氧化铝柱、大孔吸附树脂柱、离子交换树脂柱和C 18 柱等）。
（2）对照物的选择：薄层色谱鉴别用的对照物有对照品、对照药材、对照提取物三种。一般情况下，选用对照品即可满足薄层鉴别的需要，而有些情形下需结合对照药材或对照提取物才能确定制剂的真实性。
①对照品对照：用已知苗药制剂中某一药材的某一有效成分或特征性成分对照品制成对照液，与样品在同一条件下展开，显色，比较在相同位置上有无同一颜色（或荧光）的斑点，以此来检测制剂中是否含有某原料药材。当同时检测多种成分时，如果这些成分的化学类型相近，可以将多个对照品和样品分别点样于同一薄层板上展开；如果待检测的各成分化学类型不同，可按各类成分色谱条件在不同薄层板上进行鉴别，也可采用适当的色谱条件，将不同的成分点在同一薄层板上进行鉴别。
②阴阳对照法：由于苗药制剂中化学成分复杂，在薄层板上分离度有限的前提下，要验证薄层鉴别的专属性，常采用本法。
阳性对照液制备：把制剂中要鉴别的某对照药材，按制剂的制法处理后，以制剂相同的比例、条件、方法提取，制成该味药的阳性对照液。
阴性对照液制备：从制剂处方中减去要鉴别的该味药材，剩下其他各味药，按制剂方法处理后，以制剂相同比例、条件、方法提取，所得的提取液，为该味药的阴性对照液。
将样品和阳性对照液、阴性对照液在同一条件下展开，观察样品在同一位置上与阳性对照液有无相同颜色的斑点，以决定样品中有无该味药的成分，并且观察阴性对照液中有无干扰，确定该鉴别的专属性。用阳性和阴性对照液对照，最好选择几种层析条件分别展开，将所得结果综合分析。因为一种对照液中可能有几种不同类型的化学成分，它们的色谱条件不尽相同，只用一种条件展开有时可能因为色谱条件选择不当而分离效果不佳或虽分离但显现不出斑点，而得不到正确的判断结果。
③采用对照药材和对照品同时对照：为了能够准确检验出制剂投料的真实性，有时只用对照品无法鉴别出来，若增加原药材的阳性对照液对照就可以克服这一不足之处。
（3）薄层板的选择和制备：薄层板有预制薄层板和自制薄层板，预制薄层板又可分为普通薄层板和高效薄层板。常用规格有10cm×10cm、10cm×15cm、20cm×10cm或20cm×20cm等。预制薄层板临用前一般应在105～110℃活化约30分钟，置干燥器中备用。聚酰胺薄层板不需要活化。高效薄层板具有分离效能高的特点，主要适用于分析较难分离的供试品。
（4）点样：用专用毛细管手动点样或配合相应的专用半自动、全自动点样器点样，接触点样时注意勿损伤薄层表面。点样浓度一般为0.1～10mg/mL；点样体积一般普通板为1～10μL，高效板为0.1～0.5μL。点样形状一般为圆点或窄细的条带状，圆点直径一般普通板≤3mm，高效板≤2mm；条带状普通板宽度一般为5～10mm，高效板为4～8mm。点间距可视斑点扩散情况以相邻点互不干扰、不影响检出为宜，一般普通板≥8mm，高效板≥5mm；点样线距底边普通板为10～15mm，高效板为8～10mm。
（5）饱和与展开：将点样后的薄层板置入加有展开剂的层析缸中，密闭，待展开剂蒸气饱和后，展开，当溶剂前沿达到规定的展距（普通板上行展开8～15cm，高效板上行展开5～8cm）时，取出薄层板，标记溶剂前沿，晾干或电吹风吹干。必要时可进行二次展开或双向展开。
（6）显色与检视：色谱斑点本身有颜色者，可直接在日光下检视；在紫外光激发下可发射荧光者，可直接置紫外光灯下观察荧光色斑；需加试剂后方能显色或发射荧光者，可将试剂用喷雾器均匀喷洒于薄层板面（或用浸渍法），再按规定直接观察或加热后观察，但需注意试剂对薄层材料的影响、加热的温度和时间；用蒸气熏蒸（如碘蒸气）显色者，可在密闭器皿中放置适当时间至斑点显色清晰；对于可见光下无色但有紫外光吸收的成分鉴别，可用荧光板展开，在紫外光灯下观察荧光淬灭形成的暗斑。
（7）结果记录与保存：除测量各斑点的 R f 值外，可用数码照相等方法尽快将显色或荧光检测后拍下的彩色照片保存，也可在扫描仪上扫描记录扫描图谱等方法保存色谱结果。
薄层色谱，是一种“敞开系统”的色谱技术，影响薄层色谱的因素较多，例如供试液的净化程度、吸附剂的性能、薄层板的质量、点样、展开剂的组成和饱和情况、展开距离、相对湿度和温度等。主要影响因素有以下几方面。
（1）样品的预处理：由于苗药制剂所含的化学成分复杂，供试液中溶出的物质较多，其中有待测成分，也有其他“杂质”，常常由于相互干扰或背景污染而难以得到满意的分离效果，甚至难以辨认。所以在许多情况下为了得到一个较为清晰的色谱图，样品提取物需经预处理，使供试液得以净化，这一步骤往往是一个重要的有时甚至是关键的步骤。制备样品供试液所用的溶剂黏度不宜太高，沸点适中；但往往希望苗药制剂各成分尽量多地提取出来，最常选用的是甲醇或乙醇，待测成分和许多其他“杂质”均可能被提取出来，因此供试液的净化就显得更为必要。
（2）展开剂的优选：展开剂是被检成分能否具有良好分离度的关键因素。展开剂的选择和优化主要考虑溶剂的极性和溶剂的选择性。前者决定被检成分斑点 R f 值处于0.2～0.8范围内，后者决定成分的分离度。一般认为，分离亲脂性较强的成分，宜用极性较小的展开剂；分离亲水性较强的成分，宜用极性较大的展开剂，即展开剂的极性应与被分离成分的极性相适应。此外，分离碱性成分，展开剂中往往加入少量碱性试剂；分离酸性成分（有机酸、酚类等），往往加入少量酸性试剂。
（3）吸附剂的活性与相对湿度的影响：日常操作时，当活化后硅胶（或氧化铝）薄层板从干燥器中取出，自开始点样到展开前，薄层板一般是暴露在实验室的大气中，其活性取决于实验室环境的相对湿度。在其他条件相同的情况下，相对湿度对许多样品色谱质量的影响是明显的。通常认为薄层色谱重现性差，在不同的相对湿度下点样和展开是其原因之一。控制展开时的相对湿度可在双槽展开箱的一侧用一定浓度的硫酸溶液，密闭放置一定时间（如15～30分钟），再加入展开剂于另一侧展开。也可将点样后的薄层板放入内有一定浓度的硫酸溶液或其他调节相对湿度的无机盐水溶液的容器中（或特制的湿度控制箱中），密闭放置一定时间后，取出，立即在箱中展开。试验结果必须有展开时的相对湿度的记录。
（4）温度的影响：温度也是影响层析行为的因素之一。较直观的影响是被分离物质的 R f 值和物质的分离度及斑点的扩散等，在温差较大的不同地点或时间，其他条件相同，展开同样的样品，所得色谱可能会有差异。因此，记录展开时的温度也是保证重现性的一个措施。
（1）比移值（ R f ）：是指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。
各斑点的比移值以0.2～0.8为宜。
（2）检出限：是指限量检查或杂质检查时，供试品溶液中被测物质能被检出的最低浓度或量。一般采用已知浓度的供试品溶液或对照标准溶液，与稀释若干倍的自身对照标准溶液在规定色谱条件下，于同一薄层板上点样、展开、检视，后者显清晰可辨斑点的浓度或量作为检出限。
（3）分离度（ R ）：鉴别时，供试品与标准物质色谱中的斑点均应清晰分离。当薄层色谱扫描法用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度的计算公式为：
式中， d 2 为相邻两峰中后一峰与原点的距离； d 1 为相邻两峰中前一峰与原点的距离； W 1 及 W 2 为相邻两峰各自的峰宽。
（4）相对标准偏差：薄层扫描含量测定时，同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于5.0％；需显色后测定的或者异板的相对标准偏差应不大于10.0％。
【例3-27】 金果榄凝胶的鉴别
组成：由金果榄、冰片制成。
鉴别：取本品10mL，加1％硫酸溶液20mL，置50～60℃水浴加热1小时，滤过，滤液用氨试液调节pH至9～11，用氯仿振摇提取3次，每次15mL，合并氯仿液，蒸干，残渣加乙醇0.5mL使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸巴马汀对照品，加乙醇制成每1mL含4mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（10∶6∶6∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
【例3-28】 泌淋胶囊的鉴别
组成：由四季红、车前草、酢浆草和石椒草制成。
鉴别：①取本品内容物1g，加丙酮20mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取四季红对照药材2g，加水30mL，煎煮30分钟，趁热用纱布滤过，滤液蒸干，残渣同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-醋酸乙酯-甲酸（30∶40∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
②取本品内容物1g，加石油醚（30～60℃）20mL，超声处理20分钟，滤过，弃去滤液，药渣挥干，加甲醇20mL，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取石椒草对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照（2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-醋酸乙酯-甲酸（50∶100∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
【例3-29】 双羊喉痹通颗粒的薄层色谱鉴别
组成：由野烟叶、羊耳菊、矮地茶、羊奶奶叶等7味药制成。
鉴别：①取本品10g，研细，加乙醚30mL，振摇10分钟，放置30分钟，滤过，滤液挥至1mL，作为供试品溶液。另取薄荷对照药材1g、荆芥对照药材0.8g，分别置圆底烧瓶中，加水150mL，连接挥发油测定器，自测定器上端加水使充满刻度，再加石油醚（60～90℃）1mL，连接回流冷凝管，加热回流2小时，放冷，分取石油醚液，作为对照药材溶液。再取薄荷脑对照品，加乙醚制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0502）试验，吸取上述四种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯（20∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛的50％硫酸乙醇液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，分别在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
②取本品5g，研细，加甲醇40mL，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至2mL，作为供试品溶液。另取羊耳菊对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲醇-浓氨试液（20∶1∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
气相色谱法（GC）在制剂的鉴别中也较为常用。在同一色谱条件下，将供试品溶液和对照品溶液分别注入气相色谱仪，对两者的气相色谱图进行比对，供试品应呈现与对照品保留时间相同的色谱峰，从而对样品做出鉴别。这种方法可称为保留时间比较法。所采用的对照品可以为该味苗药的有效成分，也可以为原药材的制备液。
气相色谱法具有高分辨率、高灵敏度、快速、准确等特点，尤其适合分析制剂中的挥发性成分，如麝香酮、薄荷醇、冰片、水杨酸甲酯等。一般情况下该法不适合分析蒸气压较低的即挥发性较小的成分，因此该法在实际工作中具有一定的局限性。
【例3-30】 金喉健喷雾剂的鉴别
组成：由艾纳香油、大果木姜子油、薄荷脑和甘草酸单铵盐制成。
鉴别：取装量项下的本品，混匀，作为供试品溶液。另取龙脑及薄荷脑对照品适量，分别加乙醇制成每1mL含2.0mg及2.5mg的溶液，作为对照品溶液。照气相色谱法（2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0521）试验，以聚乙二醇（PEG-20M）为固定液；涂布浓度为10％；柱温为135℃。理论板数以龙脑峰计算应不低于2000，分别吸取对照品溶液和供试品溶液各2～5μL，注入气相色谱仪。供试品溶液色谱中应呈现与对照品溶液保留时间相同的色谱峰。
高效液相色谱法（HPLC）鉴别与气相色谱法有很多相似之处，一般当TLC无法鉴别时才考虑采用HPLC法鉴别。高效液相色谱法采用保留时间比较法，即在相同的色谱条件下，比较样品和对照品色谱峰的保留时间是否一致，从而对被检成分（药味）的存在情况做出判断。对于复杂未知成分，也可以加入对照品，观察被测峰是否增高，以便初步做定性结论。为慎重起见，至少应选用两种不同的固定相和分离条件与对照品比较保留时间。对于复杂组分尚可采用联用技术，如本法与质谱联用，先分离后再做定性鉴别。
高效液相色谱法不受样品挥发性的限制，流动相、固定相可选择的种类多，检测手段多样，所以应用范围比气相色谱法广泛，不过，目前在苗药制剂的质量标准中，一般很少单独使用本法做鉴别，而是多与含量测定结合。但应用本法进行指纹图谱、特征图谱鉴别正在逐渐增多。
【例3-31】 薏苡仁的鉴别
供试品溶液同〔含量测定〕项下的供试品溶液［取本品粉末（过三号筛）约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相50mL，称定重量，浸泡2小时，超声处理（功率300W，频率50kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用流动相补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得］。另取薏苡仁油对照提取物、甘油三油酸酯对照品，加〔含量测定〕项下的流动相分别制成每1mL含1mg、0.14mg的溶液，作为对照提取物、对照品溶液。照高效液相色谱法（2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0512）试验，采用〔含量测定〕项下色谱条件（以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-二氯甲烷（65∶35）为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按甘油三油酸酯峰计算应不低于5000），分别吸取供试品溶液、对照提取物和对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪。供试品色谱图中，应呈现与对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰；并呈现与对照提取物色谱峰保留时间一致的7个主要色谱峰。
【例3-32】 玉屏风口服液的鉴别
组成：由黄芪、防风、白术（炒）制成。
鉴别：取本品1mL，加甲醇至10mL，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液。另取5- O -甲基维斯阿米醇苷对照品，加甲醇制成每1mL含60μg的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法（2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0512）试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（35∶65）为流动相；检测波长为254nm。分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪。供试品色谱中，应呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰。
液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）可充分发挥液相色谱的高效分离特点和质谱高灵敏度、高选择性的定性分析特点，获取复杂混合物所含化学成分的轮廓和混合物中各单一成分的结构信息。大多数液-质联用仪配有二极管阵列检测器（DAD），DAD检测器对应的色谱图只显示具有紫外-可见光吸收特征的苗药化学成分的轮廓，而质谱检测器对应的色谱图显示可离子化的苗药化学成分的轮廓。利用质谱检测器提供的色谱峰分子质量和结构的信息进行定性分析，可获得比仅利用保留时间或仅利用光谱相似度进行定性分析更多的、更可靠的信息，不仅可用于已知成分的定性分析，还可提供未知成分的结构信息。LC-MS具有高效、快速和灵敏度高等特点，是定性、定量分析苗药复杂体系的有效方法，特别适于强极性、热不稳定、低挥发性和相对分子质量高的有机化合物。例如阿胶、龟甲胶、鹿角胶的鉴别均采用LC-MS法。
气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）利用计算机自动检索谱库核对可获得的定性、定量信息，GC-MS分析的信号参数主要有色谱保留值、总离子流色谱图（TIC）、质量色谱图、选择离子监测图（又称质量碎片图）和质谱图等。GC-MS的最大优点是样品的分离、定性鉴定和定量分析一次完成，适合具有挥发性成分或可衍生化为挥发性成分苗药的鉴别，如应用GC-MS联用技术鉴别感冒清热颗粒中的紫苏叶、荆芥穗、薄荷等。