苗药分析的提取方法众多,按提取原理可分为溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法等。
选用适当的溶剂将苗药的被测成分溶出的方法称为溶剂提取法。溶剂的选择应遵循“相似相溶”原则,通过对被测成分的结构分析选择合适的溶剂,所选溶剂要求对被测成分溶解度大,而对杂质溶解度小;不能与被测成分发生化学反应;溶剂价廉,使用安全。如苷的测定可选用极性较强的溶剂,而苷元的测定则选用极性较小的溶剂;游离生物碱大多为亲脂性化合物,多用极性小的溶剂,而游离生物碱与酸结合成盐后能离子化,具有较强的亲水性,应选用极性较强的溶剂。
常用的提取溶剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、乙醚等。
溶剂提取法有浸渍法、回流提取法、连续回流提取法、超声辅助提取法、加速溶剂萃取法、微波辅助萃取法。
(1)浸渍法:浸渍法是将样品置于溶媒中浸泡一段时间分离出浸渍液。分为冷浸法(室温)和温浸法(40~60℃),常用溶剂有甲醇、适当浓度的乙醇、二氯甲烷等。适用于固体样品的提取,方法简便。
①冷浸法:是将溶剂加入样品粉末中,室温下(15~25℃)放置一定时间,组分因扩散而从样品粉末中浸出的提取方法。样品可以是药材提取物,也可以是含有原生药的粉末,整个浸提过程是溶媒溶解、分散其有效成分而变成浸出液的过程,影响浸提效果的因素有溶媒种类与性质、样品的性质与颗粒直径、溶媒用量、浸提时间等。
②温浸法:与冷浸法基本相同,但浸渍温度较高,一般在40~60℃溶媒中浸渍,浸渍时间短,却能浸出较多有效成分。由于温度较高,浸出液冷却后放置贮存时常析出沉淀,为保证质量,需滤去沉淀后再浓缩。
浸渍法的优点是操作方便,简单易行,适用于有效成分遇热易被破坏、挥发性或含淀粉、果胶、黏液质较多的苗药的提取。其缺点是提取时间长,提出效率不高,用水作溶剂提取时,水提液易发霉变质,必要时需加防腐剂。
(2)回流提取法:回流提取法是将样品粉末置烧瓶中,加入一定量的有机溶剂,在水浴上加热进行回流提取,其余操作方法同冷浸法。在加热的条件下组分溶解度增大,溶出速率加快,有利于提取。回流提取法主要用于固体样品的提取。提取溶剂沸点不宜太高,每次提取时间为0.5~2小时,直至提取完全。提取效率高于冷浸法,且可缩短提取时间,但提取杂质较多。该法提取速度快,但操作繁琐,且对热不稳定或具有挥发性的成分不宜使用。
(3)连续回流提取法:连续回流提取法通常是采用索氏提取器连续进行提取的方法。将样品置索氏提取器中,选用低沸点溶剂,如乙醚、甲醇等进行反复提取,一般提取数小时方可完全。提取完全后取下虹吸回流管,无须过滤,就可回收溶剂,再用适宜溶剂溶解,定容,进行测定。本法提取效率高,所需溶剂少,提取杂质少,操作简便。但是受热易分解的成分不宜使用。
(4)超声辅助提取法:超声辅助提取法是将样品置于适当的容器中,加入提取溶剂,放入超声振荡器中提取的方法。在超声波的助溶作用下,超声辅助提取法较冷浸法速度快,一般10~30分钟内即可完成,最多不超过1小时。由于提取过程中溶剂会有一定量的损失,所以用作含量测定时,应于超声振荡前先称定重量,提取完毕后,放冷再称重,并补足减失的重量,滤过后,取滤液备用。
但也应注意,超声波会使大分子化合物发生降解和解聚作用,或者形成更复杂的化合物,也会促进一些氧化和还原过程,所以在用超声辅助提取时,也应对超声波频率、提取时间、提取溶媒等条件进行考察,以提高提取效率。当超声辅助提取用于药材粉末的提取时,由于组分是由细胞内逐步扩散出来的,速度较慢,加溶剂后宜先放置一段时间,再超声振荡提取。
超声辅助提取法的特点是提取时间短,提取效率高,操作简便,无须加热。适用于固体样品的提取,是目前较常用的一种提取方法。
(5)加速溶剂萃取法:加速溶剂萃取法(accelerated solvent extraction,ASE)又称压力溶剂萃取法,是在较高的温度(50~200℃)和压力(10.3~20.6MPa)下,用溶剂萃取固体或半固体样品的前处理方法。ASE是将样品放在密封容器中,通过升高压力提高溶剂的沸点,使萃取程序能够在温度高于溶剂沸点而溶剂保持液体状态下进行,进而提高萃取效率。与传统方法相比,ASE的突出优点是有机溶剂用量少(1g样品仅需1.5mL溶剂)、快速(一般为15分钟)和回收率高。ASE广泛用于环境、药物、食品等样品的前处理。
(6)微波辅助萃取法:微波辅助萃取法(microwave assisted extraction,MAE)又称微波萃取,是微波和传统的溶剂提取法相结合后形成的一种提取方法。MAE是将样品置于微波可透过的容器中,用微波加热进行萃取的一种方法。微波是频率在300~30000MHz、波长在1mm~1m之间的电磁波。一般认为,微波萃取的机制是微波辐射过程中产生的电磁场加快目标成分向萃取溶剂中扩散的速率,采用极性溶剂时,在微波电磁场中,微波辐射使极性分子高速旋转至激发态,当返回基态时释放的能量将传递给物料和被萃取分子,加速其热运动,缩短分子扩散至萃取溶剂的时间,从而提高萃取效率。微波萃取和传统的索氏等萃取方法相比,具有以下特点:①萃取时间短,效率高;②溶剂用量少,污染小;③可根据吸收微波能力的大小选择不同的萃取溶剂,控制样品与溶剂间的热交换;④可实现多个样品的同时萃取。但微波萃取仅适用于热稳定物质的提取,对于热敏性物质,可使其变性或失活。
水蒸气蒸馏法是指将含有挥发性成分的样品与水共蒸馏,使挥发性成分随水蒸气一并馏出,冷凝后分取挥发性成分的提取方法。该法适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏、在水中稳定且难溶或不溶于水的药材成分的提取。此类成分的沸点多在100℃以上,与水不相混溶或仅微溶,并在100℃左右有一定的蒸气压。当与水在一起加热时,其蒸气压和水的蒸气压总和为一个大气压时,液体开始沸腾,水蒸气将挥发性物质一并带出。例如挥发油,一些小分子生物碱如麻黄碱、烟碱、槟榔碱,以及某些小分子酚类化合物,如丹皮酚等可以采用本法提取。有些挥发性成分在水中的溶解度稍大些,常将蒸馏液重新蒸馏,在最先蒸馏出的部分分出挥发油层,或在蒸馏液水层经盐析并用低沸点溶剂将成分提取出来。
固体物质加热直接变成气体,遇冷又凝结为固体的现象为升华法。利用某些成分具有升华性质的特点,使其与其他成分分离,再进行测定,如游离羟基蒽醌类化合物、咖啡因、斑蝥素等成分可用升华法提取。但是,在加热过程中往往伴有热分解现象,产率较低。
此外,还有超临界流体萃取(supercritical fluid extraction,SFE)、加压液体萃取(pressurized liquid extraction,PLE)、亚临界水萃取(subcritical water extraction,SWE)、半仿生提取、酶法提取、高压逆流提取、亚临界水提取等提取方法也有应用。