下载掌阅APP，畅读海量书库
立即打开
药物治疗就是使用物质纠正人体异常功能，将其调节为正常化的过程。这里所说的物质，在当今已不限于传统小分子药物，而是拓宽至多个领域，包括大分子药物、基因疗法、细胞疗法以及肠道活菌等。如肽类、反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，AON）、双特异抗体（diabody；bispecific antibody，BsAb）、抗体药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）等大分子药物，其中皆已有药物被批准上市，标志着这些技术的成熟；如基因编辑技术CRISPR-Cas9、干扰小RNA（small interfering ribonucleic acid，siRNA）等基因疗法，显示出了治愈疾病的潜力；细胞疗法中的干细胞和肿瘤嵌合抗原受体T细胞治疗（chimeric antigen receptor T-cell therapy，CAR-T cell therapy）技术也已在临床应用；使用肠道活菌调节人体代谢和免疫功能也有显著的效果，这些都体现了生物学的成就对药物和治疗的巨大推动力。
与此同时，分子生物学和结构生物学也助力了小分子药物研究，在仍以小分子药物治疗为主要手段的当今，无论是靶标的发现和确证，还是药物分子的结构建造，生物学现已成为研制的引擎和推动力，目前单纯靠化学概念进行的药物研发已较为鲜见。
分子生物学和结构生物学的发展，使小分子药物的发现从20世纪80年代基于生理或细胞表型的模式进入了以分子靶点为核心的研制时代。在这个过程中，发现并确证与疾病成因果相关的靶标成为了决定性因素。发现新靶标，需要长期的基础研究积累，而验证靶标的可药性（druggability）更是一种漫长和充满风险的过程，靶标验证贯穿于药物研制的始终，甚至药物在Ⅲ期临床试验结束、获得批准上市后，还必须在“真实世界”继续评价药物的安全有效性，确证靶标的可药性。
另外，想要找到可以干预靶标和调节功能的药物，关键是构建化学结构，从苗头分子（hit）到先导化合物（lead），再经结构优化确定候选化合物（candidate），经过多层次的概念验证，最终获得新分子实体（new molecular entity，NME）。在这个过程中，离不开生物学的指导和参与。从苗头演化成先导化合物再优化成药物的过程，是将药理活性（强度和选择性）以及成药性的全部要素融合到结构之中，该融合过程可以从化合物的微观结构和宏观性质加以解析。下面拟从微观和宏观的视角解析生物学在创制药物中的作用。
药物与靶标的结合（靶向）产生药效，与非靶标结合（脱靶）产生不良反应，都是药物分子的特定原子、基团或片段（可称作药效团）与靶向/脱靶的生物大分子的特定部位发生相互作用，是双方的微观结构在空间的形状、电性、疏水性、氢键和范德华作用的互补性所致，所以产生的药效和不良反应是由特异性的微观结构所决定，是药物的个性表现。新药的研究要强化与靶向分子的结构适配与互补，避免与非靶分子的结合，这也是提高药物的选择性药理作用、减少不良反应的结构保障。
药物的成药性包括安全性（避免脱靶的不良反应，微观结构所决定）、药物代谢性质（在体内的吸收、分布、代谢、排泄）和物理化学性质（溶解性、过膜性和制剂可及性等），这些性质赋予并保障了药物分子在适宜的时间和恰当的空间发挥作用。除了与代谢转化与一定的微观结构因素有关，其主要由分子的整体性质（宏观性质）所决定，包括分子大小、酸度系数（p K a ）、溶解性、分配系数（过膜性）、荷电性和极性表面积等。宏观性质在相当大的程度上并不拘泥于细微结构的差异。药物在体内的Ⅰ相和Ⅱ相代谢的化学处置，介于微观结构与宏观性质之间，如细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）氧化酶众多的亚型便反映了这种特征。
一种药物与多种靶标发生相互作用而引起不同药理效应的现象称作药物的杂泛性（promiscuity），其根源是靶标蛋白的杂泛性，蛋白分子的三维结构具有柔性和可塑性，可以同多种配体相结合。药物的杂泛性是多向药理学的基础，也是药物产生副作用的原因。杂泛性概念对于新药创制有着重要意义。
应用反向思维的思考方式处置化合物的杂泛性，或对受体多样性功能进行转轨变换，是一种创新的指导策略。其要旨是不拘泥于常规思维，避免从众趋向，而是逆向思考，对化合物的杂泛性进行非常规性的扬弃，进而为创制新药另辟蹊径。
2015年上市的口服治疗腹泻型肠易激综合征的药物依卢多林（1，eluxado line），是从激动阿片受体的功能出发的，按照常规思维，激动阿片受体常以镇痛为目标，便秘和成瘾性等不良反应属于避免、消除之列。而逆向思维则是扬弃该药作用于中枢的镇痛作用，利用其减弱肠道蠕动的作用，用于治疗腹泻型肠易激综合征，而且不进入中枢系统，避免了成瘾性。依卢多林可从内源性物质内啡肽出发，消除肽的骨架结构，保留激动μ受体但阻断δ受体的功能，从而消除了进入中枢的镇痛和成瘾作用。其可只作用于肠黏膜的受体，而不被吸收入循环血中，只穿肠而过。依卢多林有较高的分子量（570），结构中含有脂肪氨基和芳香羧基，形成两性离子，降低了过膜性，减少了吸收和中枢分布的概率，满足了作用于肠黏膜细胞的局部作用，其可只作用于肠道阿片受体，而无脱靶导致的镇痛作用和成瘾性。
人体Ⅰ型ether-a-go-go相关基因（ hERG 1）的钾离子通道是心脏正常动作电位去极化作用的重要组成元件，对 hERG 1的抑制可引起心电图QT波延长，导致心源性猝死，因而其已成为评价新药安全性的重要内容——避免对 hERG 1的抑制作用。如果作逆向思维，激动 hERG 1的钾离子通道，则可治疗QT波延长的症状。关键是其激动作用必须要有适当的强度，只将其控制至正常化，而不引起心室的复极化过于短促，导致心律失常。例如，KB130015（2）是由胺碘酮（3，amiodarone）改构得来的，将抗心律失常药物中的钾离子通道阻滞剂转变为 hERG 1钾离子通道激动剂。PD-307243（4）可增加 hERG 1离子流，显著降低 hERG 1的去极化作用。
沙利度胺（5，thalidomide）是20世纪60年代研发的镇静药，最初用于孕妇早期呕吐，后发现会引起胎儿严重畸形。沙利度胺具有增强T细胞和杀伤细胞介导的免疫作用，可抑制单核细胞促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子α和白介素6）的生成。但数十年来，人们的惯性思维对这些潜在作用却熟视无睹，直到2005年新基公司研发了类似物来那度胺（6，lenalidomide），作为免疫调节和抗血管生成的抗肿瘤药上市。其又于2012年上市了泊马度胺（7，pomalidomide），治疗多发性骨髓瘤。后来的研究发现，来那度胺和泊马度胺与泛素连接酶E3 cereblon有强力的结合作用，因而其已成为研制蛋白降解靶向嵌合体（proteolytic targeting chimera，PROTAC）的重要组成元件。关于PROTAC的内容将于后面讨论。
关于改换杂泛性化合物的研制目标，另一代表性的例子是由天然产物喜巴辛（8，himbacine）为先导物而成功研制的抗血栓药物沃拉帕沙（9，vorapaxar），其于2014年批准上市，用于急性冠脉综合征的二级预防，可降低心肌梗死患者血栓性心血管事件的风险。喜巴辛指木兰科植物 Galbu limima baccata 中含有哌啶的三环生物碱，早在20世纪60年代就已被发现，但直到半个世纪后的2014年由它创制的沃拉帕沙才获准上市。先灵葆雅公司起初针对喜巴辛对毒蕈碱M2受体的强抑制作用进行了研究，喜巴辛的 K i 为4.5nmol/L，比M1受体的活性强20倍，如此高的选择性预示其有药用价值。先灵葆雅公司以此研究抗阿尔茨海默病药物，然而合成的化合物活性并没有达到预定的目标。该公司随后转向研究喜巴辛抑制血小板聚集作用，其作用环节是阻断蛋白酶激活受体1（protease activated receptor 1，PAR-1）。公司改换了研制策略和目标后，成功研制出了沃拉帕沙，该药的成功还依赖于全合成的实施，不仅对取代基做了广泛的变换，还合成了骨架的手性中心的对映体。有趣的是，沃拉帕沙母核的6个手性碳与喜巴辛完全相反，这种情况在天然活性物质的改造中比较少见。
1947年，用氮芥治疗白血病开启了科学意义上使用共价结合药物治疗的先河，但其会伴随有严重毒副作用，这是因为氮芥的强亲电性和无选择性，可与体内广泛存在的亲核性物质进行无差别的烷基化，这也导致业界对共价结合药物持有强烈成见，长时间以来大多都选择回避研制共价键型的药物。
21世纪，共价结合药物开始复兴，这主要归功于结构生物学揭示了靶标的微观结构特征，使其可以在适宜的位置用适度的亲电性基团共价结合于重要的亲核性元件，因而在反应位点和作用强度上避免了脱靶性，实现了提高选择性的不可逆抑制目标。迈克尔加成基团在多种激酶抑制剂中出现，其弱亲电性只与半胱氨酸的强亲核性的巯基发生共价结合，已有不少的药物成功上市。
例如，2013年上市的伊鲁替尼（10，ibrutinib）是布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）的不可逆抑制剂，定位于激酶的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）结合腔，丙烯酰胺作为弱亲电型加成基团，与酶的Cys481相处在范德华半径内，同巯基发生迈克尔加成，形成不可逆的共价键结合，用于治疗与B淋巴细胞相关的套细胞白血病等。作用于BTK的第二代药物阿卡替尼（11，acalabritinib）也是共价结合型药物，丁炔酰胺为共价结合基团。我国百济神州公司研制的泽布替尼（12，zanubrutinib）也是BTK不可逆抑制剂，于2019年经美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准上市，口服治疗与B细胞相关的多种癌症。图0-1是伊鲁替尼（绿色）和泽布替尼（紫色）的复合物晶体结构叠合图，可以看出分子的取向和迈克尔加成基团与Cys481的位置是相近的。
图0-1 伊鲁替尼（10）与泽布替尼（12）结合模式的比较
▲扫一扫
除不饱和酰胺作为共价键结合基团外，还有其他类型的共价结合药物，如抗丙肝药物波希匹韦（13，boceprevir）和特拉匹韦（14，telaprevir）是含有α酮基酰胺的丙肝病毒NS3蛋白酶抑制剂，其邻位的酰胺增强了酮基的亲电性，羰基又与酶的Ser139发生羟醛缩合，生成了可逆性共价结合的半缩酮结构。为了保障这些共价药物与蛋白酶活性部位能够特异性结合，需要其化学结构与靶标结合部位的形状互补，通过发生多处氢键和/或疏水性结合，将共价结合基团固定在发生结合的适宜位置，并以适度的亲电性避免脱靶作用，因此在研发中结构生物学提供的微观结构信息是重要的设计依据。图0-2是波希匹韦与NS3复合物晶体结构模式图。
近年来成功研制了多款有机硼化合物药物，如硼替佐米（15，bortezomib）是蛋白酶体抑制剂可用于治疗多发性骨髓瘤。其先导物是含有脂肪醛基的寡肽（16），醛基是活泼的加成基团，脱靶性强，替换为硼原子具有首创性。硼的外层含有空轨道，可与未耦合孤电子对形成配位键，15与苏氨酸残基的羟基发生配位结合，酶的活性受到强效抑制。抗真菌药物他伐硼罗（17，tavaborole）和抗变应性皮炎药物克立硼罗（18，crisaborole）分别是真菌亮氨酰转移RNA合成酶和磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4，PDE4）抑制剂，二者也是利用硼原子空轨道的亲电性与酶发生配位键结合而制成，17与18分别在2014年和2016年获批上市。
图0-2 波希匹韦（13）与NS3复合物晶体结构模式图
▲扫一扫
沃塞洛托（19，voxelotor）于2019年获批上市用于治疗镰状细胞病（sickle cell disease，SCD），SCD是由于血红蛋白β链的Glu6变异为Val6，在低氧条件下发生四聚化，导致红细胞变形成镰刀状而使毛细血管堵塞，造成缺血和器官衰竭。沃塞洛托含有的芳香醛基是在优化先导物5-羟甲基呋喃醛（5-HMF）中保留下来的。5-HMF与突变的血红蛋白复合物的晶体结合模式提示醛基与突变体的N端Val的氨基缩合成席夫碱（Schif base），呈1∶1的化学计量结合，阻断了血红蛋白的四聚化，减少了镰状细胞的生成。19中醛基邻位的羟基对于调节醛基的亲电性和降低脱靶性有重要影响。
癌细胞为了生存而逃逸药物的制裁可通过多种机制实现，其中一个环节是靶标分子发生了突变，可逃避了药物的结合。细胞生物学和结构生物学可从微观上揭示突变体的结构差异，从而设计出针对变异的受体靶标。
例如，治疗慢性粒细胞白血病的首创性药物伊马替尼（20，imatinib），持续用药可使靶标Bcr-Abl蛋白的门户氨基酸残基Thr315变异为Ile315，使20难以与其结合而失效。2007年上市的尼洛替尼（21，nilotinib）是诺华公司研制的第二代产品，是通过合成小型目标库优化而得到的，21与20在结构上的主要区别是两个苯环间的胺酰键-HN-CO-逆向为酰胺键-CO-NH-，以及右侧苯环连接较大的取代基团，结构生物学表明，酰胺键变向的21更适配于同突变型激酶发生氢键结合，21对转染Bcr-Abl的Ba/F3细胞活性比20提高了26倍（IC 50 分别为25nmol/L和678nmol/L）。
帕纳替尼（22，ponatinib）是基于Abl T315I 变异的微观结构进行“量体裁衣”式的设计而成。蛋白的Thr315变异为Ile315，残基侧链的CH 2 OH变成CH(Me)Et，失去了OH，使嘧啶与苯环之间的-NH-不能形成氢键，20的-NH-已多余无用，而且突变后的Ile315体积较大，疏水性强，结合空间变小。22用炔键连接两个芳环，-C≡C-体积和位阻减小，并且有利于疏水结合，因而对Abl T315I 变异的瘤株抑制作用显著提高，为第三代治疗慢性粒细胞白血病的药物，于2012年上市。图0-3是伊马替尼（20）与野生型Abl结合的示意图，图0-4是帕纳替尼与Abl T315I 的分子对接图。我国亚盛医药研制的GZD824（23）也是能够克服肿瘤细胞耐药性的新一代药物，其在临床研究中对耐药的慢性髓细胞性白血病已显示出有良好治疗效果。
RAS基因家族编码的鸟苷三磷酸酶（guanosine triphosphatese，GTPase）有NRAS、HRAS和KRAS等蛋白，在细胞的生长和增殖中扮演重要角色。KRAS是最常见的肿瘤驱动基因之一，在人体癌症的基因突变中占30%，尤其在肺癌、结肠癌和胰腺癌中易发生KRAS的G12C（KRAS G12C ）残基变异。虽然以RAS为靶标的药物研究已有30多年，但因该蛋白缺乏适宜的结合腔而成效甚微，被认为是非成药性靶标。通过结构生物学和分子动力学研究发现，发生突变而隐蔽的Cys12残基会由于His95侧链的移动而被显露出来，这是以前所不知的新结合腔，因而可作为抑制剂的“抓手”，经反复筛选发现了苗头化合物，进而进行骨架迁越和结构优化，优选出sotorasib（24，AMG-510），其可选择性地结合于KRAS G12C ，分子中含有的丙烯酰胺是迈克尔加成基，可与Cys12发生共价结合，为不可逆抑制剂。图0-5是24与KRAS G12C 的结合图。24用于治疗小细胞肺癌有很高的应答率，于2021年上市，从而打破了KRAS变异的肺癌无药可治的魔咒。24结构中吡啶环的2,6-烷基被取代，形成阻转异构体， R 构型活性显著高于 S 异构体，sotorasib为 R 构型。
图0-3 伊马替尼与野生型Abl结合示意
图0-4 帕纳替尼与Abl T315I 的分子对接
▲扫一扫
图0-5 sotorasib（24）与GDP-KRAS G12C 的结合模式
▲扫一扫
其实，即使没有发生KRAS G12C 变异，RAS作为激酶也难以催化位点设计抑制剂，原因是催化磷酸化的激酶是鸟苷酸三磷酸酶（GTPase）而不是腺苷三磷酸酶（ATPase），底物GTP与GTPase的结合非常强， K i 值达pM级，所以研制竞争性抑制剂显然是非常困难的。但幸运的是，变构位点生成了半胱氨酸残基，其也成为了设计不可逆抑制剂的结构元件。
变构调节是指小分子与受体蛋白活性部位以外的区域（称作变构区或别构区）进行特异性结合，引起蛋白的构象变化而改变其活性。经变构结合而激活活性的称为正向调节，即激动剂（如酶的辅因子）；经变构结合而抑制蛋白活性称为负向调节，即变构抑制剂（allosteric inhibitor）。变构抑制剂的结合位点与靶标活性中心的位点相隔离，彼此之间没有竞争性结合，所以变构抑制剂对活性中心发生变异的蛋白仍然有效，这也为联合用药提供了选择。
变构调节剂作为药物有诸多优势，首先是提高选择性，酶或受体多存在同工酶和亚型，功能的微小差异使得结合于活性中心的化合物（正构药物）因结合同一部位而缺乏选择性作用，而变构结合腔则各有不同，避免有脱靶作用。另外，有些靶标的活性腔结构特殊，成药性差，如结合于磷酸酶活性中心的化合物难以过膜进入细胞内起效，而变构抑制剂可回避强极性分子。此外，一些靶标的活性中心因功能“娇嫩”，窗口窄小，难以调节“无过无不及”的作用，而变构抑制则容易控制，可达到精准治疗。
上节叙述的Abl1激酶存在变构区域，处于C端半段处，天然变构底物豆蔻酸（正十四烷酸）为正向调节剂，参与酶功能的自调节作用。诺华公司根据伊马替尼-Abl1晶体结构的特征，通过基于片段的分子设计（FBDD）发现了与豆蔻酸竞争结合于变构区的先导物，用磁共振 15 N， 1 H-HSQC分析了化合物与激酶的作用，测定C端螺旋的Val525的信号变化，以评价结合状态，经构效分析优化出候选物阿西米尼（25，asciminib），对重组Bcr-Abl1的Luc-Ba/F3细胞生长半数抑制率（IC 50 ）野生型和T315I突变型分别为1nmol/L和25nmol/L，Ⅲ期临床试验表明对晚期肾癌有效，已批准上市。图0-6显示了变构药物阿西米尼（25）和正构药物尼洛替尼（21）与Bcr Abl1结合位点的区别，前者结合于变构区，后者占据ATP结合区。
抑郁症是严重的精神性疾病，女性在妊娠晚期和分娩后时有发生，发病率较高，是产妇自杀的首要原因。γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）结合于γ-氨基丁酸A（GABA A ）受体活性中心，若功能失调，会发生多种神经系统疾病，如精神病、癫痫、睡眠障碍等。GABA A 受体有5个亚基聚集的离子通道，不同的亚基构成决定通道的生理功能和在突触或突触外的定位差异。
图0-6 阿西米尼（25）与变构区的结合模式
▲扫一扫
内源性活性类固醇如别孕烷醇酮（26）是内源性孕烷类神经类固醇，通过结合于GABA A 受体的变构位点，对GABA A 受体作正向变构调节，影响大脑神经元回路，调节行为状态。机体利用孕激素的代谢物反映了内源物（或其代谢物）高效率的利用。26的变构调节对上述疾病有治疗作用。美国Sage公司深入研究了26的变构调节特征，可将GABA A 受体活性调节到适宜的水平，26定名为布瑞诺龙（brexanolone），2019年经美国FDA批准用于临床静脉滴注治疗产后抑郁症。Sage公司进而研制口服的GABA A 受体变构调节剂，sage-217（27）对突触和突触外GABA A 受体的变构位点都有良好的调节作用，已进入Ⅲ期临床研究。
脂肪酸代谢失调包括脂肪酸合成（FASyn）的增多和脂肪酸氧化降解（FAOxn）的减少，导致多种代谢性疾病的发生，如胰岛素抵抗和非酒精性脂肪肝等。乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）是脂肪合成和氧化分解的限速酶。ACC蛋白由3个功能域构成：生物素羧化酶域（BC），生物素羧基载体蛋白域（BCCP）和羧基转移酶域（CT），CT催化乙酰辅酶A（Ac-SCoA）生成丙二酰辅酶A（-OOCCH 2 CO-SCoA），是脂肪链延长的限速步骤（图0-7）。ACC有两种组织特异性亚型：ACC1和ACC2。ACC1在富含脂质的组织如脂肪和肝中表达，催化脂肪的生成；ACC2表达于氧化组织（如肌肉）的线粒体膜上，功能是通过抑制肉碱棕榈酰转移酶（carnitine palmotoyl transferase，CPT）对线粒体摄取脂肪酸作负性调控，CPT负责将脂肪酸的酰基偶联到肉碱上，以穿越线粒体膜进行β-氧化，所以抑制ACC1/2可同时减少脂肪酸的生成和增加脂肪酸的氧化降解。
图0-7 ACC蛋白功能域及其功能示意
▲扫一扫
真菌的代谢产物soraphen A（28）是ACC1/2的强效抑制剂，但未能成药。基于28与人ACC2-BC的晶体结构，Harriman等经虚拟筛选得到高分子的250个化合物，通过ACC1和ACC2活性测定，发现了化合物29（ND-022）有初步活性，29与ACC2BC晶体结构显示与28有相似的结合模式（图0-8），经结构优化得到firsocostat（30），抑制ACC1/2的 IC 50 为2～6nmol/L，而对100多个酶受体或离子通道没有活性（＞10μmol/L），显示高选择性作用。临床研究表明，30可降低患者肝脂肪含量、降低肝纤维化以及肝生物化学标志物水平。图0-9是30与人ACC2-BC晶体结构的分子对接图。
图0-8 化合物29与人ACC2-BC复合物的共晶结构与soraphen A（28）同人ACC2-BC复合物结构叠合
图0-9 firsocostat（30）的酰胺与人ACC2-BC晶体结构分子对接
▲扫一扫
SHP2是非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶，遍布于细胞中调控细胞分化和存活，主要通过激活RAS-ERK信号通路实现，也是程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）的关键因子。SHP2是由SH2 N域、SH2 C域同磷酸酶三元组合而成，SH2域闭合则磷酸酶呈自抑制状态，打开则呈活化状态，SHP2突变则呈持续的活化状态，引起多种癌症，如白血病、肺癌和乳腺癌，所以抑制SHP2是研制抗癌药物的靶标。既往研究的抑制剂多为结合于磷酸酶的活性中心，抑制剂多有电荷存在而难以进入细胞中。SHP099（31）是诺华公司研制SHP2的变构抑制剂，晶体结构表明可同时结合于SH2 N端、SH2 C端和磷酸酶的变构区，将SHP2锁定为闭合状态，因而有“分子胶”之称，抑制剂中没有持久性电荷，可以口服吸收，IC 50 为0.071μmol/L，通过切断RAS-ERK信号通路抑制癌细胞生长。图0-10是31与SHP2的结合模式，通过在变构区形成的氢键网络将SHP2固定为非活化的构象。
图0-10 SHP099（31）与SHP2变构区的结合模式
▲扫一扫
大环小分子药物是药物研发的一个新的策略。鉴于已有的大环药物（环肽和大环内酯）与通常的药物的性质不同（如超出类药五原则的范围），因而在可药性较差的靶标（如干扰蛋白-蛋白相互作用）的药物研究中很重视大环化合物。大环药物的分子量多为500～1000，弥补了常规药物分子量小、结合强度不够的不足，而环状结构限制分子成某种构象，降低了开链的结合自由能（熵贡献）。此外，肽链成环还提高了过膜性，是因为构象的改变使表面积缩小，分子内氢键也有利于过膜。大环化合物改变了分子柔性、形状和表面积，使得过膜性、稳定性和对靶标的选择性都提高了。
2011年上市的克唑替尼（32，crizotinib）对间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）与核仁磷蛋白（nucleophosmin，NPM）的融合蛋白有强效抑制活性，抑制细胞活性IC 50 为20nmol/L。ALK融合蛋白是发生间变性淋巴瘤、炎性肌成纤维细胞瘤和非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）的关键酶，32是以ALK为靶标的治疗NSCLC的首创口服药物。然而32存在续贯使用出现耐药性和难以进入中枢神经系统的缺点（NSCLC常发生脑转移），辉瑞公司继续研制能克服耐药性和能够透过血脑屏障治疗脑转移的新一代ALK抑制剂。发生耐受的患者ALK激酶与32的复合物共晶显示，多位点发生了残基变异或插入，如图0-11列出的突变和插入位点，其中L1196M、G1269A和G1202R原本都是直接与32接触的残基，L1196是门户氨基酸残基，是最容易发生变异的“守门员”。
图0-11 ALK-克唑替尼复合物晶体结构和ALK突变位点
▲扫一扫
32与ALK共晶的重要提示是分子的结合构象呈“U”字形的弯曲构象，两个苯环靠近，空间上的接近可以将这两个苯环连接成大环结构以固定该活性构象。设计中环的大小、原子的种类通过分子模拟做预测，经合成、活性评价和构效关系（structure activity relationship，SAR）分析，最终得到了选择性抑制变异的ALK的大环药物劳拉替尼（33，lorlatinib），于2018年获批准上市。图0-12是由32的类似物演化成劳拉替尼（33）的示意图。
抗丙肝药西咪匹韦（39，simeprevir）也是大环化合物，于2013年上市。39作用靶标是丙肝病毒的蛋白酶NS3，NS3的功能是裂解结构性原蛋白使其成熟化，裂解产物六肽（34）却是NS3抑制剂。研制者以34为起始物，在结构和分子生物学指引下，经剪裁、非肽化和SAR分析，依次消除P6和P5的二肽，N端氨基乙酰化，变换C端为环丙基甘氨酸和脯氨酸萘甲氧基化得到35。为了提高分子的亲脂性，将脯氨酸母核变换成环戊二酸，异丙基变成叔丁基，萘环修饰成取代喹啉片段和环丙基的乙烯化获得36，P3片段简化成环戊脲基获得37，结构生物学表明，37的环戊基与C端的乙烯基位置接近，从而将环戊基与乙烯基融合连接成脂质性大环化合物38，同时将必需的酸性基团换成酰胺磺酰片段，-NH-的两边存在吸电子基团使之有弱酸性，模拟了原来C端的羧基，并调整了化合物的极性，用作钠盐；再修饰喹啉环，得到高活性和选择性的NS3蛋白酶抑制剂，即抗丙肝药西咪匹韦（39）。结构演化中每一个环节（箭头表示）包含着多轮的合成、评价和构效分析。
图0-12 由32的类似物得到劳拉替尼（33）的演化过程
百时美施贵宝（Bristol-Myers Squibb，BMS）公司研制抗血栓药物，靶标是凝血过程的生物化学级联反应中的两个环节：凝血因子FⅦa和FⅪa，这两个蛋白酶在凝血和血栓形成中扮演重要角色。出血和凝血（或发生血栓）是研制凝血酶抑制剂的两个对立面，过分抑制，可能引起出血。这两个凝血酶在血液中的高水平有发生心肌梗死和深静脉血栓形成的危险，而低表达则导致出血倾向，因此，FⅦa和FⅪa抑制剂应是出血风险低的抗血栓药物。BMS公司便以大环化合物为研发目标。
研究发现活性较高的先导化合物40结合FⅦa的 K i 为8.0nmol/L，为含有氨基异喹啉（P1）和无取代的苯环（P2）化合物。共晶结构提示P1进入S1腔中，氨基与Asp189 侧链形成盐桥键，还与Tyr228芳环上的羟基形成氢键。中间的酰胺片段与His57咪唑环和Ser195 的羟基形成氢键网络。P1′和P2的苯基发生疏水折拢，与S2的His57、Trp215和Thr99发生范德华作用。乙酰苯胺基的-NH-经结构水分子的氢键与Asp60 侧链相结合。重要的是，乙酰氨基的甲基接近于P2的苯基，可为构建大环提供连接位点。图0-13是40与FⅦa的共晶结构图。
大环的尺寸大小、组成环的元素种类对于环的构象和结合强度有很大影响，虽然有共晶结构和分子模拟，仍需经构效关系分析做结构优化。化合物41活性比较高，图0-14是41与FⅦa的共晶结构图，结合模式与40相同。图0-15是叠合41与40在共晶结构中的分子结构，可以看出基本可以重叠。
图0-13 化合物40与FⅦa结合的共晶结构
注：相互靠近的P1′ 的乙酰氨基和P2苯基有助于形成大环（双箭头所示）。
▲扫一扫
图0-14 化合物41与FⅦa的共晶结构
▲扫一扫
图0-15 化合物40和41结合于FⅦa的叠合
▲扫一扫
41为 R 构型，使得P2处的苯环和大环进入FⅦa疏水腔中。分子模拟发现 S 构型不能发生疏水相互作用，进而对P2的苯环上取代基和磺酰基进行优化，优化出的化合物42活性 K i 为1.6nmol/L，离体部分促凝血时间的活性aPTTEC 1 .5x为1.2μmol/L，对其他与凝血相关的因子抑制作用很低，显示很高的选择性，而且口服生物利用度和在血浆中的稳定性也较好。42的大环有两种稳定的低能构象体，比例为1∶1，动力学研究有待于确定优化出更强的化合物。
沿着凝血过程，BMS公司研制抗血栓药物的另一个靶标是FⅪa，也是级联反应的一个重要节点。通过先导物的优化得到化合物43，与FⅪa的结合常数 K i ＝5.8nmol/L，离体部分促凝血时间的活性aPTTEC 1 .5x＝5.3μmol/L。
图0-16为化合物43与FⅪa的共晶结构，43的高活性是由于多个杂原子参与了同FⅪa 酶活性中心的氢键结合（虚线所示）。两个苯环在空间上接近，确定为形成大环的位点（双箭头所示）。
图0-16 化合物43与FⅪa的共晶结构
▲扫一扫
通式44与 FⅪa是用亚烷基（X=CH 2 ）或氧亚烷基（X=O）连接成12和13元环（ n ＝1,2），大环内有或无双键，省去1个苯环，咪唑环作不同基团的取代，经多次SAR分析辅以共晶结构的引导研究，优化出化合物45， K i ＝0.16nmol/L、aPTTEC 1 .5x＝0.27μmol/L。
图0-17是45与FⅪa的共晶结构，大环中的-CONH-与Leu41发生氢键结合，环中的反式双键使处于S1′ 域的大环构象处于适宜的空间，避开了与Cys42-Cys58的二硫键发生位阻作用。45的口服生物利用度较低，结构仍需优化。
图0-17 化合物45与FⅪa晶体结构
▲扫一扫
安进公司研制的AMG-176（46）是针对诱导性髓细胞性白血病（myeloid cell leukemia，MCL）细胞分化蛋白MCL-1的抑制剂，具有促进细胞凋亡和抗癌活性，MCL-1蛋白的可药性很差，长时间未能发现适宜的活性化合物。46可高活性地结合MCL-1， K i 值0.13nmol/L，是第一个抑制MCL-1/Bcl-2样蛋白11生成的抑制剂。现处于临床研究阶段，口服治疗髓细胞性白血病。
药物的宏观性质包括生物药剂学和药代动力学内容，药物的溶解性和过膜性与药物的吸收、分布、代谢、排泄密切相关，除了代谢转化可与特定的结构关联，其余性质都可体现在药物分子的宏观性质之中。溶解性是指在水中的分子分散能力，过膜性是分子穿越脂质性生物膜的能力，要求有一定的脂溶性，所以溶解性与过膜性既对立又统一，可理解为分配性。吸收、分布和排泄都涉及（多次）过膜过程。以靶标为中心的药物研究，对其在组织器官中分布的预测，大多是盲区，只能是“打哪儿指哪儿”。利用生物学原理提高药物对组织器官的靶向性，近年来有显著的进展，一定程度上实现“指哪儿打哪儿”。
为提高溶解性在分子结构中加入助溶基团或片段是熟知的方法。基于结构生物学的提示，助溶基团可连接在“次要”部位，避免干扰微观结构与靶标的结合。例如，治疗非小细胞肺癌的吉非替尼（47，gefitinib），是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂，结合于酶的ATP结合位点，共晶结构显示，喹唑啉环的6,7位在酶的开口处，所以连接的吗啉丙氧基没有与酶结合，而是进入水相，起助溶作用（可成盐）。第三代的EGFR酪氨酸激酶抑制剂来那替尼（48，neratinib），靶向干扰乳腺癌细胞的HER2蛋白，进而阻止癌细胞生长，是EGFR酪氨酸激酶的不可逆抑制剂。由于酶的开口处有Gys残基，与6位距离接近，6位侧链含有碱性的二甲胺基团（助溶基）和不饱和酰胺，后者为弱迈克尔加成基团，可与Cys的巯基发生迈克尔加成反应，形成共价键结合，因而成为作用更强的药物，所以6位的侧链既是实现不可逆结合的元件也是助溶性基团。
图0-18 伊马替尼与Bcr/Abl结合模式（甲基哌嗪接近溶剂相）
伊马替尼（20，imatinib）是Bcr/Abl编码的蛋白酪氨酸激酶抑制剂，治疗慢性粒细胞白血病。结构中甲基哌嗪原是作为助溶性基团，后来共晶结构发现外端的氮质子化后与His361骨架的羰基发生氢键结合，所以既有助于溶解也利于结合（图0-18）。
传统的前药设计多以化学理念所驱动，如对不利于溶解、过膜或不稳定的结构作暂时的可逆性屏蔽加以克服。如今应用生物化学和酶学原理设计前药不乏成功的范例。有代表性的是抗丙肝药索非布韦（49，soforbu vir）。我们下面以49的结构演化过程加以解析梳理。
为了研制RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）抑制剂，吉利德公司认定2′,2′-双取代的戊糖可能对丙肝病毒的RdRp有选择性作用，连接的碱基是尿嘧啶而不是胞嘧啶，是为了避开胞苷在体内容易氧化脱氨的不稳定性，索性设计为2′-F-2′-CH 3 双取代的尿苷。其实，RdRp的抑制剂是RdRp的（假）底物，需要三磷酸化的活化形式参入到病毒的RNA链中成为抗代谢物。核苷的第一个磷酸化是限速步骤，而尿苷恰恰不能被激酶催化生成一磷酸尿苷，为此预构成5′-一磷酸-2′-F-2′-CH 3 -尿苷，但后者含有两个负电荷，不利于过膜吸收和体内传输，须要以前药形式作暂时性掩盖：一个负离子制成苯酯，另一个为L-丙氨酸的磷酰胺，苯酯和磷酰胺都是化学稳定的基团。丙氨酸安全无毒性，却又带出一个羧基，为此优化制成异丙酯。49有良好的口服生物利用度，吸收后在肝脏被酯酶水解掉异丙醇，羧基负离子SNi进攻磷原子，离去苯酚，形成环状磷酰胺，后者被肝细胞中特定的核苷酸结合蛋白HINT1水解N-P键，脱去丙氨酸成一磷酸核苷，然后在肝脏相继发生两次磷酸化成活化形式抑制病毒核酸的合成。这个活化过程全部是在肝中完成的，“就地”抑制丙肝病毒。49成为治疗丙肝患者的有效药物。
吉利德公司利用该前药平台技术还研制了冠状病毒的RdRp抑制剂瑞德西韦（50，remdecivir），对严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）病毒、中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）病毒、埃博拉病毒（Ebola virus）和新型冠状病毒有显著抑制活性，已于2020年被美国FDA批准上市，治疗新型冠状病毒肺炎。
抗体偶联药物（antibody drug conjugate，ADC）是抗体与毒性小分子经连接域形成的共价结合的药物，目前研发的都是抗肿瘤药。不同的肿瘤表面抗原不同，只能同其特异的抗体结合，这种特异性的识别和结合，是由于结构上广泛的互补性结合所致。ADC利用抗体导向肿瘤细胞表面抗原的特性，精准地输送到肿瘤病变处，避免对正常细胞的脱靶性。在ADC中抗体可视作具有导向的运载体。上市的抗肿瘤ADC准确度高，但对癌细胞的杀伤力不强，ADC是把抗体分子偶联小分子毒性化合物，后者是杀伤癌细胞的“弹头”。所以抗体履行了药物代谢的（细胞）吸收和分布，“弹头”实现药效。
抗原蛋白不仅结合抗体，还引发细胞对ADC的吞饮作用，将ADC摄入瘤细胞内，经细胞质的内吞体（endosome）和溶酶体（lysosome）裂解释放出毒性分子，实施对肿瘤细胞的选择性杀伤，所以ADC还得有可降解的释放性。图0-19简要描述了ADC的摄入和释放过程。
图0-19 抗体偶联药物的作用模式
ADC既含有细胞毒性分子以杀伤细胞，又有重组单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）实现高度的靶向性、稳定性和有利的药物代谢动力学特征，主要表现为治疗效力强；特异性高；免疫原性弱，不容易产生抗药性；血清中循环时间长；对非靶标毒性弱等，是类靶向递送治疗药。
ADC分子由抗体，毒性分子和连接域3部分组成。肿瘤细胞的抗体必须是安全和特异的，因而目前研制ADC的抗体都是已批准上市的抗体分子。抗体须作化学修饰以共价结合于连接域，并仍保持对抗原的识别，每个抗体载药的化学计量比和分子均匀性也是抗体偶联药物安全性和药效的决定因素，偶联的毒性分子偏少，杀伤作用不强；偶联过多，会阻挡并影响抗体的识别，通常1个抗体分子连接3～8个毒性分子，以优化结果确定。此外还有稳定性和可重复性等，因而ADC包含许多技术问题和规模制备的瓶颈。毒性分子通常是细胞毒性化合物，可以不是已批准的药物，也不拒绝高毒性分子。一些已批准上市的ADC的毒性分子，都是多年来研究的抗肿瘤成分，未获批准，而在ADC中得到了应用。连接域是共价连接抗体和毒性分子的桥梁，要求不影响抗体和毒性分子的活性，化学性质稳定，而在靶细胞内可裂解释放出毒性分子，药物化学的技术要求很高，本文不拟深入讨论。
以ADC药物维布妥昔单抗（51，brentuximab vedotin）为例简析ADC的组成和作用过程。51是2012年上市的第一个ADC，用于治疗霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。这个药物是抗CD30的IgG抗体本妥昔单抗（brentuximab）和抗微管蛋白的小分子化合物单甲基奥瑞他汀E（MMAE）通过可被蛋白酶裂解的连接基共价连接而成。51通过结合抗原CD30，胞吞到细胞里，运送到溶酶体，把连接域的肽键剪切掉，将MMAE游离出来，与细胞的微管蛋白强效结合，阻滞细胞周期于G2，导致细胞凋亡。
截至2019年底，美国FDA批准上市的ADC有7个，表0-1列出了名称、组成和适应证。本文对有代表性的毒性分子作简要介绍。
表0-1 美国FDA批准上市的ADC
美坦新曲妥珠单抗（52，trastuzumab emtansine）是针对实体瘤的ADC，治疗HER2阳性的转移性乳腺癌。其组成是结合于HER2/neu蛋白的曲妥珠单抗（trastuzumab），经含有硫代琥珀酰亚胺片段的连接域与美坦新（maitansine）共价键结合。美坦新是从美登木植物分离的大环生物碱，结合并阻止微管蛋白聚合，终止细胞有丝分裂。单独应用虽然活性很高，但选择性差（神经和胃肠道毒性），所以这个古老的生物碱未能成药。ADC使用了美坦新，对癌细胞靶向递送并在癌细胞内释放出来，达到精准治疗。
吉多珠单抗奥佐米星（53，gemtuzumab ozogamicin）是以CD33为靶标的单抗，经连接域同奥佐米星（ozogamicin）缀合而成，临床用于治疗急性髓细胞性白血病（AML）。连接域中含有腙和二硫键。毒性分子奥佐米星是含有烯二炔的抗生素，结构中的共轭烯二炔是比较稳定的片段，但在细胞内亲核基团进攻下，电荷转移形成1,4-失氢苯二自由基，性质极其活泼，与DNA双螺旋的小沟发生交联结合，使癌细胞凋亡。这些烯二炔类高细胞毒性分子的抗生素研发多年都未获成功，而纳入ADC的组成，发挥出高活性的潜质，实现了成药性。
fam-trastuzumab deruxtecan-nxki（54）是结合于CD79的ADC，治疗无法切除或转移性HER2阳性乳腺癌患者。deruxtecan是喜树碱衍生物DX-8951，与连接基的缀合物，是将马来酰亚胺-GGFG预构于羟乙酸片段上，ADC被细胞胞吞后，溶酶体水解酰胺键，游离出DX-8951（和连接基甲醛），作为拓扑异构酶Ⅰ强效抑制剂，使癌细胞凋亡。
从药物化学视角，对癌细胞有较大杀伤作用的细胞毒性物质如化疗药物、细胞毒素、放射性核素等都可以作为 ADC的毒性片段加以偶联，所连接的毒性片段须具备以下几个特征：①作用机制明确。②细胞毒作用极高。③可以被修饰和与连接基团共价连接，化学性质稳定，也容易在细胞内酶促释放呈现活性。④ADC在溶液中稳定存在并充分溶解。
上节讨论的ADC也可视为将大分子作为精准递送装置的前药，将药物甚至毒性分子运送到靶细胞内。某些小分子也可起到递送作用。一些肿瘤为了增殖和生长，在膜上高表达某种蛋白（受体），以结合并摄入比正常细胞更多的物质。小分子偶联药物（small molecule drug conjugate，SMDC）就是利用癌细胞高表达蛋白的配体（或其类似物），经共价连接偶联效应分子（药物、毒物或放射性核素等），实现由小分子导向递送活性成分到细胞内起到杀伤作用的目的，所以SMDC和ADC的设计原理是相同的。
癌细胞无控制地增殖需要比正常细胞更多的核酸和蛋白，核酸碱基和甲硫氨酸的从头（ de novo ）合成需要一碳单元的供给，来源是四氢叶酸，叶酸的主要功能是作为从头合成核酸碱基的一碳单元的供体，因而癌细胞需要摄取更多的叶酸。强极性的叶酸分子是靠与叶酸受体（folate receptor，FR）结合并转运进入细胞，FRα在肿瘤组织的表达高于正常细胞，因而可用作肿瘤治疗和诊断药物的设计依据。
vintafolide（55）是叶酸与长春碱经连接域共价结合的偶联物，旨在提高长春碱对肿瘤的选择性杀伤作用。55是默沙东公司从Endocyte公司购入的处于后期开发阶段的卵巢癌候选药物。在Ⅱ期临床试验中显示出对卵巢癌和非小细胞肺癌的安全有效性，但Ⅲ期临床试验未达到对耐受铂制剂的卵巢癌患者预定的终点，终止了研发。
与治疗药物配套的诊断制剂 99 Tc-etarfolatide（56，代号EC20）也是以叶酸为导向的SMDC，56是连接基与叶酸和螯合了 99 Tc的三肽的偶联物，用于全身成像的肿瘤诊断药，指导给药方案。
神经内分泌肿瘤和小细胞肺癌细胞表面高表达生长抑素受体2（somatostatin receptor 2，SSTR2），是为了结合并摄入生长抑素（somatostatin，SST）到癌细胞内。SST是由14个氨基酸组成的环肽，是机体的正常成分，具有抑制生长激素释放的作用，半衰期很短（ t 1/2 ＝2～3min）。经结构简化，奥曲肽（57，octreotide）与天然的SST 有相同的药理作用， t 1/2 ＝90min，静脉注射对生长激素释放的抑制作用是天然SST的70倍，是治疗消化系统疾病的重要上市药物。
基于奥曲肽是SSTR2的强效配体，用作SMDC的载体与美坦新经连接域共价结合，形成的化合物代号为PEN-221（58），用于治疗神经内分泌肿瘤和小细胞肺癌。这类肿瘤细胞表面高表达SSR2，58在奥曲肽的引领下富集在癌细胞上，经胞吞后释放出强效细胞毒作用的美坦新而杀伤肿瘤。58目前处于临床试验阶段。
革兰阴性菌细胞膜由外膜和内膜双层结构构成，比只有一层膜的革兰阳性菌更难以摄入药物，因而抗革兰阴性菌的药物较少。细菌增殖、生长需要从宿主细胞摄取铁离子，是靠细胞壁上的载铁蛋白摄入到菌体内。Ito等利用该蛋白的嗜铁属性，将Fe 3+ 螯合在含有儿茶酚结构（Fe 3+ 的螯合片段）的头孢菌素上，研发出cefiderocol（59）。螯合的铁离子被载铁蛋白结合并摄入，携带着的抗菌的头孢菌素也进入菌体内，后者与青霉素结合蛋白作用，阻断细胞壁的合成而杀死细菌。59对多种需氧革兰阴性菌（包括多药耐药菌）抑制50%活性的最低浓度（50% minimum inhibitory concentration，MIC 50 ）＜2μg/ml，具有可克服碳青霉烯类耐药性的3种主要机制（孔蛋白通道改变、β-内酰胺酶失活、外排泵过量产生）的独特能力。Ⅲ期临床试验显示对复杂尿路感染以及难治的肠道感染疗效显著，59于2019年经美国FDA批准上市。
放射性核素肽受体介导治疗（peptide receptor radionuclide therapy，PRRT）是通过放射性核素标记肽与分子靶标的特异性结合，向肿瘤细胞递送辐射源的治疗方法。传统的放射治疗是将放射性核素发射的射线从外部照射聚焦于肿瘤部位，达到治疗目的。PRRT则是放射性核素螯合在活性肽的分子上，活性肽以高度的亲和力与肿瘤细胞的相应受体结合进入细胞中进行内照射，达到精确的放射治疗效果。
奥曲肽对高表达生长抑素受体的亲和力是PRRT的成功范例，2018年诺华公司上市的奥曲肽镥-177（60， 177 Lu-dotatate），用于治疗肠道神经内分泌瘤。设计原理是放射性核素 177 Lu与双功能螯合剂N′,N′′,N′′′,N′′′′-四羧甲基四氮杂环癸烷（DOTA）形成强效螯合物，后者与Tyr3-octreotide（奥曲肽的3号氨基酸残基为酪氨酸）经连接域共价结合而成（60），奥曲肽片段引导60递送到生长抑素高表达的肿瘤部位，经胞吞摄入胞内，实现肿瘤细胞内的放射治疗。
DOTA还可螯合不同的放射性核素，如 68 Ga-dotatate（61）富集于高表达SSTR的肿瘤部位组织，用于正电子发射断层显像（positron emission tomography，PET）或计算机断层扫描（computer tomography，CT）造影，是用60治疗前的诊断试剂。
上述的抗体偶联药物和小分子偶联药物的设计策略，是利用抗体对抗原的特异性、小分子配体对高表达的靶标蛋白的高亲和力，把本来没有组织分布特异性的毒性效应分子携带到作用靶标处，赋予其选择性杀伤作用，抗体或小分子给效应分子以选择性助力。下一节讨论的是利用体内分解蛋白的蛋白酶体，用双功能小分子把目标蛋白招募到蛋白酶体处，彻底降解病原蛋白，这种双功能分子助力降解目标蛋白的策略就是蛋白降解靶向嵌合体技术。
蛋白酶体（proteosome）是细胞内负责将受损伤的或错误蛋白降解成寡肽碎片而加以清除（或再利用）的酶蛋白，蛋白降解靶向嵌合体（proteolytic targeting chimera，PROTAC）技术是用小分子诱导蛋白酶体彻底摧毁目标蛋白的结构与功能，而不是暂时性抑制作用，PROTAC是利用生物学原理生物化学降解目标蛋白的一种技术。
被蛋白酶体降解的目标蛋白需要预先泛素化，即连接一定数量的泛素蛋白后才能被降解，泛素化必须要求E1、E2和E3等酶系的级联反应完成，其中限速步骤是泛素连接酶E3的作用。人体有600余种E3，特异性催化目标蛋白的泛素化。目前用于PROTAC的E3不到10种。
PROTAC分子是双功能小分子，一个功能是具有结合E3连接酶的能力，将E3募集到自身附近；另一个功能是识别并结合目标蛋白，从而将本不相关的E3连接酶和目标蛋白拉近而发生泛素化，经泛素化的目标蛋白被蛋白酶体识别为底物而启动降解，彻底淬灭目标蛋白的功能。
PROTAC是介导E3连接酶将目标蛋白泛素化的化学诱导剂，三元体促成目标蛋白的泛素化，成为蛋白酶体降解目标，达到治疗的目的。PORTAC分子扮演招募的角色，本身无杀伤作用，募集过程中理论上没有消耗，犹如催化剂。图0-20是蛋白酶体-PROTAC-目标蛋白降解的示意图，是以事件驱动的降解目标蛋白的药理过程，有别于传统药物分子以占据目标蛋白的受体而抑制其功能的药理过程。
目前研究的目标蛋白多是发生突变的靶标蛋白和可药性低的靶标，如与癌症相关的受体蛋白发生突变，使原有“占据性”的药物失去活性，代以“过程性”的PROTAC降解这些蛋白。因而，常以现有的药物或活性化合物作为配基元件，经改构作为PROTAC的组成部分，如雌激素受体调节剂“昔芬”、雄激素受体调节剂“鲁胺”和激酶抑制剂“替尼”类药物多作为相应靶标的PROTAC的组成部分。
PROTAC结构中募集E3连接酶的配体大多是经筛选得到的，目前种类尚不多。例如，具有E3功能的cereblon的配体是“度胺”类邻苯（二）甲酰亚胺类药物，最早作为募集剂对IKZF1和IKZF3的转录因子进行泛素化被蛋白酶体降解，现已用于研制降解溴域蛋白（BRD2/3/4）、FK结合蛋白（FKBP12）、Bcr-Abl蛋白、Sirt2、CDK9、FLT3、BTK、ALK和组氨酸去乙酰化酶6（HDAC6）的PROTAC分子中。
von Hippel-Lindau（VHL）E3连接酶的发现源于缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）能够结合VHL，从而构建了多肽作为VHL结合剂，进一步演化为含有羟脯氨酸的非肽分子，如VH032。VH032已用于研究选择性雌激素受体降解剂（selective estrogen receptor degrader，SERD）的PROTAC、HaloTag 融合蛋白、Bcr-Abl、溴域蛋白4（BRD4）、TBK1 以及跨膜激酶。
结合于转录因子p53（一种抑癌蛋白）的MDM2是E3连接酶，发现小分子nutlins类化合物［如（-）-nutlin 3和idasanutlin］占据MDM2的结合腔，只阻止MDM2与p53的结合，但不影响其E3连接酶的活性，从而作为构建PROTAC的元件，Crews 率先设计合成了以（-）-nutlin3为E3招募元件的PROTAC，作为选择性雄激素受体降解剂（selective androgen receptor degrader，SARD），nutlin还用于裂解与肿瘤相关的溴域蛋白4（BRD4）的PROTAC。
细胞凋亡抑制蛋白1（cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP1）也是E3连接酶，相应的小分子招募配体methyl bestatin用作PROTAC的元件。
图0-21列出了代表性的用于设计PROTAC的招募E3连接酶的配基元件。
为了治疗去势抵抗性前列腺癌而又耐受雄激素受体（androgen receptor，AR）阻断剂的患者，Han等研究AR的PROTAC降解剂，以“鲁胺”类AR阻断剂为结合AR的配基，分析了恩杂鲁胺（62）和其他AR阻断剂与雄激素受体的共晶结构，发现连接胺酰基的苯环未同受体接触，处于溶剂相，因而以此作为连接位点连接招募E3连接酶VHL的配体，对连接基做多轮优化，得到了化合物63，对高表达AR的人前列腺癌细胞（LNCaP）的IC 50 为2nmol/L，而对照的AR阻断剂恩杂鲁胺（62）的IC 50 为150nmol/L。
图0-21 E3连接酶的代表性招募剂
Arvinas公司已有两个PROTAC候选物进入临床研究。ARV-110（64）是口服选择性雄激素受体降解剂（SARD），用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）。64也是由E3连接酶VHL配体和雄激素受体阻断剂“鲁胺”类似物经连接基结合而成，能选择性地靶向阻断雄激素受体蛋白，使其发生降解。在临床前模型中，无论是AR突变，还是过量表达（均为AR靶向疗法失效的常见原因），64都显示出良好的降解效果。
另一正在临床试验的化合物是ARV-471，为口服选择性雌激素受体降解剂（SERD），治疗α雌激素受体（野生型和突变型）呈阳性的乳腺癌患者。
Bruton酪氨酸激酶（BTK）在B细胞的发育、分化和信号传导中起重要作用，B细胞肿瘤中BTK过高表达，因而BTK是研制B细胞肿瘤的药物靶标。已有的药物是伊鲁替尼（65，ibrutinib），2013年批准上市治疗套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。65分子中含有迈克尔加成基团，与BTK的Cys481发生共价结合，故为不可逆抑制剂。然而伊鲁替尼治疗过程会诱发肿瘤变异，Cys481变异为Ser481，失去了Cys 巯基与迈克尔基团发生的亲核加成能力而失效。
Sun等优化的P13I（66）为降解BTK的PROTAC分子，是由伊鲁替尼的类似物与泊马度胺（pomalidomide，结合E3连接酶cereblon的配体）经乙二醇片段连接而成。实验表明66对野生型和C481S变异的淋巴瘤细胞的BTK有高效抑制作用，IC 50 均为nmol/L水平，可有效地抑制BTK发生C481S 变异的HBL-1细胞增殖，而对其他激酶几乎没有活性，提示66提高了对野生型和变异型BTK的选择性杀伤作用。
溴域蛋白4（BRD4）在多种肿瘤高表达，是肿瘤治疗药物的靶标，噻吩并三唑并二氮䓬化合物（如OTX015）是BRD4的配基，Lu等将其E3降解酶cereblon的配基泊马度胺经聚乙二醇连接，获得的化合物67（代号ARV-825）可诱导蛋白酶体选择性降解BRD4蛋白，IC 50 ＜1nmol/L。65可降低Brukitt淋巴瘤细胞中C-myc水平，阻断细胞增殖，并诱导凋亡。体外实验加入来那度胺可阻断65的降解作用，是因为竞争性地结合cereblon，阻止了BRD4的泛素化作用。
Wang等为研制选择性雌激素受体降解剂（SERD），用雷洛替芬作为α雌激素受体（ERα）的配基，VHL配基募集E3连接酶，通过SAR分析优化连接基的长度和组成，得到高活性的Erα降解剂ERD-308（68），对MCF-7和T47D ER＋乳腺癌细胞的DC 50 （蛋白降解50%的受试物浓度）分别为0.17nmol/L和0.43nmol/L。
第一代EGFR激酶抑制剂吉非替尼用于治疗非小细胞肺癌已近20年了，治疗中因酶突变逃逸抑制而失效。Cheng等将吉非替尼6位侧链的吗啉环（不参与同激酶结合的助溶基团）变为哌嗪作为设计PROTAC的连接位点，用VHL配基或沙利度胺分别作为E3连接酶VHL和cereblon的招募基，通过系统的SAR分析，优化出MS39（69）和MS154（70）两个PROTAC分子，与突变型的EGFR L858R 结合的 K i 值分别为12nmol/L和3.8nmol/L，与野生型的EGFR没有显著性差异，但对野生型和突变型细胞株的EGFR降解作用有显著差异，69和70选择性地降解突变的EGFR，而对野生型作用很弱，反映了PROTAC分子作为事件驱动的过程与占据驱动过程所产生的后果是不同的。
生物学在多层面上提供了知识、技术和方法，药物化学从不同视角认识、把握和应用，已显示新药创制的基本路径。大到抗体偶联药物和蛋白降解靶向嵌合分子，小到针对单个氨基酸突变设计抗耐药的活性分子，为新药创制开拓了广阔领域，也为药物化学提出更多的探索与挑战。分子生物学发现的众多蛋白通路和靶标，那些可药性蛋白犹如低垂的果实纷纷开发出新药，而非可药性的靶标如底物是强极性分子的酶系和蛋白-蛋白相互作用多为“高悬”的果实而有待采摘，个别成功的例子是作用于BCL-2蛋白的抗肿瘤药维奈克拉（venetoclax），是多种生物物理技术联合应用的项目，显示了药物化学平台技术的重要性。类药五原则（rule of five，RO5）概括的小分子药物的属性，指导了一代人的研发思路，却也成为过时的律条束缚了人们的思维和创新空间。许多大环药物突破RO5且优于开链分子，有待从大样本的微观结构中提取有益的信息，以开拓小分子药物的化学空间和路径。
［1］ HOPKINS A L.Drug discovery：predicting promiscuity［J］.Nature，2009，462（7270）：167-168.
［2］ BRESLIN H J，CAI C Z，MISKOWSKI T A，et al.Identification of potent phenyl imidazoles as opioid receptor agonists［J］.Bioorg Med Chem Lett，2006，16（9）：2505-2508.
［3］ SANGUINETTI M C.HERG1 channel agonists and cardiac arrymthmia［J］.Curr Opin Phar macol，2014，15（1）：22-27.
［4］ SINGH B N，MALM J，MELLIN C，et al.Synthesis and preliminary characterization of a novel antiarrhythmic compound（KB130015）with an improved toxicity profile compared with amiodarone［J］.J Med Chem，2002，45（3）：623-630.
［5］ GORDON E，LOZINSKAYA I M，LIN Z.2-［2-（3,4-dichloro-phenyl）-2,3-dihydro-1H-isoin dol-5-ylamino］-nicotinic acid（PD-307243）causes instantaneous current through human ether-a-go-go-related gene potassium channels［J］.Mol Pharmacol，2008，73（3）：639-651.
［6］ MULLER G W，CHEN R，HUANG S Y，et al.Amino-substituted thalidomide analogs：potent inhibitors of TNF-alpha production［J］.Bioorg Med Chem Lett，1999，9（11）：16251630 .
［7］ MATYSKIELA M E，ZHANG W H，MAN H W，et al.A celebron modulator（CC-220） with ifmproved degredation of Ikaros and Aiolos［J］.J Med Chem，2018，61（2）：535-542 .
［8］郭宗儒.基于天然产物首创的凝血酶受体拮抗剂沃拉帕沙［J］.药学学报，2016，51（3）：496-498.
［9］ PAN Z，SCHEERENS H，LI S，et al.Discovery of selective irreversible inhibitors for Bruton’s tyrosine kinase［J］.ChemMedChem，2007，2（1）：58-61.
［10］ HERMAN S E M，MONTRAVETA A，NIEMANN C U，et al.The Bruton tyrosine kinase（BTK）inhibitor Acalabrutinib demonstrates potent on-target efects and eficacy in two mouse models of chronic lymphocytic leukemia［J］.Clin Cancer Res，2017，23（11），2831-2841.
［11］ GUO Y H，YE LIU Y，NAN H U N，et al.Discovery of zanubrutinib（BGB-3111），a novel，potent，and selective covalent inhibitor of Bruton’s tyrosine kinase［J］.J Med Chem，2019，62（17）：7923-7940.
［12］ BOGEN S L，ARASAPPAN ARASAPPAN A，BENNET F，et al.Discovery of SCH446211（SCH6）：A new ketoamide inhibitor of the HCV NS3 serine protease and HCV subgenomic RNA Replication［J］.J Med Chem，2006，49（9）：2750-2757.
［13］ ADAMS J，BEHNKE M，CHEN S，et al.Potent and selective inhibitors of the proteasome：dipeptidyl boronic acids［J］.Bioorg Med Chem Lett，1998，8（2）：333-338.
［14］ BAKER S J，ZHANG Y K，AKAMA T，et al.Discovery of a new boron-containing antifun galagent，5-fluoro-1,3-dihydro-1-hydroxy-2,1-benzoxaborole（AN2690），for the potential treat ment of onychomycosis［J］.J Med Chem，2006，49（15）：4447-4450.
［15］ AKAMA T，BAKER S J，ZHANG Y K，et al.Discovery and structure-activity study of a novel benzoxaboroleanti-inflammatory agent（AN2728）for the potential topical treat ment of psoriasis and atopic dermatitis［J］.Bioorg Med Chem Lett，2009，19（8）：2129-2132.
［16］ METCALF B，CHUANG C，DUFU K，et al.Discovery of GBT440，an orally bioavailable Rstate stabilizer of sickle cell hemoglobin［J］.ACS Med Chem Lett，2017，23（3）：321326 .
［17］ MANLEY P，STIEFL N，COWAN-JACOB S，et al.Structural resemblances and compar isons of the relative pharmacological properties of imatinib and nilotinib［J］.Bioorg Med Chem，2010，18（19）：6977-6986.
［18］ HUANG W S，METCALF C A，SUNDARAMOORTHI R，et al.Discovery of 3-［2-（imidazo［1,2-b］pyridazin-3-yl）ethynyl］-4-methyl-N-{4-［（4-methylpiperazin-1-yl）-methyl］-3-（trifluoromethyl）phenyl}benzamide（AP24534），a potent，orally active pan-inhibitor of breakpoint cluster region-abelson（BCR-ABL）kinase including the T315I gatekeeper mutant［J］.J Med Chem，2010，53（12）：4701-4719.
［19］ REN X M，PAN X F，ZHANG Z，et al.Identification of GZD824 as an orally bioavailable inhibitor that targets phosphorylated and nonphosphorylated breakpoint cluster region-Abelson（Bcr-Abl）kinase and overcomes clinically acquired mutation-induced resistance against imatini hem［J］.J Med Chem，2013，56（3）：879-894.
［20］ CANON J，REX K，SAILI A Y，et al.The clinical KRAS（G12C）inhibitor AMG 510 drives anti-tumour immunity［J］.Nature，2019，575（7781）：217-223.
［21］ LANMAN B A，ALLEN J R，ALLEN J G，et al.Discovery of a covalent inhibitor of KRASG12C（AMG 510）for the treatment of solid tumors［J］.J Med Chem，2020，63（1）：52-65 .
［22］ WYLIE A A，SCHOEPFER J，JAHNKE W，et al.The allosteric inhibitor ABL001 enables dual targeting of BCR-ABL1［J］.Nature，2017，543（7647）：733-737.
［23］ SCHOEPFER J，JAHNKE W，BERELLINI G，et al.Discovery of asciminib（ABL001），an allosteric inhibitor of theayrosine kinase activity of BCR-ABL1［J］.J Med Chem，2018，61（18）：8120-8135.
［24］ VELEIRO A S，BURTON G.Structure-activity relationships of neuroactive steroids acting on the GABAA receptor［J］.Curr Med Chem，2009，16（4）：455-472.
［25］ BOTELLA G M，SALITURO F G，HARRISON B L，et al.Neuroactive steroids.1.positive allosteric modulators of the（γ-aminobutyric acid）A receptor：structure-activity relationships of heterocyclic substitution at C21［J］.J Med Chem，2015，58（8）：3500-3511.
［26］ BOTELLA G M，SALITURO F G，HARRISON B L，et al.Neuroactive steroids.2.3α-Hydroxy-3β-methyl-21-（4-cyano-1H-pyrazol-1′-yl）-19-nor-5β-pregnan-20-one（SAGE 217）：a clinical next generation neuroactivesteroid positive allosteric modulator of the（γ-amin obutyric acid）A receptor［J］.J Med Chem，2017，60（18）：7810-7819.
［27］ BOURBEAU M P，BARTBERGER M D.Recent advances in the development of acetyl-CoA carboxylase（ACC）inhibitors for the treatment of metabolic disease［J］.J Med Chem，2015，58（3）：525-536.
［28］ HARRIMAN G，GREENWOOD J，BHAT S，et al.Acetyl-CoA carboxylase inhibition by ND-630 reduces hepatic steatosis，improves insulin sensitivity，and modulates dyslipidemia in rats［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2016，113（13）：1796-1805.
［29］ CHEN Y N P，LAMARCHE M J，CHAN H M，et al.Allosteric inhibition of SHP2 phos phatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases［J］.Nature，2016，535：148152 .
［30］ CUI J J，TRAN-DUBÉ M，SHEN H，et al.Structure based drug design of crizotinib（PF 02341066），a potent and selective dual inhibitor of mesenchymal-epithelial transition factor （c-MET）kinase and anaplastic lymphoma kinase（ALK）［J］.J Med Chem，2011，54（18）：6342-6363 .
［31］ JOHNSON T W，RICHARDSON P F，BAILEY S，et al.Discovery of（10R）7-amino 12-fluoro-2,10,16-trimethyl-15-oxo10,15,16,17-tetrahydro-2H8,4-（metheno）pyrazolo［4,3h］［2,5,11］-benzoxadiazacyclotetradecine-3-carbonitrile（PF-06463922），a m Inhibitor of ana plastic lymphoma kinase（ALK）and cros oncogene 1（ROS1）with preclinical brain exposure and broad spectrum potency against ALK-resistant mutations［J］.J Med Chem，2014，57（11）：4720-4744.
［32］郭宗儒.由蛋白底物到丙肝药西米匹韦［J］.药学学报，2014，49（9）：1353 -1356.
［33］ PRIESTLEY E S，CHENEY D L，DELUCCA I，et al.Structure-Based design of macrocyclic coagulation factor Ⅶa inhibitors［J］.J Med Chem，2015，58（15）：6225-6236.
［34］ CORTE J R，FANG T A，HONEY OSUNA H，et al.Structure-based design of macrocyclic factor XIa inhibitors：discovery of the macrocyclic amide linker［J］.J Med Chem，2017，60（3）：1060-1075.
［35］ GARNER T P，LOPEZ A，REYNA D E，et al.Progress in targeting the BCL-2 family of proteins［J］.Curr Opin Chem Biol，2017，39：133-142.
［36］ SOFIA M J，BAO D H，CHANG W，et al.Discovery of a β-D-2’-deoxy-2’-α-fluoro-2’-β-C methyluridine nucleotide prodrug（PSI-7977）for the treatment of hepatitis C virus［J］.J Med Chem，2010，53（19）：7202-7218.
［37］ SIEGEL D，HUI H C，DOERFFLER E，et al.Discovery and synthesis of a phosphoramidate prodrug of a pyrrolo［2,1f］［triazin-4-amino］adenine Cnucleoside（GS-5734）for the treat ment of ebola and emerging viruses［J］.J Med Chem，2017，60（5）：1648-1661.
［38］ CAO H，YAMAMOTO K，YANG L X，et al.Brentuximab vedotin：first-line agent for ad vanced Hodgkin lymphoma［J］.Anticancer Res，2013，33（9）：3879-3885.
［39］ CHARI R V.Targeted cancer therapy：conferring specificity to cytotoxic drugs［J］.Acc Chem Res，2008，41（1）：98-107.
［40］ BUCKWALTER M，DOWELL J A，KORTH-BRADLEY J，et al.Pharmacokinetics of gemtuzumab ozogamicin as a single-agent treatment of pediatric patients with refractory or re lapsed acute myeloid leukemia［J］.J Clin Pharmacol，2004，44（8）：873-880.
［41］ MODI S，SAURA C，YAMASHITA T，et al.Trastuzumab deruxtecan in previously treated HER2-positive breast cancer［J］.New Engl J Med，2020，382（7）：610-621.
［42］ REDDY J A，DORTON R，WESTRICK E，et al.Preclinical evaluation of EC145，a folate-vinca alkaloid conjugate［J］.Cancer Res，2007，67（9）：4434-4442.
［43］ PARKER N，TURK M J，WESTRICK E，et al.Folate receptor expression in carcinomas and normal tissues determined by a quantitative radioligand binding assay［J］.Analyt Biochem，2005，338（2）：284-293.
［44］ WHITE B H，WHALEN K，KRIKSCIUKAITE K，et al.Discovery of an SSTR2-targeting maytansinoid conjugate（PEN-221）with potent activity in vitro and in vivo［J］.J Med Chem，2019，62（5）：2708-2719.
［45］ ITO A，SATO T，OTA M，et al.In vitro antibacterial properties of cefiderocol，a novel si derophore cephalosporin，against Gram-negative bacteria［J］.Antimicrob Agents Chemoth，2018，62（1）：1-11.
［46］ BREEMAN W A，CHAN H S，DE ZANGER R M，et al.Overview of development and for mulation of 177 Lu-DOTATATE for PRRT［J］.Curr Radiopharm，2016，9（1）：8-18.
［47］ CHAMBERLAIN P P，LOPEZ-GIRONA A，MILLER K，et al.Structure of the human cere blon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs［J］.Nat Struct Mol Biol，2014，21（9）：803-809.
［48］ GALDEANO C，GADD M S，SOARES P，et al.Structure-guided design and optimization of small molecules targeting the protein-protein interaction between the von Hippel-Lindau（VHL） E3 ubiquitin ligase and the hypoxia inducible factor（HIF）alpha subunit with in vitro nanomolar afinities［J］.J Med Chem，2014；57（20）：8657-8663.
［49］ VASSILEV L T，VU B T，GRAVES B，et al.In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2［J］.Science，2004，303（5659）：844-848.
［50］ SCHNEEKLOTH AR，PUCHEAULT M，TAE HS，et al.Targeted intracellular protein deg radation induced by a small molecule：En route to chemical proteomics［J］.Bioorg Med Chem Lett，2008，18（22）：5904-5908.
［51］ ITOH Y，ISHIKAWA M，NAITO M，et al.Protein knockdown using methyl bestatin-li gand hybrid molecules：design and synthesis of inducers of ubiquitination-mediated degra dation of cellular retinoic acid-binding proteins［J］.J Am Chem Soc，2010，132（16）：5820-5826 .
［52］ MARKELLA K，JINGYAO L，BIDONG Z，et al.PROTACs-a game-changing technology［J］.Expert Opinion on Drug Discovery，2019，14（12）：1255-1268.
［53］ HAN X，WANG C，QIN C，et al.Discovery of ARD-69 as a highly potent proteolysis target ing chimera（PROTAC）degrader of androgen receptor（AR）for the treatment of prostate cance［J］.J Med Chem，2019，62（2）：941-964.
［54］ HAN X，ZHAO LJ，XIANG WG，et al.Discovery of highly potent and eficient PROTAC of androgen receptor（AR）by employing weak binding afinity VHL E3 ligase ligands［J］.J Med Chem，2019，62（24）：11218-11231.
［55］ SUN Y H，ZHAO X W，DING N，et al.PROTAC-induced BTK degradation as a novel therapy for mutated BTK C481S induced ibrutinib-resistant B-cell malignancies［J］.Cell Re search，2018，28（6）：779-781.
［56］LU J，QIAN Y，ALTIERI M，et al.Hijacking the E3 ubiquitin ligase cereblon to eficiently target BRD4［J］.Chem Biol，2015，22（6）：755-763.
［57］ HU J T，HU B，ML，et al.Discovery of ERD-308 as a highly potent proteolysis targeting chimera（PROTAC）degrader of estrogen receptor（ER）［J］.J Med Chem，2019，62（3）：1420-1442 .
［58］ CHENG M，YU X F，LU K，et al.Discovery of potent and selective epidermal growth factor receptor（EGFR）bifunctional small-molecule degraders［J］.J Med Chem，2020，63（3）：1216-1232 .
［59］ PARK C M，BRUNCKO M，ADICKES J，et al.Discovery of an orally bioavailable small molecule inhibitor of prosurvival B-cell lymphoma 2 proteins［J］.J Med Chem，2008，51（21）：6902-6915.