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可如此亲密无间的“周氏兄弟”突然失和，成为20世纪中国文坛最大的憾事之一，也是最大的疑案之一。
1923年7月14日，鲁迅在当天日记中写道：“是夜始改在自室吃饭，自具一肴，此可记也。”
五天后，周作人托人送给鲁迅一封信，信中写道：“鲁迅先生：我昨天才知道，——但过去的事不必再说了。我不是基督徒，却幸而尚能担受得起，也不想责谁，——大家都是可怜的人间。我以前的蔷薇的梦原来都是虚幻，现在所见的或者才是真的人生。我想订正我的思想，重新入新的生活。以后请不要再到后边院子里来，没有别的话。愿你安心，自重。七月十八日，作人。”
鲁迅看完信后，想请周作人来问个明白，但周作人没来。等了一周，周作人还是“不至”，鲁迅准备搬家。鲁迅日记中记载，7月26日，“上午往砖塔胡同看屋。下午收拾书籍入箱”；7月29日，“终日收书册入箱，夜毕”；8月2日，“下午携妇迁居砖塔胡同六十一号”。事情并没有就这样轻易结束，鲁迅1924年6月11日的日记记载：“下午往八道湾宅取书及什器，比进西厢，启孟及其妻突出骂詈殴打，又以电话招重久及张凤举、徐耀辰来，其妻向之述我罪状，多秽语，凡捏造未圆处，则启孟救正之，然终取书、器而出。”
从此，鲁迅与周作人决裂，老死不相往来，史称“周氏兄弟”失和。
“周氏兄弟”为什么失和？失和后，两人都未公开透露具体原因。外人将其原因主要归为绯闻说、旧情说和经济纠纷说三种。
绯闻说认为是鲁迅生活不检点，失敬弟媳妇羽太信子，导致兄弟失和，这也是周作人及其太太羽太信子一直以来的“暗示”。同为鲁迅、周作人朋友的郁达夫在《回忆鲁迅》中写道：“据凤举他们的判断，以为他们兄弟间的不睦，完全是两人的误解，周作人氏的那位日本夫人，甚至说鲁迅对她有失敬之处。”鲁迅兄弟共同的朋友章廷谦后来也曾对鲁迅博物馆工作人员说过：“周作人的老婆造谣说鲁迅调戏她。周作人的老婆对我还说过：鲁迅在他们的卧室窗下听窗。”
但“卧室窗下听窗”实际上不可能。章廷谦也紧接着说：“这是根本不可能的事，因为窗前种满了鲜花。”
在浴室外偷看洗澡更不可能，浴室离鲁迅夫人朱安的房子只有一米多，而且浴室外面是一条一米多深的沟。那有没有可能是鲁迅“调戏”弟媳妇呢？这也不太可能，因为，鲁迅母亲鲁瑞和朱安一般足不出户，鲁迅不太可能有机会“作案”。那有没有可能，是鲁迅一不小心碰见了弟媳妇正在洗澡？这也是猜测，即使是鲁迅不小心看到了弟媳妇洗澡，那也属于难免情况，不值得小题大做，更谈不上“调戏”。鲁迅儿子周海婴在《鲁迅与我七十年》书中写道：“再联系当时周氏兄弟同住一院，相互出入对方的住处原是寻常事，在这种情况之下，偶有所见什么还值得大惊小怪吗？”
因此，基本上可以判断，绯闻一说很难成立。
旧情说则是20世纪80年代开始流行的一种说法，说鲁迅与羽太信子原本是情人，羽太信子被鲁迅抛弃而因爱生恨。但这说法至今并无确切证据，如果两人确有旧情的话，当时和鲁迅交往密切的许寿裳不可能不知道。1991年，《明报月刊》第1期发表千家驹的文章《鲁迅与羽太信子的关系及其它》，该文认为周作人老婆羽太信子曾经是鲁迅的妻子，证据是鲁迅1912年7月10日的一则日记：“午前赴东交民巷日本邮局寄东京羽太家信并日银十元。”千家驹解释说，“羽太”即羽太信子，鲁迅把寄羽太信子的信函称为“家信”，可见他们是夫妻关系。但这很明显是牵强附会，鲁迅的意思很明白，这信是寄给羽太家的信，而不是寄给羽太的信。
经济纠纷一说则是主流分析，就连周氏兄弟母亲鲁瑞也曾对人说：“这样要好的弟兄都忽然不和，弄得不能在一幢房子里住下去，这真出于我意料之外。我想来想去，也想不出个道理来。我只记得：你们大先生（鲁迅）对二太太当家，是有意见的，因为她排场太大，用钱没有计划，常常弄得家里入不敷出，要向别人去借，是不好的。”
举家搬到北京后，鲁迅一大家子从母亲鲁瑞改为周作人夫人羽太信子当家，兄弟挣钱一起花。鲁迅除了留点零用钱外，绝大部分收入都交给羽太信子。周海婴在《鲁迅与我七十年》中气愤地写道：“没想到八道湾从此成为羽太信子称王享乐的一统天下。在生活上，她摆阔气讲排场，花钱如流水，毫无计划。饭菜不合口味，就撤回厨房重做。她才生了两个子女，全家雇用的男女仆人少说也有六七个，还不算接送孩子上学的黄包车夫。孩子偶有伤风感冒，马上要请日本医生出诊。日常用品自然都得买日本货。由于当时北平日本侨民很多，有日本人开的店铺，市场上也日货充斥，应该说想要什么有什么。但她仍不满意，常常托亲戚朋友在日本买了捎来。因为在羽太信子眼里，日本的任何东西都比中国货要好。总之，钱的来源她不管，只图花钱舒服痛快。”
对于太太的大手大脚，“周作人至少是默许的。他要的只是饭来张口衣来伸手，还有‘苦雨斋’里书桌的平静，别的一概不问不闻。当然他对信子本来也不敢说个‘不’字。”
周作人也曾经和羽太信子吵过，但羽太信子一旦“装死”，他就立马屈服软了。那受苦的只能是鲁迅，兄弟两人每月六百多大洋的收入都不够用，周作人又当甩手掌柜，只好由鲁迅四处筹钱。据许广平在《鲁迅回忆录·所谓兄弟》中回忆，鲁迅曾和许广平说过：“我总以为不计较自己，总该家庭和睦了吧，在八道湾的时候，我的薪水，全部交给二太太，连同周作人的在内，每月约有六百元，然而大小病都要请日本医生来，过日子又不节约，所以总是不够用，要四处向朋友借，有时候借到手连忙持回家，就看见医生的汽车从家里开出来了，我就想：我用黄包车运来，怎敌得过用汽车运走的呢？”此景此情下，挣钱主力鲁迅对花钱主力羽太信子很不满意，有所微词在所难免。而“作人的妻羽太信子是有歇斯台里性的。她对于鲁迅，外貌恭顺，内怀忮忌”
。因此，鲁迅与羽太信子的矛盾冲突便不可避免，羽太信子要将鲁迅赶出家门，之前她已经将周建人赶了出去，“她的真正目标是八道湾里只能容留她自己的一家日本人和她的中国丈夫”
。
确定无疑的是，鲁迅是被据说患有癔症的羽太信子赶出家门的。许寿裳说过，周氏兄弟不和，坏在周作人那位日本太太身上，她不愿同他一道住。1924年9月，鲁迅辑成《俟堂专文杂集》，署名“宴之敖”。1927年4月，在所作《铸剑》中，他又用“宴之敖”命名复仇者“黑的人”。据许广平在《欣慰的纪念》中回忆，鲁迅对该笔名有过解释：“宴”从门（家），从日，从女；“敖”从出，从放；意思即是说“我是被家里的日本女人逐出的”
。这个日本女人自然即是指羽太信子。周作人也曾明确说过：“要天天创造新生活，则只好权其轻重，牺牲与长兄友好，换取家庭安静。”
除了以上现实层面的原因外，还可以从心理学角度解释周氏兄弟失和，主要出自周作人的“弑父情结”和“老二心理”。“长兄如父”，鲁迅一直把自己当成了周作人的父亲，在一直培养周作人的同时也一直在监督周作人，甚至曾经揍过周作人，周作人内心肯定也会反感。人长大了往往会“弑父”，如同当年“新青年”对林纾一样。后来周作人的名气、地位、收入不亚于鲁迅，甚至还一度高于鲁迅，“你凭什么还像当年一样对我？还把我当成你的小跟班，我要独立自主，把你赶出去”。这可能是周作人的心理。
此外，周作人可能还有一种“老二心理”。老二在家里的位置一般很尴尬，尤其是家里还有老三老四就更尴尬了，如俗话所说“靠老大疼老三，最不待见是老二”。老大一般在家里很有地位，老小因为受宠也有地位，而老二在中间不尴不尬。但是老二也想显示自己的价值，所以会有“老二心理”，即老二也想有地位甚至想成为老大。而周作人正是周氏三兄弟中的老二，他也会有“老二心理”，即想取代鲁迅成为老大。
总之，经济纠纷是现实中的诱因，“周氏兄弟”失和背后更深的可能是周作人的“老二心理”“弑父情结”等心理因素。另外，“周氏兄弟”失和还因为两人在思想、性格、道路等方面有着根本不同。一个是站在时代前沿为民众请命的铁血“战士”，一个是躲进小屋自私自利的“隐士”，两人本质上“道不同不相与谋”。即使没有羽太信子煽风点火，也会有其他导火索，两人迟早分道扬镳。综上所述，“周氏兄弟”的失和看似偶然实则必然。