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“周氏兄弟”失和后，鲁迅大病一场，前后达一个半月之久。学者袁良骏认为：“它促成了鲁迅的早逝。失和对鲁迅的精神打击是巨大的，这是鲁迅的一大块心病，不仅导致了他迁居后的一场大病，而且影响其终生。鲁迅最终死于肺病，而肺病最可怕的就是累和气。和周扬等‘四条汉子’生气是外在的，兄弟失和才是更要害、更根本的。”
不难想象，每当想起自己全心全意最为关爱的弟弟反戈一击恩将仇报，鲁迅的心中该有多痛多苦，这种痛苦是锥心裂肺难以释怀的。鲁迅写了《颓败线的颤动》等文章，谴责忘恩负义的行为；他写了《伤逝》等文章，感叹亲密感情的逝去……但失和对鲁迅也有利好的一面，即鲁迅开始重新选择生活，毅然决然地和许广平私奔，经济上也更加宽裕自主。
失和对周作人有什么直接影响呢？在1923年7月25日所写的《自己的园地·旧序》里，周作人重复了7月18日给鲁迅的字条里所说的“过去的蔷薇色的梦都是虚幻”，表达了自己对美好人生的幻灭感。他要“订正我的思想，重新入新的生活”，不再追求“蔷薇色”的理想，而从此选择了“在不完全的现世享乐一点美与和谐”的享乐主义人生道路。
“人生不相见，动如参与商。”反目后，“周氏兄弟”未再单独见过面，也未有直接通信。起初，因为思想、观点的一致，两人还有过并肩战斗。比如周作人创办《语丝》并实际担任主编，鲁迅则在上面经常发稿成为《语丝》实际“精神领袖”。在女师大学潮中，两人也都站在进步学生一边，与章士钊、陈源战个不休。周作人先是在鲁迅起草的宣言中签了名，后又发表了一些批评章士钊、杨荫榆的文章，并和鲁迅一起为被驱赶出校的学生义务授课。周作人得知鲁迅上了北洋政府的“黑名单”，还曾托人通知鲁迅。鲁迅大战陈源时，周作人也曾上阵助拳，攻击陈源及“现代评论派”。后来，在鲁迅和高长虹的论战中，周作人又出阵挺兄，用“晋人”“吃醋”“疑威将军”等暗箭影射高长虹。鲁迅在和创造社、太阳社的“革命小将”车轮战时，周作人也曾发文讽刺“革命文学”的“取巧”和“投机”。周作人还翻译过古罗马一首题为《伤逝》的诗歌，而鲁迅随后也创作了小说《伤逝》，两人通过创作“暗送秋波”。
但随着鲁迅和许广平结合，随着形势越来越严峻，周作人和鲁迅终于越走越远。两人成了最熟悉的陌生人，甚至不知不觉鲁迅成了周作人的假想敌。
首先，周作人在《中年》《志摩纪念》《周作人书信·序言》《论妒妇》《责任》《蒿庵闲话》等文章中多次挖苦鲁迅多妻、纳妾、色情。如他在《中年》里写道：“譬如普通男女私情我们可以不管，但如见一个社会栋梁高谈女权或社会改革，却照例纳妾等等，那有如无产首领浸在高贵的温泉里命令大众冲锋，未免可笑，觉得这动物未免有点变质了。”这话很明显是在讽刺鲁迅“纳妾”。
鲁迅和许广平的情书集《两地书》出版后，周作人又在《周作人书信·序言》中写道：“这原不是情书，不会有什么好看的。这又不是宣言书，别无什么新鲜话可讲。反正只是几封给朋友的信……别无好处，总写得比较地诚实点，希望少点丑态。兼好法师尝说人们活过了四十岁，便将忘记自己的老丑，想在人群中胡混，私欲益深，人情物理都不复了解。行年五十，不免为兼好所诃，只是深愿尚不忘记老丑，讲不以老丑卖钱耳。”此话是嘲笑鲁迅的《两地书》“以老丑卖钱”。1936年10月18日，鲁迅去世的前一天，周作人还在文章《家之上下四旁》中写道：“儿子阔了有名了，往往在书桌上留下一部《百孝图说》，给老人家消遣，自己率领宠妾到洋场官场里为国民谋幸福去了……”这话自然也是在嘲讽鲁迅。
一贯主张恋爱自由和健康性道德的周作人为何抓住鲁迅的“小辫子”不放？这可能缘于周作人固执地以为鲁迅真的调戏了他太太，“有色情之心乃老流氓也”，故而一再藐视嘲讽鲁迅，动辄借机泄愤报仇。
国民党“清党”后，原本都持自由、人道立场的周氏兄弟政治、思想上发生了巨大分野。鲁迅逐渐“左倾”，顽强不屈地投入一场接一场的战斗。周作人则被鲜血吓得目瞪口呆而退回自己的“苦雨斋”埋头喝茶，并且对鲁迅的“向左转”越来越看不惯。
1931年12月13日，周作人在《志摩纪念》中写道：“知识阶级的人挑着一副担子，前面是一筐子马克思，后面一口袋尼采，也是数见不鲜的事。”1935年2月，周作人又在《阿Q的旧帐》中写道：“不久有左翼作家新兴起来了，对于阿Q开始攻击，以为这是嘲笑中国农民的，把正传作者骂得个‘该死十三元’……不久听说《阿Q正传》的作家也转变了。”这两句话还只是捎带讥讽鲁迅，最为表达周作人对鲁迅不满的是他写于1936年7月31日的《老人的胡闹》一文。这文章写道：“老人的胡闹并不一定是在守旧，实在却是在维新。盖老不安分，重在投机趋时，不管所拥戴的是新旧左右，若只因其新兴有势力而拥戴之，则等是趋时，一样的可笑。如三上（日本贵族院议员三上参次）弃自由主义而投入法西斯的潮流，即其一例，以思想论虽似转旧，其行为则是趋新也。此次性上演说因为侮辱中国，大家遂加留意，其实此类事世间多有，即我国的老人们亦宜以此为鉴，随时自加检点者也。”这话很明显是在骂鲁迅“胡闹”“为老不尊”“不检点”。此时正病重在床的鲁迅如果看到这话，肯定会心痛不已而加重病情。
除了在爱情婚姻、思想政治方面屡屡攻击外，周作人在其他方面也是逮着机会就对鲁迅旁敲侧击明枪暗箭。如在谈到“青年必读书”问题时，周作人对鲍耀明说：“‘必读书’的鲁迅答案，实乃他的‘高调’——不必读书——这说得不好听一点，他好立异鸣高，故意的与别人拗一调，他另外有给朋友的儿子开的书目，却是十分简要的。”
总之，想做“绅士”的周作人对鲁迅满腹怨恨，总是借机攻击“睚眦必报”。鲁迅去世后尸骨未寒，周作人还余恨未了地影射道：“但是，说老当益壮，已经到了相当的年纪，却从新纳妾成家，固然是不成话，就是跟着青年跑，说时髦话，也可以不必。”
而向来“以直报怨”的鲁迅对周作人则始终“以德报怨”，还把他当成亲兄弟，时刻关注、关心着周作人，随时注意和搜购周作人的作品。“据北京鲁迅博物馆关于鲁迅藏新文学著作目录统计，鲁迅藏周作人著译文集计有11种，从1925年出版的《陀螺》至1936年出版的《苦竹杂记》，均藏购于1923年兄弟失和以后”。
鲁迅对周作人最大的一个“差评”仅是“昏”字，鲁迅几次对三弟周建人摇头叹气无可奈何地说：“启孟真昏！”
1925年，鲁迅在发表的小说《弟兄》里回忆了自己当年帮助周作人看病的往事，表示了“鹡鸰在原”的意思。鹡鸰是一种生活在水边的小鸟，当它困处高原时，就会鸣叫寻找同类。《诗经》有云：“脊令在原，兄弟急难”，比喻兄弟在危难中要互相救助。鲁迅通过这篇小说向周作人表示如有急难，他还愿像当年周作人患病时那样无私救助。可周作人对此置若罔闻，毫不领情。1927年张作霖军政府绞死李大钊后，周作人一边悲愤地写下《偶感》捍卫李大钊名誉，一边把李大钊的大儿子李葆华藏在八道湾，后将其转送日本留学。对周作人的这种勇敢精神，鲁迅在写给周建人的信里大加赞赏。
鲁迅定居上海后，也时常惦念担忧周作人，常对周建人说：“八道湾只有一个中国人了。”当《语丝》杂志被禁时，鲁迅在致章廷谦的信中说：“他之在北，自不如来南之安全，但我对于此事，殊不敢赞一辞，因我觉八道湾之天威莫测，正不下于张作霖，倘一搭嘴，也许罪戾反而极重，好在他自有他之好友，当能相助耳。”
日军侵华加快脚步后，鲁迅还曾给章廷谦写信，请他劝说周作人南下。
1934年，周作人发表《五十自寿诗》，其中写道：“前世出家今在家，不将袍子换袈裟。街头终日听谈鬼，窗下通年学画蛇。老去无端玩骨董，闲来随分种胡麻。旁人若问其中意，且到寒斋吃苦茶。半是儒家半释家，光头更不著袈裟。中年意趣窗前草，外道生涯洞里蛇。徒羡低头咬大蒜，未妨拍桌拾芝麻。谈狐说鬼寻常事，只欠工夫吃讲茶。”诗歌发表后引发轰动，蔡元培、胡适、林语堂、钱玄同、郑振铎、刘半农等人纷纷步韵和诗。胡风、廖沫沙等左翼青年则对周作人的消极思想大加鞭挞，如廖沫沙和诗讽刺道：“先生何事爱僧家，把笔提诗韵押裟。不赶热场孤似鹤，自甘凉血懒如蛇。选将笑话供人笑，怕惹麻烦爱肉麻。误尽苍生欲谁责？清谈娓娓一杯茶。”而鲁迅则在写给曹聚仁的信件中公正地评说：“周作人自寿诗，诚有讽世之意，然此种微辞，已为今之青年所不憭，群公相和，则多近肉麻，于是火上添油，遽成众矢之的。”
对周作人的才华，鲁迅也继续充分认可。有一次，周作人的一部译稿交给商务印书馆出版，鲁迅对周建人说：“莫非启孟的译稿，编辑还用得着校吗？”
鲁迅还对斯诺夫人说过，在现代散文史上，周作人似是第一人
。据周建人回忆，鲁迅在病危之际，还捧读周作人著作。鲁迅逝世后，周建人写了一封信，把鲁迅临终前对周作人的看法统统告诉了周作人：“有一天说看到一日本记者（？）登一篇他的谈话，内有‘我的兄弟是猪’一语，其实并没有说这话，不知记者如何记错的云云。又说到关于救国宣言这一类的事情，谓连钱玄同、顾颉刚一班人都具名，而找不到你的名字，他的意见，以为遇到此等重大题目时，亦不可过于退后云云。有一回说及你曾送×××之子赴日之事，他谓此时别人并不肯管，而你却偃护他，可见是有同情的，但有些作者，批评过于苛刻，责难过甚，反使人陷于消极，他亦极不赞成此种过甚的责难云。又谓你的意见，比之于俞平伯等甚高明（他好像又引你讲文天祥的一段文章为例），有许多地方，革命青年也大可采用，有些人把他一笔抹煞，也是不应该的云云。但对于你前次趁（赴）日时有一次对日本作家关于他的谈话则不以为然。总起来说，他离开北平之后，他对于你并没有什么坏的批评，偶然想起，便说明几句。”
在听到鲁迅逝世的消息后，周作人未去上海参加追悼会，而是在北大法学院礼堂参加了纪念会，并致辞。他还接受了《大晚报》记者的采访，对记者说：“关于家兄最近在上海的情形，我是不大清楚的，因为我们平常没有事，是很少通信的。虽然他在上海患着肺病，可是前些天，他曾来过一封信，说是现在已经好了，大家便都放下心去。不料今天早晨接到舍弟建人的电报，才知道树人已经逝世。他这肺病，本来在十年前，就已经隐伏着了，医生劝他少生气，多静养，可是他的个性偏偏很强，往往因为一点小事，就和人家冲突起来，动不动就生气，静养更是没有那回事；所以病就一天一天加重起来，不料到了今天，已经不能挽救他的生命。说到他的思想方面，最起初可以说他受尼采的影响很深，就是树立个人主义，希望超人的实现。可是最近又有点转到虚无主义上去了，因此，他对一切事，仿佛都很悲观，譬如我们看他的《阿Q正传》，里面对于各种人物的描写，固是深刻极了，可是对于中国人的前途，却看得一点希望都没有。实在说起来，他在观察事物上，是非常透彻的，所以描写起来也就格外深刻。在文学方面，他对于旧的东西，很用过一番工夫，例如：古代各种碎文的搜集，古代小说的考证等，都做得相当可观。可惜，后来没有出版，恐怕那些材料，现在也都散失了，有人批评他说：他的长处是在整理这一方面，我以为这话是不错的。他的个性不但是很强，而且多疑，旁人说一句话，他总要想一想这话对于他是不是有利的地方。这次他在上海住的地方也很秘密，除去舍弟建人和内山书店的人知道以外，其余的人都很难找到。家母几次让他到北平来，但他总不肯，他认为上海的环境是很适宜的，不愿意再到旁的地方去。”
鲁迅病逝第二天，周作人有一堂《六朝散文》的课。他没有请假，而是挟着一本《颜氏家训》继续走进教室。第一节课的下课铃响后，周作人挟起书脸色难看地说：“对不起，下一堂课我不讲了，我要到鲁迅的老太太那里去。”可见，兄弟之间即使仇大于山，但毕竟血浓于水，周作人对鲁迅的逝世还是有些哀痛。
随后，周作人写了《关于鲁迅》《关于鲁迅书后》《关于鲁迅之二》等文章，回忆了鲁迅生前一些人们不太知晓的人生经历及创作情形。周作人对鲁迅也有“辩证”的评价，如他在《关于鲁迅》中肯定鲁迅“向来勤苦做事，为他人所不及……”“但求自由的想或写，不要学者文人的名”，同时也批评鲁迅“在书本里得来的知识上面，又加上亲自从社会里得来的经验，结果便造成一种只有苦痛与黑暗的人生观”，以及作品中“到处是愚与恶，而愚与恶又复加厉害到可笑的程度”。