1.模拟天然产物的他米巴罗汀和贝沙罗汀

【导读要点】

他米巴罗汀和贝沙罗汀分别是模拟全反式维A酸和9-顺式维A酸的药效团分布和分子构象研制的，以药物化学的方法分析构效关系优化而成。两个药物的研究机构分别是大学和公司，从发表的文章可看出研究模式的差异，大学教书育人，强调学术研究的系统性和完整性，企业以产品目标为中心。这个理念的差异在我国的新药研究中也颇有反映。

1 维生素A类化合物及其受体

1.1 维A酸

维生素A（1，retinol）又称为视黄醇，是人体必需的维生素，在体内依次氧化成视黄醛（2，retinal）和全反式视黄酸（3，all- trans -retinoic acid，RA），全反式视黄酸即维A酸，各自履行不同的生理功能。维A酸作为信号分子，在胚胎发育、细胞增殖和分化中起重要作用。维A酸在体内还可异构为9-顺式维A酸（4，9- cis -RA），与维A酸功能相似，但结合的受体不同。

研究维A酸的构效关系发现，分子结构的一端为疏水性片段，另一端为极性基团，中间由共轭键连接，分子整体形成共轭结构，3个因素都是必需的。临床应用维A酸治疗银屑病等皮肤病和白血病，但因长链共轭结构的不稳定性，容易发生聚合而变性，加之维A酸有强刺激性，限制了临床应用。

1.2 维A酸的调控作用

维A酸（RA）的信号转导通路是由胞内RA结合蛋白、RA受体、RA反应元件（RA response element，RARE）和靶基因构成。RA进入靶细胞后，经RA结合蛋白输送到细胞核内，与核受体生成复合物，以同二聚体或异二聚体识别并结合脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）上的RA反应元件，调控DNA基因表达，参与细胞增殖和分化过程。

1.3 维A类受体

维A类受体是核受体家族的一个分支，分为两类：维A酸受体（retinoic acid receptor，RAR）和维A类X受体（retinoid X receptor，RXR），各自又有3种亚型α、β和γ。RA结合并激活RAR，9- cis -RA结合并激活RXR，但对于亚型缺乏选择性作用，因而需以天然配体RA或9- cis -RA作为先导化合物，研制具有较少刺激性和较高稳定性的合成维A类药物。

2 作用于RAR的他米巴罗汀

2.1 活性评价

评价受试物的活性用两种体外模型，一种是对人早幼粒白血病HL60细胞诱导分化为成熟的粒细胞的能力，形态学的变化是用瑞氏-吉姆萨（Wright-Giemsa）染色测定。另一种是用硝基四氮唑蓝（nitroblue tetrazolium，NBT）还原反应测定细胞分化功能的标志物。实验表明，这两种表示分化作用的指标有良好的相关性。受试物的诱导分化活性用EC ₅₀ 表示，是用NBT还原反应测定受试物诱导50%人髓细胞白血病细胞HL60分化为成熟粒细胞的浓度计算而得。

2.2 维A苯甲酸类化合物的设计

东京大学首藤等基于罗氏公司上市的、用于治疗银屑病的依曲替酯（5，etretinate）和虽未上市但有强效细胞分化活性的芳香维甲酸（6，arotinoid）的结构，推断维A酸的共轭多烯可部分地用苯环替换，并且苯环之间可用参与共轭系统的非碳原子的片段连接，设计了通式7的化合物模式。由于结构中含有苯甲酸片段故名维A苯甲酸（retinobenzoic acid）。

2.3 胺酰基连接的化合物系列

首先用胺酰基-NHCO-连接两个苯环，R为不同位置的烷基或环烷基变换为单、双或三取代的化合物列于表1-1。

表1-1的构效关系表明：①苯环A上无取代基或3-甲基或3-乙基等简单取代的化合物（8～10）都没有活性。②R为中等大小的烷基呈弱活性，如化合物11～15，但都弱于维A酸。③不同位置取代的异丙基和叔丁基呈现的活性不同，处于3位的活性最强（化合物12，15），在2或4位的活性较弱。④体积大的3-苯基（17）或3-环己基（18）基本无活性。⑤处于3,4位或3,5位中等大小的二取代物如二异丙基或二叔丁基有较高的活性，3,4-二异丙基化合物（26）活性强于维A酸。⑥在2（或6）位有取代基则失去活性，如化合物22～24和27。推测是邻位效应影响了化合物的构象。

综合上述药物的构效关系，表明在A环的3,4位存在两个中等大小的烷基有利于活性。化合物25和26互为位置异构体，活性相差近20倍。差异缘故可做如下分析：处于3,4位的两个异丙基拥挤的位阻会导致4个甲基朝向相反方向，形成较稳定的限制性构象，这种限制性烷基构象可能有利于同受体结合，而3,5-取代基仍可自由转动，活性构象份额较少。这种推理，在后面叙述的成环方式中得到了验证。

2.4 二异丙基的环合

设想3,4-二异丙基的4个甲基呈面对面朝向（26a）用双环固化结构成28；26b固化的结构成29，在环外有两个甲基；26c的4个甲基背对背朝外，环合成30。这3个化合物的活性有很大的区别（表1-2）。

化合物28与二异丙基的碳数相同，或许是环外没有甲基，失去了活性；双环的桥头各连接一甲基，恢复原来活性（仍不及未成环的26）；30是在苄基α碳上各有两个甲基，诱导分化的活性很高，是维A酸的3.5倍。29和30的碳数相同，疏水性相近，活性相差近百倍，推测是分子形状不同引起的活性区别。

2.5 逆向连接——酰胺化合物系列

上面合成的化合物是用-NHCO-连接两个苯环，下面以逆向的酰胺片段（-CONH-）连接，探索逆向连接对活性的影响。表1-3列出有代表性的化合物，苯环A无取代基或单取代的叔丁基化合物31～33也未呈现活性，而双叔丁基取代的化合物34和35活性显著提高，四甲基四氢萘化合物36活性高达维A酸的7.2倍。以上表明正向胺酰基或逆向酰胺基连接的化合物的构效关系是相同的。

2.6 苯环和酰胺上的取代

四甲基四氢萘胺酰或酰胺苯甲酸成为优化的骨架，表现在化合物30和36诱导分化活性强于维A酸。下一步是对骨架作取代基的变换，即考察在胺酰（酰胺）基的邻位和氮原子上的基团取代对活性的影响。表1-4列出了代表性的化合物。

表1-4的数据表明，在化合物30的连接基的邻位引入基团，使活性降低2～3个数量级，提示邻位效应不利于活性，可能是改变了分子构象和共面性而失活，这与前述的异丙基系列的邻位取代的效应是相同的。化合物41和42分别是高活性的30与36的N-甲基衍生物，二者活性殆尽。究其原因，是甲基引起分子构象由伸展形变为弯曲形，并由核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和X射线衍射证明，如化合41有如下的构象。

-NH-CO-以 trans 为稳定构象，使分子（如30）呈伸展形，当甲基取代成-N(CH ₃ )-CO-，则呈 cis 更为稳定，以避免 trans 构象的甲基与苯环邻位氢原子的空间阻碍。弯曲形的分子与维A酸的伸展构型差异大，难以与受体适配。

化合物43是将高活性化合物30的 p -羧基移至 m -位置，活性下降至0.1%，是间位羧基缺乏参与共轭体系的缘故。

2.7 查耳酮骨架的构效关系

以化合物30和36为代表的化合物表明胺酰基和酰胺基对诱导分化活性的有效性，提示连接基的变换有一定的空间。本节考察以丙烯酮（-CO-CH=CH-）为连接基的查耳酮骨架的活性。丙烯酮片段通过交叉共轭将苯环A和B形成共轭体系。表1-5中化合物的构效关系表明，苯环A的取代基变换对活性的影响与前述的构效关系相同。

表1-5的构效关系表明，与前述的胺酰（酰胺）系列的规律相似，二异丙基或二叔丁基取代苯（45，48）的活性更高，四甲基四氢萘（50）取代苯的活性也很高。而且在6位存在甲基或羟基的化合物（51，52）活性也强于维A酸，而前述系列则不容有6位取代。这可能是查耳酮的交叉共轭允许单键做一定程度的扭动，既维持了活性构象，也避免了邻位甲基的扰动。

查耳酮可存在不同的低能构象，如图1-1所示的酮基双键成 cis （图1a）和 trans （图1b）的构象。若反式构象的碳原子C3′用氧醚键与苯环A成环，即成为黄酮结构（查耳酮是植物体内黄酮的生源），可认为是将查耳酮的反式构象固定的骨架。为此考察了以黄酮为母核的维A化合物。

2.8 黄酮为母核的化合物

黄酮的并苯上取代烷基的大小、位置和数量对诱导分化作用的影响与前述的胺酰、酰胺连接的化合物以及查耳酮的构效关系是相同的（结构和数据省略），因而表1-6中只列出以四甲基四氢萘并吡喃酮为母核的代表性化合物。化合物54相当于30、36和50，具有很强的活性，为维A酸的27倍。不过由于稠合三环的结构，物理化学性质和成药性上存在潜在的问题，或许是未深入研发的原因。有趣的是，在黄酮的3位连接羟基或甲氧基仍保持有活性。

2.9 茋类化合物

反式二苯乙烯化合物（茋类）是前述的胺酰或酰胺类化合物的电子等排体，区别是茋类以 π 键连接两个苯基，酰胺是经 p - π 共轭连接。代表性的化合物列于表1-7。苯环上烷基的数量和大小对活性的影响与前面的胺酰基或丙烯酮系列化合物的构效关系相同，如二甲基化合物57没有活性，二乙基（58）和二丙基（59）化合物的活性逐渐提高，3-叔丁基（60）的活性强于4-叔丁基（61，62）。四甲基四氢萘化合物63的活性强于维A酸1.6倍，当乙烯基α位被甲基取代（6，芳香维甲酸），活性有所降低，接近于维A酸。化合物65是63的双键被还原成单键相连的化合物，活性下降了近99.9%，可解释为破坏了分子整体的共轭性的缘故。

偶氮基-N=N-作为连接基（66）仍保持了反式构型，因而也有活性（EC ₅₀ 为0.0017μmol/L），但可能在体内发生还原代谢而失活，有潜在的不稳定性。

2.10 候选化合物和他米巴罗汀的上市

东京大学首藤等对诱导细胞分化的维A苯甲酸类化合物进行了系统的结构变换和构效关系研究，发表的文章清晰反映大学的研究方式，如探究两个苯环间不同的连接基（形成不同的骨架结构）的构效关系，都要合成苯环A上无取代或小尺寸烷基取代，并证明都是无效的，其实尝试1次就足够，因为这与维A酸分子中三甲基环己烯的结构相距甚远，因而本文在解析研究历程时省略了许多化合物和数据。从研发新药的视角，过多合成显然无效的化合物是无意义的重复。不同骨架的优化结构都应聚焦于含有四甲基四氢萘的片段上，也就是表1-8中列出的高活性化合物。

化合物30被确定为候选化合物，但从这些高活性化合物中选择的依据，在发表的文献中未能找到诸如动物实验、药物代谢动力学、安全性或物理化学性质等数据的比较，因而难以叙述这一环节。化合物30在大鼠体内的半衰期 t _1/2 为3.4～4.0小时，达峰时间（peak time， T _max ）2～4小时，代谢产物主要是芳环上不同位置的羟基化。安全性试验表明，大鼠皮下注射50mg/kg未见行为异常和死亡。化合物30由东光制药公司开发，定名为他米巴罗汀（tamibaroten）。经临床试验，表明口服应用可治疗急性早幼粒细胞白血病，于2005年在日本和美国上市。

3 贝沙罗汀

他米巴罗汀的研制是以细胞表型的变化和生化反应的改变作为评价指标的，没有以对核受体的选择性激动活性作为设计和优化目标。本节讨论的贝沙罗汀则是Ligand公司针对RXR受体进行研制的。读者从研制过程也可以领略到企业与大学研发新药的区别。

3.1 活性评价

化合物活性用两种体外模型评价，一种是通过共转染（cotransfection）方法测定化合物对6个维A酸受体的作用和激活基因的能力；另一种是分别用［ ³ H］-维A酸和［ ³ H］9- cis -维A酸作底物测定受试物对6个受体的竞争性亲和力（afinity）。共转染实验是将两个基因导入CV-1细胞中：核受体在启动子的调控下合成蛋白，报道分子（reporter molecule）在激素反应元件的控制下被核受体识别，因此用荧光素酶基因测定的报道分子，其催化活性直接反映了酶的表达量。EC ₅₀ 是产生最大效应的50%所需受试物的纳摩尔浓度。

3.2 先导物的发现

研究发现，芳香维A酸（6，arotinoid）分子的3位甲基化（66）后对RAR和RXA激动作用发生显著变化，6对RARα、β和γ的活性EC ₅₀ 为1～30nmol/L，66对RARα、β和γ的EC ₅₀ 为180～340nmol/L，而6和66对RXRα、β和γ的EC ₅₀ 分别为＞10 000nmol/L和1175～1500nmol/L。3位用乙基或异丙基取代提高了对RXRα、β和γ的活性。

3.3 结构优化

为了提高对RXRα、β和γ的选择性激动活性，研发者设计了通式为67的化合物，笔者认为该化合物用 sp ² 杂化的单原子（团）连接两个苯环，赋予分子的结构以不同于维A酸的伸展形分子走向，形成的“拐点”模拟了9- cis -维A酸的构象，以拟合RXR受体结合域。

为优化结构设定对67做两个位点的变换：3位 R 和连接两个苯环的C= X基团。表1-9列出了代表性化合物和作用于CV-1细胞的6种受体共转染数据。设计的成对化合物，是每变换3位取代基，要同时合成酮基C=O和亚甲基C=CH ₂ 化合物。

分析构效关系如下：①化合物68对RARβ、γ和RXRα、β和γ只呈现微弱活性，EC ₅₀ 在937～2971nmol/L，没有显示出对RXR的选择性活性；78对RARα、β和γ和RXRα、β和γ的活性虽然普遍强于68，但也没有显示对RXR的选择性。②69是3-甲基取代的酮基化合物，甲基的引入消除了对RAR的激动作用，对RXRα、β和γ的活性提高了4～10倍；相应的亚甲基化合物79不仅消除了对RAR受体激动活性，还显著提高了对RXRα、β和γ的活性，EC ₅₀ 达到24～33nmol/L。提示3-甲基取代提升了对RXR的激动活性和选择性。79是对RXRα、β和γ活性和选择性最强的化合物。③两个系列的3-乙基、3-异丙基、3-氯、3-溴和3-甲氧基也都激活了RXR，提高了基因表达量。然而酮基系列的3-氟、3-羟基和3-正丙基，以及亚甲基系列的3-氟和3-正丙基没有显示活性或没有选择性。

进而评价了这些化合物与RARα、β和γ和RXRα、β和γ的结合能力，方法是检测与［ ³ H］-维A酸和［ ³ H］9- cis -维A酸竞争性结合6种受体的能力，结果列于表1-10。

表1-10中化合物与受体的竞争性结合数据与表1-9的功能性数据有良好的相关性。连接基为酮基系列的化合物结合力和选择性弱于相应的亚甲基系列。3位没有甲基的68对RARα、β、γ和RXRα、β、γ都没有结合作用，无3-甲基的亚甲基化合物78虽然只结合RXRα、β和γ，但活性弱。79也是对RXRα、β和γ选择性结合作用最强的化合物。有趣的是，3-正丙基化合物71和81的功能性实验没有呈现活性，但都能和RXRα、β、γ结合，推测有可能呈现RXR受体阻断作用。

化合物76基本未呈现活性，是由于羟基与酮基发生分子内氢键结合，改变了分子的构象，如图1-2所示。 ¹ H-NMR显示76和86在DMSO-d ₆ 的羟基的质子有不同的化学位移，α、β和γ向低场移动1.4ppm（二者分别为10.29ppm和8.89ppm）。当然，化合物77、86和87不能形成分子内氢键，但活性也很低，可能还有其他原因。

3.4 候选化合物和贝沙罗汀上市

化合物79对RXRα、β、γ有高度亲和力和促进RXRα、β和γ对DNA表达功能，进一步实验表明79可阻断肿瘤细胞周期，诱导细胞分化和凋亡，以及抑制血管形成和转移。Ligand公司命名79为贝沙罗汀（bexarotene），经临床前和临床研究表明是治疗皮肤T细胞淋巴瘤的有效药物，美国FDA和欧盟药品管理局（European Medicines Agency，EMA）分别于1999年底和2001年初批准其上市。

3.5 贝沙罗汀的分子构象

贝沙罗汀在3位的甲基存在，使得对RXR选择性活性显著高于无甲基的化合物68，分子力学优化能量后的化合物构象表明，没有3-甲基的化合物68的两个苯环处于一个平面，而贝沙罗汀低能构象为两个苯环处于垂直方向，经QSAR研究贝沙罗汀比没有甲基取代的化合物68构象熵损失0.45kcal/mol（1.88kJ/mol），提示68难以越过维持活性构象的壁垒。

参考文献

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附：他米巴罗汀与贝沙罗汀的合成路线