2.化学合成驱动的培美曲塞

【导读要点】

临床应用甲氨蝶呤已有60年的历史，直到2004年培美曲塞上市，中间的半个世纪叶酸抗代谢物的研发都是空白，一方面是由于针对包括蛋白激酶在内的众多肿瘤靶向药物的问世，也由于叶酸类化学合成复杂。培美曲塞项目始于有机化学家Taylor对杂环化学的兴趣，从研究生的论文研究黄蝶呤开始，毕生致力于杂环化学的研究，依靠他娴熟的化学合成知识与技巧，为培美曲塞项目合成数百个结构多样的类似物。培美曲塞作用于叶酸代谢路径的5个酶系，因而有别于只抑制二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）的甲氨蝶呤的适应证，广泛的目标物合成、揭示构效关系和作用机制是成功的基础。当然也与企业（礼来公司）的参与分不开。

1 研发背景

20世纪50年代，氨基蝶呤（1，aminoptrin）和甲氨蝶呤（2，methotrexate，MTX）用于治疗儿童急性淋巴细胞白血病，开始了现代意义的肿瘤化学治疗。60多年来，肿瘤化学治疗和靶向分子治疗有了长足发展，但至今甲氨蝶呤仍在临床应用。甲氨蝶呤作为叶酸（3，folic acid）的抗代谢物，是二氢叶酸还原酶抑制剂，DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸（4，tetrahydrofolic acid，THF），后者作为辅酶在细胞中的一碳基因代谢中起重要作用，参与体内胸苷酸、嘌呤、蛋氨酸等从头合成以及丝氨酸-甘氨酸的相互转化。叶酸抗代谢物的实质性进展就是2004年上市的培美曲塞。

THF作为化学载体，在N5和/或N10原子上连接了不同氧化态的被转移的一碳基团，形成不同形式的辅酶，参与叶酸途径转移一碳基团的各种生化反应，图2-1是不同的THF辅酶分子片段。

由于甲氨蝶呤对肿瘤细胞的选择性较差，临床呈现较强毒性（如对小肠黏膜和骨髓等生长旺盛的组织），人们致力于提高叶酸抗代谢物的选择性，其中普林斯顿大学的有机化学家Taylor的研究组从辅酶的化学作用特征入手，成功地研制了培美曲塞。

2 5,10-去氮（四氢）叶酸的设计与合成

2.1 活性评价模型

用3种体外模型评价化合物活性：一是从牛肝中提取的二氢叶酸还原酶（DHFR）测定化合物的IC ₅₀ ，评价化合物对DHFR环节的作用强度；二是从乳酸杆菌提取的胸苷酸合成酶（thymidylic acid synthetase，TS），评价对TS的抑制活性IC ₅₀ ；三是从小鼠肝提取的叶酸多聚谷氨酸合成酶（folylpolyglutamate synthase，FPGS），评价化合物作为FPGS底物的亲和力 K _m 。

2.2 化合物的设计与活性

Taylor分析了参与转移一碳基团的上述辅酶分子都具有蝶啶-对氨基苯甲酸-谷氨酸的结构，区别只是N5和N10的连接基团，因而设想变换的位点应集中在N5和N10处。为此，将N5和/或N10用碳原子代替，保持其余结构不变，探索这样的化合物对多种一碳转移酶的抑制作用。合成的化合物5～8列于表2-1中。

化合物5和6是将叶酸或四氢叶酸的4-羟基换成氨基，对DHFR显示有高活性，而对TS无作用，7和8对这两种酶都没有抑制作用，提示将叶酸或四氢叶酸的N5和N10氮原子换成碳的简单置换是无效的。用小鼠肝提取FPGS评价这4个化合物的结合力（ K _m ）并与FPGS的底物四氢叶酸加以比较（表2-2）。这些5,10-二去氮化合物都与FPGS结合，而且还原型的6和8比芳香性的5和7结合作用强。4-氧代化合物7和8比4-氨基化合物5和6的活性强。8的活性接近天然底物四氢叶酸的活性。

小鼠白血病L-1210细胞模型评价化合物5～8的抑制活性结果见表2-3。提示化合物5、6和8对离体L-1210白血病细胞有较高的抑制活性。进而用接种L-1210细胞的BDF1小鼠模型，腹腔注射化合物5和6显示与甲氨蝶呤有相近的抑制活性（表2-4）。

上述初步有意义的结果促进了礼来公司与普林斯顿大学的合作，对化合物评价更多的瘤株，表明化合物8对多种人肿瘤细胞的抑制作用优于甲氨蝶呤（表2-5）。

化合物8（5,10-二去氮四氢叶酸，DDATHF）对甲氨蝶呤耐药细胞有较强抑制活性，提示二者有不同的作用环节，后来证明8抑制甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶（glycinamide ribonucleotide formyl transferase，GARFT），后者是嘌呤从头合成的第二步反应，因而DDATHF开辟了叶酸路径抗肿瘤药物的新环节。进而以DDATHF为新的先导物进行优化。

3 5-去氮四氢叶酸及其衍生物

为了分别考察四氢叶酸的N5和N10被碳原子置换对活性的影响，将DDATHF恢复N10，合成了5-去氮四氢叶酸及其衍生物，用离体人淋巴细胞白血病细胞测定活性（表2-6）。结果表明，化合物9（为差向异构体混合物）的活性强于8（DDATHF，也是差向异构体混合物），也强于N10-取代物（10～12）4～60倍，N10-甲基或N10-甲酰基的活性略低于9，但体积较大的乙酰基活性显著下降。当在白血病细胞的培养基中加入过量的次黄嘌呤时，可解除化合物9对细胞的抑制作用，而加入胸腺嘧啶时不影响对细胞的抑制，提示9干预了嘌呤生物合成的环节，与化合物8相同。化合物9（与化合物8）的差向异构体分离后两个单体的活性相同，提示C6的构型对活性没有影响。

化合物9对小鼠FPGS结合的 K _m 低于化合物8，说明是更强的结合底物，9的一级速率常数是化合物8的5倍，表2-7比较了化合物9同化合物8、叶酸和氨基蝶呤对FPGS的参数。

化合物9对小鼠移植性乳腺癌和淋巴肉瘤的抑制剂量未显示显著毒性，提示具有选择性抗肿瘤作用。

4 消除C6手性中心的化合物

化合物8的抗肿瘤作用机制是抑制甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶，有别于甲氨蝶呤（MTX）抑制二氢叶酸还原酶，因而对耐受MTX的瘤株有显著抑制活性，8对小鼠多种移植性人肿瘤有活性，通过临床前研究将8的差向异构体分开，表明6 R -略优于6 S -异构体，遂将6 R 定名为lometrexol推入临床研究。与此同时，为避免分离手性异构体（因是在合成步骤的后期）以简化操作和降低成本，探索消除C6的手性。

消除手性的简单方法是将C6换成平面性的 sp ² 杂化的碳原子，合成了化合物13和14，这两个化合物由于在空气中发生氧化脱氢，芳香化成化合物7，所以这个方法不能解决问题。

另一个方法是去除C5原子，从而打开了四氢吡啶环，成为单环嘧啶经碳链与苯环连接，合成的代表性化合物见表2-8。化合物15～20为变换嘧啶与苯环相连的长度，或引入炔键，或在嘧啶上加入甲酰基等，这些化合物的活性都低于8（IC ₅₀ ＝0.02μmol/L），表2-8中活性最强的15，其活性换算为摩尔浓度IC ₅₀ ＝2μmol/L。

消除C6手性的另一方式是去除C7原子，合成了开环化合物21，21抑制L-1210细胞的活性IC ₅₀ ＝0.132μmol/L，略低于化合物8，因而作进一步优化。

5 优化去除C7的开环化合物

以开环化合物21的结构为中心，变换取代基和片段，如嘧啶的4位和6位的基团变换以及苯环的变换，合成的代表性化合物的结构和抑制L-1210活性见表2-9。

化合物21抑制L-1210细胞作用与8相同。作用机制的研究表明：①培养液中加入过量的黄嘌呤可逆转抑制活性，而且加入胸腺嘧啶不能解除抑制，提示21的作用环节是阻断嘌呤合成。②21对从L-1210细胞中分离的GARFT的抑制活性（ K _i ＝0.38μmol/L）低于化合物8活性的1/3，提示开链的21没有改变作用机制。

化合物22为2,4,6-三氨基嘧啶环，抑制L-1210细胞活性强于21，但机制研究表明其作用环节是抑制二氢叶酸还原酶，而不是GARFT。

化合物21的5-氨基分别用甲基（23）和羟基（24）替换，活性显著降低，说明5位氨基对于结合GARFT的重要性。

21结构中的苯基被噻吩置换（25和26），仍然保持活性，而且作用环节仍是GARFT，然而用五亚甲基连接（27）则失去活性。化合物28是21的末端谷氨酸被少一碳原子的天冬氨酸置换，活性丧失，提示末端的谷氨酸对于叶酸多聚谷氨酸合成酶是非常重要的。

6 构效关系小结

以天然配体叶酸为起始物，对蝶啶环和包括N10的连接基的变换，合成的化合物对肿瘤细胞生长的抑制作用，以及叶酸通路中的作用环节，可概括为如下的构效关系：①碳原子置换N5氮原子是抑制甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶（GARFT）的关键因素。5-去氮四氢叶酸（9）与5,10-二去氮四氢叶酸（8）都是GARFT的良好抑制剂。去除N10的化合物对癌细胞和肿瘤小鼠的抑制没有影响，也不影响对生化反应的抑制作用。②2-氨基嘧啶-4-酮是必需的母核。③在四氢吡啶与苯环之间的连接基至少需有两个原子间隔。④苯环可用五元或六元芳杂环置换，仍保持活性。⑤刚性的双环是必要的片段，去除C7形成的柔性开链化合物虽然有抑制GARFT的作用，但对动物体内肿瘤的抑制作用减弱。⑥去除C5的开链化合物失去活性。⑦与嘧啶稠合的环不宜为芳香环。⑧嘧啶环的C6连接的NH ₂ 或稠合环的NH是必需的基团。⑨化合物被多聚谷氨酰化是抑制癌细胞的重要步骤，应是叶酸多聚谷氨酸合成酶的良好底物。

7 候选化合物的设计与确定

上述的构效关系是Taylor等从合成的700多个目标物中总结出来的，也是研发这类药物的限制条件，有的要点之间互有矛盾（由于结构不同所引起），因而需要审视和分析某些约束条件。例如，对第⑦项与嘧啶稠合的环不宜为芳香环作了结构分析。这个不宜为芳香环的结论是从5,10-二去氮叶酸的无活性得出的。从有机化学的视角分析，并合的吡啶环具有缺电子性，偶极矩2.2 D ，负极在N端，亲电试剂与吡啶的N发生作用。而吡咯环作为芳香环具有富电子性，偶极矩1.7 D ，负极在C原子上，亲电基团与吡咯的C原子发生作用。吡咯与吡啶的性质有很大不同，对稠合环不能认定芳香性一定不成。

Taylor因而设计了嘧啶并吡咯的杂环与乙苯甲酰谷氨酸片段相连，化合物29既保持了稠合环的刚性结构，也提供了参与结合的NH基团，还满足上述构效关系的要求。

实验表明，化合物29具有多方面活性，其作用特点总结如下：①对小鼠L-1210细胞的抑制活性IC ₅₀ ＝0.022μmol/L，人CCRF-CEM淋巴细胞白血病细胞IC ₅₀ ＝0.016μmol/L。机制研究表明，培养液中加入亚叶酸或者胸腺嘧啶与黄嘌呤（分别为胸苷酸和嘌呤核苷酸的前体）都能解除抑制作用，说明29的抗肿瘤作用是抑制叶酸代谢的结果。②29是胸苷酸合成酶竞争性抑制剂， K _i ＝0.34μmol/L。③不抑制GARFT，因为加入黄嘌呤不能解除抑制。但多聚谷氨酸化后是GARFT抑制剂。④29是叶酸多聚谷氨酸合成酶的强效底物， K _m ＝0.2μmol/L，显著低于氨基蝶呤（21μmol/L）。一级速率常数相对值为400（叶酸为100），甲氨蝶呤为0.9、氨基蝶呤为10.1、化合物8为32，因而是非常强效的胸苷酸合成酶抑制剂。⑤多聚谷氨酰化后是二氢叶酸还原酶抑制剂。⑥多聚谷氨酰化后也是氨基咪唑酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶（AICARFT）抑制剂。⑦多聚谷氨酰化后也是C1-四氢叶酸合成酶（C1-THF）抑制剂。

化合物29对缺失胸苷激酶和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的白血病小鼠腹腔注射12.5～200.0mg/kg，连续8天，显示有良好治疗效果和较宽的安全窗口。29与已有的叶酸抗代谢药物不同，可同时抑制叶酸通路的5个酶，因而对肿瘤耐药株也呈现活性。礼来公司对化合物29深入开发，定名为培美曲塞（pemetrexed），经临床前和临床研究，表明是治疗恶性胸膜间皮瘤和非鳞状非小细胞肺癌的有效药物，于2004年在美国上市，成为自甲氨蝶呤问世后，半个世纪以来美国FDA批准的唯一一款叶酸抗代谢物。

追溯培美曲塞的研发过程，始自于化学兴趣研究，漫长的研究历程直到设计合成培美曲塞，都是在普林斯顿大学进行的。早在Taylor研读博士期间，就出于对结构式如一种蝴蝶翅膀的黄色粉状物感兴趣，进行了对稠合的黄蝶呤杂环的化学合成与研究。后来，也出于兴趣与好奇，研究蝶啶和叶酸类似物的合成。由于娴熟的合成技巧，Taylor研究组合成了数百个结构（母核）多样性的叶酸类似物，发展了杂环化学。合作的礼来公司负责活性评价，反馈于合成的设计，直至成功地开发出培美曲塞上市。杂环化学合成推动了本项目的研究，众多不同环系的化合物合成以及所揭示的构效关系为设计培美曲塞打下了基础。当然，大学与企业的互补性结合又是新药成功上市的保障。

参考文献

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附：培美曲塞合成路线