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起初，孟德尔尝试了几种植物进行实验，但都遭遇了失败。这些植物要么性状不够明显，难以准确观察和区分；要么在杂交过程中容易受到外界因素的干扰，导致实验结果不稳定。这让孟德尔意识到，实验材料的选择必须满足严格的条件。
他列出了一系列标准：植物的性状要明显、稳定，在杂交时不受外界影响，并且易于栽培和管理。按照这些标准，孟德尔开始对20多种植物进行逐一筛选。
在筛选过程中，孟德尔对每一种植物都进行了细致的观察和研究。他观察植物的生长周期、花朵结构、授粉方式以及各种性状的表现。经过长时间的比较和分析，他发现豌豆具有许多其他植物所不具备的优势。
豌豆是自花传粉且闭花授粉的植物。在自然状态下，豌豆花在未开放时就已经完成了授粉，这避免了外来花粉的干扰，保证了豌豆在自然状态下的纯种性。这一特性使得孟德尔在实验中能够准确控制亲本的遗传信息，从而更清晰地观察和分析后代的性状表现。
此外，豌豆具有多对稳定、易于区分的性状。例如，豌豆的茎有高茎和矮茎之分，高茎豌豆可以长到1.5—2米，而矮茎豌豆则只有0.3—0.5米；豌豆的种子有圆粒和皱粒之分，圆粒豌豆饱满光滑，皱粒豌豆则表面有明显的褶皱；豌豆的花有紫花和白花之分，紫花鲜艳夺目，白花纯洁素雅。这些性状差异明显，在实验过程中很容易进行观察和记录。
确定了豌豆作为实验材料后，孟德尔开始精心筛选具有明显相对性状的豌豆植株。他在修道院的花园里仔细观察每一株豌豆，挑选出那些性状表现典型、稳定的植株作为亲本。
为了确保亲本的纯度，孟德尔对这些豌豆植株进行了多代自交。他让豌豆植株在自然状态下自花授粉，连续种植几代，观察后代的性状表现。如果后代始终保持亲本的性状，没有出现性状分离的现象，就说明这株豌豆是纯种。通过这种方法，孟德尔筛选出了纯种的高茎豌豆、矮茎豌豆、圆粒豌豆、皱粒豌豆、紫花豌豆和白花豌豆等。
孟德尔将这些具有明显相对性状的纯种豌豆植株分别种植在不同的区域，作为实验的参照物。他给每一株豌豆都做了标记，详细记录它们的性状特征和种植位置。这些参照物就像是一把把精准的尺子，为孟德尔后续的实验提供了准确的对比标准。
在完成了豌豆的选材和筛选工作后，孟德尔还对实验环境进行了精心的准备。他清理了花园里的杂草和杂物，确保豌豆植株有良好的生长环境。他还对土壤进行了改良，施加了适量的肥料，为豌豆的生长提供充足的养分。
孟德尔在完成了豌豆的选材和实验准备工作后，正式开启了他的豌豆杂交实验，其中将纯种高茎豌豆和纯种矮茎豌豆进行杂交的实验，成为了他发现分离定律的关键起点。
孟德尔深知，要进行准确的杂交实验，人工授粉是必不可少的环节。他选择在豌豆花未成熟之前进行操作。对于作为母本的豌豆花，他小心翼翼地用镊子除去雄蕊，防止自花授粉。这个过程需要极其精细的操作，稍有不慎就可能导致实验失败。除去雄蕊后，他用一个小纸袋将花朵套住，避免外来花粉的干扰。
当父本的豌豆花成熟后，孟德尔用毛笔轻轻地蘸取花粉，然后将花粉涂抹在母本花朵的柱头上。完成授粉后，他再次将纸袋套上，并做好标记，记录下亲本的性状和授粉时间。
经过这样的人工授粉操作，孟德尔成功地让纯种高茎豌豆和纯种矮茎豌豆进行了杂交。不久之后，母本豌豆植株上结出了种子。孟德尔将这些种子小心地收集起来，等待着它们发芽生长。
当这些种子播种下去后，长出的就是子一代（F1）植株。让孟德尔惊讶的是，子一代的豌豆植株全部都是高茎的，没有出现矮茎的植株。按照当时流行的“混合遗传”学说，高茎豌豆和矮茎豌豆杂交，后代应该是介于两者之间的中等高度，但实验结果并非如此。
孟德尔并没有急于下结论，他让子一代的高茎豌豆植株进行自花授粉。在这个过程中，他依然仔细地观察和记录每一个细节。子一代植株上再次结出了种子，孟德尔将这些种子播种后，得到了子二代（F2）植株。
子二代的实验结果更加令人意外。在子二代的豌豆植株中，不仅有高茎的，还出现了矮茎的。经过统计，高茎豌豆和矮茎豌豆的数量比例大约为3:1。这个稳定的比例关系引起了孟德尔的高度关注。
面对这样的实验结果，孟德尔开始思考其中的原因。他提出了一个大胆的假说：生物的性状是由遗传因子决定的。每个植株都携带着两个决定其性状的遗传因子，一个来自父本，一个来自母本。
在纯种高茎豌豆中，这两个遗传因子都是决定高茎的；在纯种矮茎豌豆中，这两个遗传因子都是决定矮茎的。而在子一代中，虽然植株表现为高茎，但它同时携带了一个决定高茎的遗传因子和一个决定矮茎的遗传因子。其中，决定高茎的遗传因子是显性的，决定矮茎的遗传因子是隐性的，所以子一代只表现出高茎的性状。
当子一代进行自花授粉时，这两个遗传因子会彼此分离，独立地遗传给后代。在子二代中，就会出现三种遗传因子的组合情况：两个都是决定高茎的遗传因子、一个决定高茎和一个决定矮茎的遗传因子、两个都是决定矮茎的遗传因子。前两种组合表现为高茎，后一种组合表现为矮茎，所以高茎和矮茎的比例大约为3:1。
为了验证这个假说，孟德尔设计了测交实验。他让子一代的高茎豌豆与纯种矮茎豌豆进行杂交。按照他的假说，如果子一代确实携带了一个决定高茎和一个决定矮茎的遗传因子，那么测交后代应该会出现高茎和矮茎两种性状，并且比例为1:1。
通过对纯种高茎豌豆和纯种矮茎豌豆杂交实验以及测交实验的研究，孟德尔总结出了基因分离定律：决定同一性状的成对遗传因子彼此分离，独立地遗传给后代。
在成功发现基因分离定律后，孟德尔并未满足于此，他的目光投向了更为复杂的遗传现象。他开始思考，如果同时研究两对相对性状，它们在遗传过程中会呈现出怎样的规律呢？于是，孟德尔选取了具有两对相对性状差异的纯合体豌豆进行杂交实验，其中最典型的就是黄色圆粒豌豆和绿色皱粒豌豆。
孟德尔精心挑选了纯种的黄色圆粒豌豆和纯种的绿色皱粒豌豆作为亲本。黄色圆粒豌豆的种子饱满圆润，颜色金黄鲜亮；绿色皱粒豌豆的种子则表面皱缩，颜色呈深绿色。他像之前进行单对性状杂交实验一样，熟练地进行人工授粉操作。在花朵未成熟时，他小心地去除母本花朵的雄蕊，套上纸袋防止外来花粉干扰，待父本花朵成熟后，用毛笔蘸取花粉涂抹在母本柱头上，再次套好纸袋并做好标记。
经过授粉后，母本豌豆植株上结出了种子。孟德尔将这些种子收集起来播种，得到了子一代（F1）植株。让他惊喜的是，子一代的豌豆种子全部都是黄色圆粒的。这表明在这两对相对性状中，黄色对绿色是显性性状，圆粒对皱粒是显性性状。
接着，孟德尔让子一代的黄色圆粒豌豆进行自花授粉。在等待子二代（F2）种子成熟的过程中，他满怀期待又充满好奇。当子二代的种子收获后，孟德尔开始仔细观察和统计它们的性状表现。
这一次的实验结果比单对性状杂交实验更加复杂多样。子二代中不仅出现了亲本的性状组合，即黄色圆粒和绿色皱粒，还出现了新的性状组合，黄色皱粒和绿色圆粒。
面对这样的结果，孟德尔陷入了深深的思考。他回想起之前发现的基因分离定律，开始尝试用已有的知识来解释这个新的现象。他认为，在形成生殖细胞时，决定不同性状的遗传因子是相互独立的，它们可以自由组合。
具体来说，对于黄色圆粒和绿色皱粒这两对相对性状，控制黄色和绿色的遗传因子以及控制圆粒和皱粒的遗传因子在形成配子时会彼此分离，然后自由组合。在子一代中，由于黄色和圆粒是显性性状，所以只表现出黄色圆粒的性状。但在子一代形成配子时，遗传因子会重新组合，从而在子二代中出现了四种不同的性状组合。
为了验证这个假说，孟德尔设计了测交实验。他让子一代的黄色圆粒豌豆与双隐性的绿色皱粒豌豆进行杂交。按照他的假说，如果子一代确实产生了四种不同类型的配子，并且这些配子能够自由组合，那么测交后代应该会出现四种性状，且比例接近1:1:1:1。
孟德尔再次投入到紧张的实验操作中。他熟练地进行人工授粉，将子一代黄色圆粒豌豆的花粉传授给绿色皱粒豌豆的柱头。经过一段时间的等待，测交后代的种子成熟了。孟德尔认真地统计了测交后代的性状表现，结果正如他所预期的那样，黄色圆粒、黄色皱粒、绿色圆粒、绿色皱粒的数量比例接近1:1:1:1。
这个测交实验的成功，有力地验证了孟德尔提出的自由组合定律假说。通过对具有两对相对性状差异的纯合体豌豆杂交实验以及测交实验的研究，孟德尔总结出了基因自由组合定律：决定不同遗传性状的遗传因子间可以自由组合。