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不少药物是以蛋白酶为靶标而研发成功的。虽然都是围绕酶的活性中心进行设计，但因酶的结构不同，难易程度差别很大。丙型肝炎病毒NS3蛋白酶的活性部位位于平坦而表浅、延展而疏水的表面，缺乏特异性的裂隙或结合腔，未能从小分子入手研制抑制剂。波西匹韦是从模拟底物多肽结构出发，连接亲电性基团以与酶形成共价键结合，获得先导物；然后通过删除氨基酸残基，降低分子尺寸，改变氨基酸侧链以增加稳定性，在保持活性强度和选择性的前提下，优化物理化学和药物代谢动力学等成药性质，终于成为口服治疗丙型病毒性肝炎的首创药物。
丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是正链单链RNA病毒，含有9600个碱基，编码含有3000个氨基酸的肽链，后者包含了全部结构的和非结构的蛋白，其中称作NS3的丝氨酸蛋白酶催化裂解NS3-NS4A肽键，继而裂解NS4A-NS4B、NS4B-NS5A和NS5A-NS5B，生成成熟的功能性和结构性蛋白。NS3蛋白酶对HCV的生长和增殖具有重要作用，成为研制抗HCV药物的理想靶标。
NS3蛋白酶单晶X射线衍射分析提示，其活性中心处于浅表的、没有明显特征的、疏水性结构域，水分子覆盖着表面。实施催化的核心是由三元体构成：N端的His57和Asp81，以及C端的Ser139。在NS3蛋白酶的底物P1位置为Cys或The，P1′为疏水性的小体积氨基酸Ala或Ser，P2、P3和P4为疏水性氨基酸，P5和P6为酸性氨基酸残基如Asp和Glu。这些多数为疏水性氨基酸的组成，对理性设计选择性抑制剂有较大的困难。
图4-1是Asp-His-Ser三元体催化水解肽键过程的示意图。三元体与底物形成氢键，提高了肽键羰基的亲电性，丝氨酸的羟基进行亲核进攻，促进了肽键的水解。波西匹韦抑制NS3蛋白酶的一个重要反应位点，就是与该三元体结合，尤其是与Ser139发生可逆性共价结合。
图4-1 NS3蛋白酶水解肽键的示意
研究酶抑制剂的策略，通常是基于底物与酶的活性中心的相互作用特征进行设计的，但用小分子化合物筛选HCV的NS3蛋白酶抑制剂，却未获进展。原因是NS3蛋白酶活性中心处于酶的表面，呈平坦状展开，没有裂隙或结合腔（这往往是设计抑制剂的锚点），而且被水分子覆盖。推测酶与底物的结合是在较大范围发生的，以多位点的弱结合力维持酶-底物的相互作用，因而初始的研究是模拟天然底物的长链肽进行的。
自1989年HCV全长基因组测序并正式命名后，抗HCV药物的研发一直受困于丙型肝炎体外细胞模型和小动物体内感染模型的缺乏。1997年，用含HCV血清感染人或黑猩猩原代细胞获得初步成功，但该模型病毒复制水平低。此后，在1999年和2000年成功构建了具有复制活性亚基因组和全基因组HCV复制子模型，虽然含有HCV复制子的细胞无细胞病变现象，但HCV亚基因组复制子仍是21世纪初抗HCV药物研发最具贡献的模型，2005年成功地建立了具有再感染能力且伴有细胞病变的HCV细胞模型。
丙型肝炎动物模型是抗HCV药物研发的另一大难点，黑猩猩是仅有的能够被HCV感染并伴有病理现象的动物模型，但因数量少限制了应用。小鼠对HCV具有天然免疫力而不能作为实验动物，通过破坏小鼠对HCV天然免疫相关基因并转入人类基因，使其可被丙型肝炎病毒感染，虽已经取得一些进展，但仍不能替代黑猩猩模型。
由于NS3水解多肽的活性中心表浅而无特征，为确定先导化合物，首先将某种亲电性基团连接到长肽链中，如醛、酮、三氟甲基酮和α酮基酰胺等亲电性基团，以得到有较强结合作用的肽类先导物，然后简化和修饰成小分子化合物。
通过模拟底物P6到P5′的结构域设计含有α酮基酰胺片段的十一肽化合物（1），测定对NS3蛋白酶抑制活性，并测定对人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶（human neutrophil elastase，HNE，与NS3的活性中心结构相似）的活性以评价化合物的选择性，发现化合物2的活性 K i ＝1.9nmol/L，亲电性基团酮基酰胺在十一肽的P1和P1′之间。2的分子量（molecular weight，MW）为1265，距离口服吸收的物理化学和药物代谢动力学要求甚远，因而需要简化肽的性质，优化成可口服的药物。
化合物2的高活性，在于它与NS3活性中心的结构匹配，以及酮基酰胺的亲电性和所处的适宜位置，并与丝氨酸残基发生亲核性进攻，形成共价结合而使复合物稳定（图4-2）。
图4-2 酮基酰胺与丝氨酸的羟基发生亲核进攻形成共价结合的示意
将化合物2的C端4个氨基酸Met-Ser-Tyr-Ser切除，得到临近端点含有酮基酰胺的七肽（3），活性 K i ＝43nmol/L，虽然下降至1/23，但分子量降低到796。
对化合物3做结构改造，于P1′处引入1个苯基甘氨酸以增加P2′的疏水性，删除P4～P6的3个氨基酸残基，并做适当的基团变换，成为五肽的化合物4， K i ＝98nmol/L，活性虽低于3，但分子量降至687，减少了100。晶体X-射线衍射分析表明，P2的侧链接近酶的Arg155，后者应带有正电荷。但在抑制剂中引入羧基并未形成盐键而提高活性。设想P2可能与Arg155的亚烷基链发生疏水性结合。变换不同的烷基发现P2为较小的环丙基有利于结合，进而将P1′的烷基也变换成环丙基，得到化合物5，活性明显提高， K i ＝15nmol/L，但对感染细胞未见活性，EC 90 ＞5μmol/L，原因可能是游离羧基的存在不利于进入细胞膜。
图4-3是化合物5与NS3复合物单晶X射线衍射图，可以看到肽骨架经多个氢键与活性部位结合，酮基与Ser139形成共价键，两个环丙基分别进入P2和P1′的腔内，发生疏水-疏水相互作用，P3处的环己基处于另一疏水腔内，P1～P2′的片段形成“C”形发卡，包围着赖氨酸的侧链。
图4-3 化合物5与NS3复合物晶体
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根据晶体结构特征进一步优化结构，经过多位点探索，发现P2为二甲基环丙基脯氨酸、P3为叔丁基甘氨酸并且氨基用叔丁氧羰基修饰，P2′的羧基制成二甲酰胺以消除负离子和有利于穿越细胞膜，得到化合物6，活性为 K i ＝5nmol/L，对感染细胞的EC 90 ＝0.1μmol/L。化合物6与NS3蛋白酶复合物的晶体结构提示，其结合特征与化合物5基本相同，只是偕二甲基环丙基与Ala156有良好的疏水作用，增强了结合力。化合物6虽然活性有明显提高，但药物代谢动力学性质不佳。例如，大鼠灌胃10mg/kg，药时曲线下面积（area under thecurve， AUC ）＝0.35μmol·h/L，生物利用度 F ＝4%，达不到临床前最低要求（ AUC ≥1.0μmol·h/L，生物利用度 F ≥10%），这是因为分子仍然偏大，MW＝725。所以继续优化，目标仍是分子小型化。
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图4-4 化合物6与NS3蛋白酶晶体结构
至此，在P2和P3位置已进行优化的基础上，根据前面述及的去除P1′和P2′的甘氨酰苯基甘氨酸仍保持活性，将化合物6的这两个氨基酸删除，使α-酮基酰胺处于端点，并将1个叔丁基改为环己基，获得化合物7，活性 K i ＝25nmol/L，对感染细胞的EC 90 ＝0.4μmol/L，虽活性有所减弱，但分子尺寸显著减小，MW＝532。
为消除肽类药物的不稳定性，可将链状肽环合成环肽，以提高对蛋白酶的代谢稳定性。将化合物7中的环己基与环丙甲基用-(CH 2)9 -替换，即用长链亚甲基连接成十六元环，形成环肽8，其活性 K i ＝30nmol/L，对感染细胞的EC 90 ＝0.6μmol/L，MW＝520。然而实验结构表明环肽没有改善药物代谢动力学性质。
再回到里程碑式的化合物7，因为它是对P1处的环丙基用其他脂环替换，发现环丁甲基活性最高，再扩大环则活性下降，说明对P1体积的容纳是有限度的。P2处的偕二甲基环丙并脯氨酸片段已优化为最佳状态，不动。P3处的氨基变换为烷基、芳烷基、酰胺基、氨甲酰基、脲基、磺酰胺基或磺酰脲基，发现用脲基代替胺甲酰氧连接基，活性和其他性质最佳，遂将这些优化因素综合成化合物9。9的体外活性 K i ＝14nmol/L，对感染细胞的EC 90 ＝0.35μmol/L，MW＝519，对HCV的NS3蛋白酶抑制活性强于人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶2200倍，有很高的选择性。图4-5是化合物9与NS3复合物单晶X射线衍射图，结构分析表明，两个叔丁基分别和S4与S3疏水腔发生疏水相互作用，P2的偕二甲基环丙并脯氨酸片段采取弯曲构象，与酶的Ala156、His57和Arg155侧链发生最大程度的疏水性交盖，环丁基占据了S1腔，酮基酰胺的羰基与Ser139形成可逆的共价结合。此外，整个骨架与酶发生多处发生氢键结合。
化合物9对于大鼠口服生物利用度 F ＝26%，犬为30%，猴为4%，灌胃大鼠 AUC ＝1.5μmol·h/L，犬为3.1mol·h/L，猴为0.12mol·h/L。先灵葆雅公司定名化合物9为波西匹韦（boceprevir），经Ⅲ期临床研究证明对丙肝患者有显著治疗作用，于2011年5月13日经美国FDA批准上市。
图4-5 化合物9与NS3复合物单晶X射线衍射
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由Vertex和强生公司研发的特拉匹韦（10，telaprevir）是与波西匹韦同时研制的丙肝治疗药，于波西匹韦上市10天后（2011年5月23日）经美国FDA批准上市，特拉匹韦的作用靶标也是NS3蛋白酶，其研发策略也是以酶底物NS5A-5B为出发点，筛选了十肽类似物，后以含醛基的四肽作为先导物，演变成酮基酰胺的模拟肽，作用机制与波西匹韦相同，同酶的催化中心Asp139发生可逆性的共价键结合。
由Medivir和杨森公司联合研发的西咪匹韦（11，simeprevir）是含有十四元环的大环内酰胺，稳定地结合于HCV的NS3蛋白酶活性中心，但不形成共价键结合。于2013年经美国FDA批准上市，治疗丙肝。
由Gilead研发的索非布韦（12，sofosbuvir）是口服核苷类药物，其作用环节与上述的丙肝药物不同，抑制HCV的NS5B聚合酶而发挥抗病毒作用，由于抑制了病毒的复制，直接干扰了HCV的生命周期，对于难治的慢性丙肝患者的有效治疗效果，被认为是重要的突破。美国FDA于2013年12月批准上市。索非布韦是前药，在细胞内迅速水解掉丙氨酸酯片段，生成一磷酸核苷，在肝活化成三磷酸核苷而起效。
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