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N型非病毒载体以及包含其的药物组合物
本发明涉及非病毒载体及编码其的融合基因，所述非病毒载体将能够在体内可控表达对细胞具有杀伤作用的蛋白质的表达型重组体靶向性地导入GnRH受体阳性的缺氧肿瘤细胞，以使该表达型重组体在该细胞内表达出蛋白，从而准确杀伤清除所述的细胞，而不伤及正常细胞。本发明还涉及包含所述非病毒载体和所述表达型重组体的药物组合物及其应用。
1.一种非病毒载体，其为从N端至C端依次包含一种受体配体多肽、TNF87 多肽、核定位序列多肽与一种富含阳性氨基酸的多肽的靶向性融合蛋白，其中所述受体配体多肽为促性腺激素释放肽GnRH或其由序列Met Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro组成的片段；所述TNF87 多肽是肿瘤坏死因子突变后序列的一个片段，其是由SEQ ID NO∶2 编码的序列；所述核定位序列多肽是TAP，其中TAP的编码基因为SEQ ID NO∶3 或其野生型序列；所述富含阳性氨基酸的多肽是DNA结合蛋白SON或其由DNA结合蛋白SON的第788～859 位氨基酸序列组成的片段，其中SON的第 788～859 位氨基酸为：KVKDTHEKSKKNKNRDKGEK EKKRDSSLRSRSKRSKSSEHKSRKRTSESRSRARKRSSKSKSHRSQTRSR。
2.如权利要求 1 所述的非病毒载体，其中从N端至C端依次为促性腺激素释放肽GnRH、TNF87 多肽、核定位序列多肽TAP和DNA结合蛋白SON的第 788～859 位氨基酸，所述非病毒载体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5 所示。
3.一种非病毒载体，其为从N端至C端依次包含一种受体配体多肽、TNF87 多肽与一种富含阳性氨基酸的多肽的靶向性融合蛋白，其中所述受体配体多肽为促性腺激素释放肽GnRH或其由序列Met Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro组成的片段；所述TNF87 多肽是肿瘤坏死因子突变后序列的一个片段，其是由SEQ ID NO∶2 编码的序列；所述核定位序列多肽是TAP，其中TAP的编码基因为SEQ ID NO∶3 或其野生型序列；所述富含阳性氨基酸的多肽是DNA结合蛋白SON或其由DNA结合蛋白SON的第 788～859 位氨基酸序列组成的片段，其中SON的第 788～859 位氨基酸为：KVKDTHEKSKKNKNRDKGEKEKKRNSSLRSRSKRSKS SEHKSRKRTSESRSRARKRSSKSKSHRSQTRSR。
4.如权利要求 3 所述的非病毒载体，其从N端至C端依次为促性腺激素释放肽GnRH、TNF87 多肽和DNA结合蛋白SON的第 788～859 位氨基酸，所述非病毒载体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7 所示。
5.一种融合基因，其编码权利要求 1～4 任一项的非病毒载体。
6.如权利要求 5 的融合基因，其编码权利要求 2 的非病毒载体其核苷酸序列是SEQ ID NO.6 所示的核苷酸序列。
7.如权利要求 5 的融合基因，其编码权利要求 4 的非病毒载体其核苷酸序列是SEQ ID NO.8 所示的核苷酸序列。
8.包含权利要求 5～7 任一项所述的融合基因的重组体。
9.如权利要求 8 所述的重组体，其为通过将pLSD与权利要求 6 的融合基因重组连接而构建的。
10.如权利要求 8 所述的重组体，其为通过将pLSD与权利要求 7 的融合基因重组连接而构建的。
11.由权利要求 8 的重组体转化、转染或转导的宿主细胞。
12.生产权利要求 1～4 任一项的非病毒载体的方法，包括在合适表达的条件下培养权利要求 11 的宿主细胞，并分离和纯化由所述宿主细胞表达的所述非病毒载体。
13.一种用于靶向性肿瘤基因治疗的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求 1～4 任一项的非病毒载体以及一种表达型重组体的复合物，所述表达型重组体包含一种表达对细胞具有杀伤能力的蛋白质的基因。
14.如权利要求 13 所述的药物组合物，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素、白喉毒素、商陆、蓖麻毒素，或其他一切对细胞具有杀伤能力的来自人体、动植物或者微生物的蛋白，或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物；以及根据人工合成的对细胞具有杀伤能力的蛋白质或多肽。
15.如权利要求 14 所述的药物组合物，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素，或者是其第二或第三功能结构域。
16.如权利要求 15 所述的药物组合物，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质是绿脓杆菌毒素的第三功能结构域或其突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO∶9 所示，核苷酸序列如SEQ ID NO∶12所示。
17.如权利要求13 所述的药物组合物，其中所述表达型重组体为基于pGL3 而构建的表达型重组体，其通过将pGL3 和PEⅢ mut 或pGL3、四拷贝HRE和PEⅢ mut 重组连接而构建，其中HRE基因的DNA序列如SEQ ID NO.10 所示，PEⅢ mut 基因的DNA序列如SEQ ID NO.12 所示。
18.如权利要求 17 所述的药物组合物，其还包括GTTS或GTS，其中所述GTTS的氨基酸序列如SEQ ID NO.5 所示，GTS的氨基酸序列如SEQ ID NO∶7 所示。
19.权利要求 13～18 任一项的药物组合物在制备对恶性肿瘤的准确靶向药物中的应用。
20.如权利要求 19 所述的应用，其中所述恶性肿瘤为对GnRH受体阳性的肝癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、垂体瘤。
本发明属于基因治疗药物领域，具体地说，本发明涉及非病毒载体及编码其的融合基因，所述非病毒载体是能够包装与携带编码具有杀伤作用的蛋白质的表达型重组体靶向性地导入特定肿瘤细胞，以使该表达型重组体在该种细胞内表达出蛋白质，从而杀伤该种肿瘤细胞而不伤及其他细胞。本发明还涉及包含所述非病毒载体和所述表达型重组体的药物组合物及其应用。
已知共有上千种抗肿瘤或抗病毒活性的人体异源蛋白，但在付之临床应用时存在两个问题：一是无特异性（或靶向性）地对所有细胞的杀伤作用导致的严重毒副作用问题；二是作为人体异源蛋白质，在导入人体血循环时出现的严重的免疫原性问题。为解决上述问题，20 个世纪 80 年代曾出现过利用肿瘤细胞受体配体基因与绿脓毒素基因Ⅱ、Ⅲ功能域编码基因构建的融合基因及其所产生的导向融合蛋白。但临床研究表明，这种导向蛋白虽能在一定程度上增强了毒素蛋白质的导向性与特异性，但不完全。与此同时，毒素蛋白质在这种情况下，其强烈的免疫原性问题依然存在。在临床应用时，虽初期有良好疗效，但在 4 周之后，因抗体形成，发生中和效应而完全失效。虽然通过多种尝试来修饰或封闭毒素的抗原决定簇，如PEG修饰和点突变改造毒素的氨基酸组成，但均因修饰而导致毒素失活，或不能完全消除毒素蛋白的免疫原性，最终还是导致了毒素的失效。因此，寻找一种安全、有效地导入靶细胞，从而杀灭肿瘤靶细胞而又避免毒素蛋白对正常细胞的毒副作用与免疫原性的方法是必要的。
基因靶向转移和表达确保基因治疗的安全性，是基因治疗中必须首先考虑的问题。将治疗基因特异性地转移到肿瘤组织或在肿瘤细胞中特异表达，可有效避免对正常组织的伤害，同时亦可增加转染效率，实现基因的靶向性治疗。实现基因的靶向性（限制性）表达主要有两种调控机制：一是所谓的“转录靶向调控机制”，即选用肿瘤相关抗原（如AFP、CEA）等基因的顺式作用元件（如启动因子、增强子）与相应的目的基因构建成表达盒，插入基因转移载体，这样转移基因仅在产生上述肿瘤相关蛋白的肿瘤中表达，从而对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应；二是所谓的“转基因表达的外源调控机制”，即利用可受某种因素诱导表达基因的顺式作用元件，与相应的目的基因构建成表达盒，插入基因转移载体，这样，转移基因在体内表达与否直接受相应诱导因素的调控。
多数腺癌细胞的表面会特异性地表达促性腺激素释放肽（GnRH）受体，使用可以与其特异性结合的配体GnRH作为靶向蛋白，将有杀伤作用的绿脓杆菌毒素（PE）以GnRH-PE融合蛋白形式导入肿瘤细胞，可望杀伤肿瘤细胞。这一设计基本解决了毒素导向杀伤肿瘤细胞的问题，但因一些正常细胞表面也表达GnRH受体，以致也还可能把毒素导入部分正常细胞而出现毒副作用问题，与此同时，绿脓杆菌毒素对于人体来说是一种异源蛋白，将会产生免疫原性。
针对应用毒素治疗肿瘤中存在的这些障碍，本领域需要在完全避免毒素蛋白免疫原性和毒副作用的同时，保留毒素蛋白活性从而特异性杀伤肿瘤细胞的新的靶向治疗药物及相关载体。
在第一方面，本发明提供了一种非病毒载体，其本质是一种靶向性融合蛋白，所述融合蛋白由受体配体多肽、TNF87 多肽、核定位序列多肽与富含阳性氨基酸的多肽组成。在本发明这一方面的另一个实施方案中，本发明的非病毒载体由受体配体多肽、TNF87 多肽及富含阳性氨基酸的多肽组成。根据本发明，所述富含阳性氨基酸的多肽是DNA结合蛋白SON或其片段；所述TNF87 多肽是肿瘤坏死因子（TNF）突变后序列；所述核定位序列多肽是TAP；所述受体配体多肽是所述非病毒载体中的受体配体多肽是能够与GnRH受体特异性结合的GnRH或其相关片段、类似物或突变体。由于使用GnRH作为导向分子，所以本发明人将本发明的非病毒载体称为N型非病毒载体。
优选地，通过基因工程方法在体外重组获得融合基因，并在原核细胞或真核细胞中表达该融合基因而获得本发明的非病毒载体（融合蛋白）。因此，本发明提供了编码本发明的非病毒载体的融合基因。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的非病毒载体和一种表达型DNA重组体的复合物的药物组合物，以用于靶向性恶性肿瘤的基因治疗，所述表达型重组体包含表达对细胞具有杀伤能力的蛋白质的基因。
根据本发明，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素、白喉毒素、商陆、蓖麻毒素，或其他一切对细胞具有杀伤能力的来自人体、动植物或者微生物的蛋白，或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物，以及人工合成的具有杀伤细胞活性的蛋白质或多肽及其相应的编码基因。优选地，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素，或者是其第二和第三结构域；更优选地，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质是绿脓杆菌毒素的第三结构域或其突变体。在本发明的一个优选实施方案中，所述突变体为绿脓杆菌第Ⅲ功能域突变体（C段的REDLK突变成KDEL），称为PEⅢ mut 。它能够产生杀伤力更强的毒素蛋白，其氨基酸序列SEQ ID NO∶9 所示。
本发明将毒素蛋白质靶向导入细胞的方式改为将毒素蛋白编码基因靶向导入细胞的治疗方法，在完全避免毒素蛋白免疫原性和毒副作用的同时，保留毒素蛋白活性从而特异性杀伤肿瘤细胞。本发明设计使得所述非病毒载体与只能在缺氧肿瘤细胞内表达的毒素基因表达型重组体构成复合药，从而靶向杀伤肿瘤细胞。利用非病毒载体将编码对细胞有强烈杀伤作用的并受缺氧条件驱动的PEⅢ mut （绿脓毒素第三区段的突变基因片段）以表达型重组体的形式靶向导入肿瘤细胞，致使PEⅢ mut 仅在肿瘤细胞中表达，从而杀灭该细胞。同时，在这种利用肿瘤细胞是缺氧细胞的特点，以缺氧条件作为基因可控表达的控制条件的情况下，即使表达型重组体被导入正常细胞，因该细胞为有氧细胞，则毒素基因PEⅢ mut 不能表达，细胞也不致于被杀伤。这样，既避免了毒素蛋白的免疫原性，也避免了对任何正常细胞的杀伤作用，即毒副作用。这一设计引导出了“个体化诊断与个体化治疗”的必要性，因此这一药物组合物的适应症主要是肝癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、垂体瘤等。这是本发明的一个主要特征。
图1（图略）为本发明的药物组合物的总体设计图。
图2（图略）为构建含有融合蛋白GTTS的编码基因的重组体pLSD-GnRH-TNF87-TAP-SON（GTTS）和pLSD-GnRH-TNF87-SON（GTS）酶切鉴定结果，其中序号 1～4 分别代表：1：BamHI和NdeI双切GnRH-TNF87-TAP-SON；2：HindⅢ和EcoR I双切λDNA分子量标记；3：BstNI单切pBR322 分子量标记：4∶BamHI和NdeI双切GnRH-TNF87-SON。
图3（图略）为构建重组质粒pGL3-4HRE的酶切鉴定结果，其中序号 1～8 分别代表：1：HindⅢ单切λDNA分子量标记；2：SalI单切pGEM-7Zf-1HRE；3：1HRE PCR结果；4：HindⅢ和XbaI双切pGEM-7Zf-1HRE；5：HindⅢ和XbaI双切pGEM-7Zf-2HRE；6：HindⅢ和XbaI双切pGEM-7Zf-4HRE：7：SalI单切pGL3-4HRE；8：BstNI单切pBR322 分子量标记。
图4（图略）为构建重组质粒谱pGL3-4HRE-PEⅢ mut 与pGL3-PEⅢ mut 的酶切鉴定结果，其中序号 1～8分别代表：1：HindⅢ单切λDNA分子量标记；2：EeoRI和EcoRV双切pCDNA3.1his-PEⅢ；3：HindⅢ和XbalI双切pBSKs-PEⅢ mut ；4：HindⅢ单切pGL3；5：HindⅢ和XbaI双切pGL3；6：SmaⅠ单切pGL3-PEⅢ mut ；7：SmaⅠ单切pGL3-4HRE-PEⅢ mut ；8：BstNI单切pBR322 分子量标记。
图5（图略）为重组质粒pGL3-4HRE-miniCMV-PEⅢ mut 、pGL3-4HRE-miniCMV-IntronII-PEⅢ mut 的酶切鉴定结果，其中序号 1～4 分别代表：1：SmaⅠ单切pGL3-4HRE-miniCMV-Intron II-PEⅢ mut ；2：SmaⅠ单切pGL3-4HRE-miniCMV-PEⅢ mut ；3：HindⅢ和EcoR I双切λDNA分子量标记；4：BstNI单切pBR322 分子量标记。
图6 重组体pGL3-4HRE的构建图谱。
图7 重组体pGL3-PEⅢ mut 的构建图谱。
图8 重组体pGL3-4HRE-miniCMV-PEⅢ mut 构建图谱。
图9.GnRH-TNF87-TAP-SON、GnRH-TNF87-SON两种蛋白诱导结果，其中序号 1～10 分别代表：1：GnRH-TNF87-SON未诱导；2，3，4，5：GnRH-TNF87-SON诱导；6：蛋白标记；7：GnRH-TNF87-TAP-SON未诱导；8，9，10：GnRH-TNF87-TAP-SON诱导。
图10.（图略）DNA与GTTS不同比例电泳结果，检测DNA与蛋白结合情况，其中序号 1～5 分别代表：1：单纯DNA；2：DNA与蛋白电荷比为 8∶1；3：DNA与蛋白电荷比为 4∶1；4：DNA与蛋白电荷比为 2∶1；5：DNA与蛋白电荷比为 1∶1。
图11.（图略）DNA蛋白复合物在 4℃放置一个月后电泳结果，其中序号 1～2 分别代表：1：DNA与蛋白GTTS复合物；2：单纯DNA。
图12.（图略）GTTS与含绿色荧光蛋白的质粒pIRES-EGFP复合物转染HeLa细胞。含有报告基因的质粒被吞入细胞后，进入细胞核内表达成绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下，发出绿色荧光。
图13.（图略）GTTS与pGL3-HRE4-miniCMV-PEⅢ mut 复合物在缺氧条件下处理Hela细胞后，用流式细胞仪检测图谱。
图14.有氧条件下 2BS细胞不同给药组的OD值作图，其中序号 1～6 分别代表：1：空白对照；2：蛋白；3：DNAa；4：DNAa＋蛋白；5：DNAb；6.DNAb＋蛋白；其中，DNAa为pGL3-4HRE-miniCMV-PEⅢ mut ；DNAb为pGL3-PEⅢ mut 。
图15.有氧条件下HEK293 细胞不同给药组的OD值作图，其中序号 1～10 分别代表：1：空白对照；2：蛋白；3：DNA（a，8μg/ml）；4：DNA（a，8μg/ml）＋蛋白；5：DNA（a，2μg/ml）＋蛋白；6：DNA（a，0.5μg/ml）＋蛋白；7：DNA（b，8μg/ml）；8：DNA（b，8μg/ml）＋蛋白；9：DNA（b，2μg/ml）＋蛋白；10：DNA（b，0.5μg/ml）＋蛋白。其中，DNAa为pGL3-HRE4-miniCMV-PEⅢ mut ；DNAb为pGL3-PEⅢ mut 。
图16.有氧条件下HepG2 细胞不同给药组的OD值作图，其中序号 1～10 分别代表：1：空白对照；2：蛋白；3：DNA（a，8μg/ml）；4：DNA（a，8μg/ml）＋蛋白；5：DNA（a，2μg/ml）＋蛋白；6：DNA（a，0.5μg/ml）＋蛋白；7：DNA（b，8μg/ml）；8：DNA（b，8μg/ml）＋蛋白；9：DNA（b，2μg/ml）＋蛋白；10：DNA（b，0.5μg/ml）＋蛋白。其中，DNAa为pGL3-HRE4-miniCMV-PEⅢ mut ；DNAb为pGL3-PEⅢ mut 。
图17.有氧条件下Hela细胞不同给药组的OD值作图，其中序号 1～10 分别代表：1：空白对照；2：蛋白；3：DNA（a，8μg/ml）；4：DNA（a，8μg/ml）＋蛋白；5：DNA（a，2μg/ml）＋蛋白；6：DNA（a，0.5μg/ml）＋蛋白；7：DNA（b，8μg/ml）；8：DNA（b，8μg/ml）＋蛋白；9：DNA（b，2μg/ml）＋蛋白；10：DNA（b，0.5μg/ml）＋蛋白。其中，DNAa为pGL3-HRE4-miniCMV-PEⅢ mut ；DNAb为pGL3-PEⅢ mut 。
图18.有氧条件下MCF-7 细胞不同给药组的OD值作图，其中序号 1～10 分别代表：1：空白对照；2：蛋白；3：DNA（a，8μg/ml）；4：DNA（a，8μg/ml）＋蛋白；5：DNA（a，2μg/ml）＋蛋白；6：DNA（a，0.5μg/ml）＋蛋白；7：DNA（b，8μg/ml）；8：DNA（b，8μg/ml）＋蛋白；9：DNA（b，2μg/ml）＋蛋白；10：DNA（b，0.5μg/ml）＋蛋白。其中，DNAa为pGL3-HRE4-miniCMV-PEⅢ mut ：DNAb为pGL3-PEⅢ mut 。
图19.缺氧条件下 2BS细胞不同给药组的OD值作图，其中序号 1～6 分别代表：1：空白对照；2：蛋白；3：DNAa；4：DNAa＋蛋白；5：DNAb；6：DNAb＋蛋白。其中，DNAa为pGL3-4HKE-miniCMV-PEⅢ mut ；DNAb为pGL3-PEⅢ mut 。
图20.缺氧条件下HepG2 细胞不同给药组的OD值作图，其中序号 1～10 分别代表：1：空白对照；2：蛋白；3：DNA（a，8μg/ml）；4：DNA（a，8μg/ml）＋蛋白；5：DNA（a，2μg/ml）＋蛋白；6：DNA（a，0.5μg/ml）＋蛋白；7：DNA（b，8μg/ml）；8：DNA（b，8μg/ml）＋蛋白；9：DNA（b，2μg/ml）＋蛋白；10：DNA（b，0.5μg/ml）＋蛋白。其中，DNAa为pGL3-HRE4-miniCMV-PEⅢ mut ；DNAb为pGL3-PEⅢ mut 。
图21.缺氧条件下Hela细胞不同给药组的OD值作图，其中序号 1～10 分别代表：1：空白对照；2：蛋白；3：DNA（a，8μg/ml）；4：DNA（a，8μg/ml）＋蛋白；5：DNA（a，2μg/ml）＋蛋白；6：DNA（a，0.5μg/ml）＋蛋白；7：DNA（b，8μg/ml）；8：DNA（b，8μg/ml）＋蛋白；9：DNA（b，2μg/ml）＋蛋白；10：DNA（b，0.5μg/ml）＋蛋白。其中，DNAa为pGL3-HRE4-miniCMV-PE Ⅲ mut ；DNAb为pGL3-PEⅢ mut 。
图22.缺氧条件下MCF-7 细胞不同给药组的OD值作图，其中序号 1～10 分别代表：1：空白对照；2：蛋白；3：DNA（a，8μg/ml）；4：DNA（a，8μg/ml）＋蛋白；5：DNA（a，2μg/ml）＋蛋；6：DNA（a，0.5μg/ml）＋蛋白；7：DNA（b，8μg/ml）；8：DNA（b，8μg/ml）＋蛋白；9：DNA（b，2μg/ml）＋蛋白；10：DNA（b，0.5μg/ml）＋蛋白。其中，DNAa为pGL3-HRE4-miniCMV-PE Ⅲ mut ；DNAb为pGL3-PEⅢ mut 。
图23.本发明的实验流程图。
本发明的总体设计及实验流程参见图1 和图23 所示。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种非病毒载体，其本质是一种靶向性融合蛋白，所述融合蛋白由受体配体多肽、TNF87 多肽、核定位序列多肽与富含阳性氨基酸的多肽组成。在本发明这一方面的另一个实施方案中，本发明的非病毒载体由受体配体多肽、TNF87 多肽及富含阳性氨基酸的多肽组成。根据本发明，所述富含阳性氨基酸的多肽是DNA结合蛋白SON或其片段；所述TNF87 多肽是肿瘤坏死因子（TNF）突变后序列；所述核定位序列多肽是TAP；所述受体配体多肽是所述非病毒载体中的受体配体多肽是能够与GnRH受体特异性结合的GnRH或其相关片段、类似物或突变体。由于使用GnRH作为导向分子，所以本发明人将本发明的非病毒载体称为N型非病毒载体。本发明的非病毒载体对人体无免疫原性。
优选地，上述受体多肽GnRH的编码基因是包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，如SEQ ID NO.1 所示的序列，或者也可以是其野生型DNA序列。
优选地，所述非病毒载体中的TNF87 是肿瘤坏死因子（TNF）突变后序列的一个片段，它促使了融合蛋白的表达。所述多肽的编码基因可以是包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，如SEQ ID NO.2 所示的序列，或者也可以采用其野生型DNA序列。
优选地，所述非病毒载体中含有或不含有核定位序列TAP，均可使表达型重组体进入核内表达。所述编码TAP的基因可以是包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，如SEQ ID NO∶3 所示的序列，或者也可以采用其野生型DNA序列。
优选地，所述非病毒载体中的富含阳性氨基酸的多肽是DNA结合蛋白SON的第 788～859 位氨基酸的片段，其氨基酸序列为：KVKDTHEKSKKNKNRDKGEKEKKRDSSLRSRSKRSKSSEHKSRKRTSESRSRARKRSSK SKSHRSQTRSR。该片段的编码DNA序列可以为包含大肠杆菌偏爱密码子的突变序列，如SEQ ID NO∶4 所示的序列，或者也可以采用其野生型DNA序列。
优选地，通过基因工程方法在体外重组获得融合基因，并在原核与真核细胞中表达该融合基因而获得本发明的非病毒载体（融合蛋白）。
特别优选地，所述非病毒载体是GTTS，即从N端至C端依次由GnRH多肽、TNF87 多肽、TAP多肽和DNA结合蛋白SON的第 788～859 位氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO∶5 所示。
特别优选地，所述非病毒载体是GTS，即从N端至C端依次由GnRH多肽、TNF87 多肽、和DNA结合蛋白SON的第 788～859 位氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO∶7 所示。
优选地，通过基因工程方法在体外重组获得融合基因，并在原核细胞或真核细胞中表达该融合基因而获得本发明的非病毒载体（融合蛋白）。例如在本发明的一个实施方案中，所述融合基因的DNA序列分别如SEQ ID NO∶6 所示（编码GTTS）或其野生型DNA序列和SEQ ID NO∶8 所示（编码GTS）或其野生型DNA序列。它们编码融合蛋白GTTS和GTS。GTTS从N至C端依次包括GnRH的 10 个氨基酸、突变后TNF的 87 个氨基酸、核定位序列TAP的 42 个氨基酸和人SON的 72 个氨基酸，共含 51 个赖氨酸和精氨酸，当pH＝7 时共带 32 个正电荷。GTS包括GnRH的 10 个氨基酸、突变后TNF的 87 个氨基酸和人SON的 72个氨基酸，共含 41 个赖氨酸和精氨酸，当pH＝7 时共带 28 个正电荷。GTTS和GTS的氨基酸序列分别如SEQ ID NO∶5 和SEQ ID NO∶7 所示。
在本发明的一个实施方案中，所述融合基因分别与温度诱导表达型载体pLSD（J.Bacteriology，171（6）1989，3427-3432）重组，分别命名为pLSD-GnRH-TNF mut -TAP-SON和pLSD-GnRH-TNF mut SON。用上述质粒分别转化大肠杆菌DH5α，获得可以表达融合蛋白的工程菌。
在另一方面，本发明提供了包含本发明的非病毒载体和一种表达型DNA重组体的复合物的药物组合物，以用于靶向性恶性肿瘤的基因治疗，所述表达型重组体包含表达对细胞具有杀伤能力的蛋白质的基因。
所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素、白喉毒素、商陆、蓖麻毒素，或一切其他对细胞具有杀伤能力的来自人体、动植物或者微生物的蛋白，或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物，以及人工合成的具有杀细胞活性的蛋白质或多肽，以及相应的编码基因。优选地，其中所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌毒素，或者是其第二和第三结构域。
绿脓杆菌毒素（PE）是由绿脓杆菌分泌的一种毒素，其是一种极毒的毒素，仅仅对小鼠一次静脉注射0.3 微克即可使之在 24 小时内死亡。对一个细胞来说几个分子的毒素的导入即可使这个细胞死亡。由于PE这种独特的性能，使其作为一种很有前途的毒素被应用到艾滋病的基因治疗中去。PE具有三个结构域，结构域Ⅰa（AA1-252）为细胞结合结构域，结构域Ⅲ（AA405-613）为ADP糖基化区域，结构域Ⅱ和结构域Ⅲ又合称为PE40，而结构域Ⅰb（AA365-404）无明显的生物学功能。为增强毒力，本发明人将绿脓杆菌毒素第Ⅲ结构域C端的 5 个氨基酸残基RDELK的密码子突变为KDEL的密码子，并引入终止密码子TGATAA而得到重组DNA PEⅢ mut ，其编码的毒素蛋白的毒力明显强于原来的PEⅢ。为了增加毒素基因PEⅢ mut 在人体内表达的安全性，减少其毒副作用，本发明另外设计了四拷贝的HRE和miniCMV接在毒素基因的上游，以期通过低氧条件的调控作用，将毒素基因的表达限制在缺氧的肿瘤细胞内。
因此，优选地，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质是绿脓杆菌毒素的第三结构域或其突变体，其中所述突变体PEⅢ mut 的氨基酸序列SEQ ID NO.9 所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO∶12 所示。
优选地，PEⅢ mut 可根据本领域公知的技术引入各种表达载体以用于构建表达型重组体，从而表达毒素蛋白。在本发明的一个实施方案中，所述表达型重组体为基于pGL3 而构建的表达型重组体pGL3-PEⅢ mut 或pGL3-4HKE-PEⅢ mut 。
在本发明另一个实施方案中，所述表达型重组体为受四拷贝HRE和miniCMV启动子双重控制下的真核重组表达型重组体pGL3-HRE4-miniCMV-PEⅢ mut 和pGL3-HRE4-miniCMV-Intron II-PEⅢ mut 。所述HRE基因的DNA序列如SEQ ID NO.10 所示。所述miniCMV基因的DNA序列如SEQ ID NO∶11 所示。
特别优选地，本发明的药物组合物包含选自GTTS/pGL3-4HRE-miniCMV-PEⅢ mut 、GTTS/pGL3-4HRE-miniCMV-Intron II-PE Ⅲ mut 、GTS/pGL3-4HRE-miniCMV-PE Ⅲ mut 和GTS/pGL3-4HRE-miniCMV-Intron II-PEⅢ mut 、GTTS/pGL3-PEⅢ mut 、GTTS/pGLB-4HRE-PEⅢ mut 、GTS/pGL3-PEⅢ mut 和GTS/pGL3-4HRE-PEⅢ mut 的复合体。
本发明所设计的靶向蛋白非病毒载体可以有效地介导毒素基因进入富含特异性受体GnRHR的肿瘤细胞，并表达毒素蛋白，从而杀伤肿瘤细胞，但将会有比较严重的毒副作用，而只有在缺氧状态下，低氧应答元件HRE与miniCMV作为“第二开关”具有很好的选择性，使毒素基因仅在低氧的环境（肿瘤细胞）下启动，发挥准确特异靶向性杀伤细胞表面有GnRH受体的恶性肿瘤细胞。既不杀伤细胞表面无GnRH受体的正常细胞，也不杀伤细胞表面有GnRH受体的非缺氧正常细胞。这样的“双开关”设计，即利用受体配体的关系的导向设计，以及利用缺氧条件作为基因可控表达设计，则实现了对一类肿瘤准确的靶向基因治疗设计。上述设计确保了毒素使用的靶向性和安全性。
在本发明的这种用于靶向性基因治疗的药物的应用中，包含PEⅢ mut 的表达型重组体与融合蛋白中可结合DNA的组分即人SON紧密结合，融合蛋白中的导向组分GnRH通过与肿瘤细胞表面的GnRH受体结合而将复合物导入肿瘤细胞，核定位序列TAP有助于将毒素重组体导入肿瘤细胞的细胞核中表达成毒素蛋白，从而将肿瘤细胞杀死。
具体地说，由于本发明的药物组合物是将毒素基因导入GnRH受体阳性的肿瘤细胞中表达，因此，就不需要毒素的跨膜转运结构域。正是由于这种原因，本发明的毒素基因PEⅢ mut 中仅含有绿脓杆菌毒素的具有ADP糖基化酶活性的第Ⅲ结构域的编码序列。该编码序列在靶细胞中表达出的蛋白可作为杀死靶细胞的毒素。另外，本发明人用白喉毒素C端的 4 个氨基酸残基KDEL替代了PE毒素C端的 5 个氨基酸残基REDLK，由此大大增强了毒素的杀死细胞能力。另外，由于毒素蛋白是在细胞内进行表达，这就彻底避免了毒素蛋白的免疫原性问题。即使在靶细胞崩解后，其中的毒素蛋白（量极少）也许可能被机体免疫识别捕获，从而产生抗体，但这些抗体既无法清除细胞内的毒素蛋白，也不会和作为毒素蛋白表达载体的质粒DNA发生反应。事实上，这类被杀灭的细胞将迅速被机体的免疫机制所清除。
本发明的融合蛋白中利用人体内正常存在的DNA结合蛋白SON分子中的一部分作为结合DNA的功能区。所采用的片段含有 72 个氨基酸，其中含有大量碱性氨基酸，特别是赖氨酸和精氨酸，该多肽片段在一定pH条件下带正电荷，能通过静电作用与带负电荷的DNA结合。其自然形态本身就在真核生物基因组DNA的折叠、浓聚方面有重要的作用。这样设计可以保证DNA分子充分浓聚的基础上保证了低免疫原性，且可以被靶细胞内吞。
以下通过实施例进一步描述本发明。
1.1 单拷贝HRE（缺氧反应元件）序列的克隆
HRE亦称反式作用DNA序列，它的核心序列是 5’-RCGTG-3’。它具有一个或一个以上HIF-1 结合位点，HIF-1 通过结合HRE来调控基因的表达。根据文献报道HRE位于VEGF 5’端转录起始位点第 939～985bp共 47 个bp，在此根据GenBank提供的人外周血来源的VEGF基因序列设计引物，为了方便鉴定、进一步克隆多拷贝HRE及将这段序列接入载体pGEM-7Zf中，分别在序列的 5’端引入KpnⅠ位点及SalI位点，在序列的 3’端引入XhoI位点，同时以设计的引物为模板进行PCR扩增。得到长度为 70bp的目的片段。经KpnⅠ与XhoI双切后，连接入克隆载体pGEM-7Zf的KpnⅠ与XhoI位点之间。利用载体具有的，分别位于插入片段两端的HindⅢ与XbaI进行酶切鉴定。经HindⅢ与XbaI双酶切分别得到大小为 88bp与29565p的片段，经SalI单切得到大小为 3044bp的片段（图3）。将此有目的片段插入的阳性重组质粒命名为pGEM-7Zf-1HRE。测序结果显示所得序列与GenBank提供的序列吻合。
1.2 4 拷贝HRE序列的克隆
为了能从单拷贝的HRE克隆出双拷贝HRE及 4 拷贝的HRE，在设计引物扩增单拷贝HRE时分别在序列两端引入了一对同尾酶SalI与XhoI。载体pGEM-7Zf中存在单一的ScaI酶切位点。XhoI及ScaI双酶切质粒pGEM-7Zf-1HRE，得到大小分别为 1878bp、1166bp的两个片段，其中 1878bp的片段中含有HRE47 个bp的序列，回收此片段。再以SalI及ScaI双酶切质粒pGEM-7Zf-1HRE，得到大小分别为 1221bp、1823bp的两个片段，其中 1221bp的片段中也含有HRE47 个bp的序列，回收此 1221bp的片段。连接回收的两个片段，由于SalI与XhoI是同位酶，所以连接后酶切位点消失，两个ScaI半位点连接后仍然形成单一的ScaI酶切位点。HRE则由单拷贝增为双拷贝。经HindⅢ与XbaI双酶切鉴定，得到有大小为 141bp的目的片段插入的阳性重组质粒，命名此含有双拷贝HRE序列的重组质粒为pGEM-7Zf-2HRE。
用相同的方法获得含有 4 拷贝ERE序列的重组质粒。经HindⅢ与XbaI双酶切鉴定，得到有大小为247bp的目的片段。命名此含有 4 拷贝ERE序列的重组质粒为pGEM-7Zf-4HRE。测序结果显示完全正确。
1.3 重组质粒pGL3-4HRE的构建
用KpnⅠ及XhoI从质粒pGEM-7Zf-4HRE中酶解下 4 拷贝HRE序列小片段，将此小片段插入到表达载体pGL3 的KpnⅠ与XhoI的位点间。经SalI单切（表达载体中没有SalI位点）得到大小为 3203bp的片段，将此重组质粒命名为pGL3-4HRE。
4HRE基因序列
CGTCGACCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCC
CTCCCATGCACTCGACCCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAG
GTCCTCTTCCCTCCCATGCACTCGACCCACAGTGCATACGTGGG
CTCCAACAGGTCCTCTTCCCTCCCATGCACTCGACCCACAGTGC
ATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTCCCTCCCATGCAC
用EcoRI与EcoRV双酶切由本室保存的pcDNA3.1his-PEⅢ质粒，得到大小为 649bp的PEⅢ mut ，再通过这两个酶切位点将PEⅢ mut 序列接入过度载体pBSKs中。经EcoRI与EcoRV双酶切得到大小为 649 bp的目的序列。将此插入了目的基因片段的重组体质粒命名为pBSKs-PEⅢ mut 。重组质粒pBSKs-PEⅢ mut 中PEⅢ mut 序列两端具有HindⅢ及XbaI这两个酶切位点，通过HindⅢ及XbaI双酶切再次得到大小为 687 bp的PEⅢ mut 基因片段，分别插入到重组体质粒pGL3-4HRE-SV40 及载体pGL3 中的HindⅢ与XbaI位点之间。前者经SmaⅠ单切得到大小为 4195bp单带。（载体pGL3 所带的SmaⅠ位点在接入HRE时已被切去，故只有PEⅢ mut 基因片段中存在单一的SmaⅠ位点。）后者经SmaⅠ单切得到大小分别为 888bp与 3120bp的两个片段。（载体pGL3 与PEⅢ mut 基因片段中都存在单一的SmaⅠ位点，故SmaⅠ单切能得到两个片段）。将此两种重组质粒分别命名为pGL3-4HRE-PEⅢ mut 与pGL3-PEⅢ mut 。测序结果完全正确。
因为SV40 的启动活性很强，无法选择只在低氧的肿瘤细胞中启动，进一步改造成miniCMV启动子，使毒素基因只在低氧的肿瘤细胞中表达。
在上游加入BglⅡ位点：AGATCT，在其后加入Sma Ⅰ（CCCGGG），便于鉴定，下游加入Hind Ⅲ（AAGCTT）。根据发明人已有的研究，兔IntronⅡ可以增强启动子的活性。在miniCMV提高特异性的同时，在其后加入兔IntronⅡ，防止启动子的活性过低。
将SON片段中的 72 个aa完全改变成大肠杆菌嗜好的密码子，TNF原有 157 个氨基酸，改短成 87 个氨基酸，对 84、86 和 87 位氨基酸进行改造，使其没有TNF活性，构建GnRH-TNF87-TAP-SON；同时考虑TAP可能会影响表达，构建了GnRH-TNF87-SON，分别接入pLSD载体进行表达。（表达情况见图9）
5.1 温度诱导及包涵体的提取
5.1.1 大体积培养：
将工程菌接种于 50ml LB培养基，同时加入终浓度为 100mg/ml的氨苄青霉素，32℃振摇培养过夜。按2％接种量重新接种于两瓶分别含有 500ml LB/Amp ＋ 培养液的 2L三角瓶中。在 32℃下振摇培养至OD600 约为 0.6 时。然后置于 42℃继续振摇培养诱导 5h。4000g离心、收集菌体，置于-20℃反复冻融。
5.1.2 洗涤细胞：
6000g×15 分钟离心收集细菌，称重湿菌体。
用 3％ Triton X-100 洗涤菌体，搅拌器上搅匀 30 分钟，6000g，15 分钟离心收集用量为 10～50ml缓冲液/1g湿菌体（包括下列各种洗涤缓冲液）。
5.1.3 溶菌酶破细胞：
用缓冲液将细胞悬浮，缓冲液配制：50mmol/L Tris.Cl（pH8.5～9.0），2mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，0.5％ Triton X-100，溶菌酶 1mg/ml。用搅拌器在室温下搅拌，使得悬浮液因溶菌酶的作用而黏稠。
5.1.4 超声破细胞：
每次超打 10 秒，间隔 15 秒，20～50 次作用（视菌体浓度而定），至菌体不再黏稠为止。然后离心收集，6000g×15 分钟。上述操作应在冰水中进行，为防止炭化，超声功率不宜过大，在玻璃烧杯中进行较好，超声波探头深入液面大于 3cm，距杯底 2cm位好。
5.1.5 5％ Triton X-100 洗涤：
用缓冲液彻底悬浮沉淀，搅拌并超声波处理 30 次，参见上述步骤 23。缓冲液为：50mmol/L Tris.Cl（pH8.0），2mmol/L EDTA，5％ TritonX-100。离心收集沉淀，6000g，15 分钟。
5.2 蛋白鉴定
5.2.1 SDS-PAGE蛋白电泳
采用Tris-甘氨酸-SDS-PAGE。使用不连续缓冲系统，分离胶浓度为 15％或 12％，浓缩胶为 5％或 3％。样品加入 3×上样缓冲液，99℃变性 6～10 分钟。离心，取上清上样。在Tris-甘氨酸电泳缓冲液中先以 8mA电泳至样品进入分离胶，再以 15mA电泳至溴酚蓝刚泳出分离胶。
5.2.2 蛋白质染色
5.2.2.1 考马斯亮蓝染色
电泳后用至少 5 倍于凝胶体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，室温下染色 4 小时以上，回收染液，凝胶浸泡于脱色液中数小时，其间更换几次脱色液，直至蛋白条带清晰可见。脱色后，凝胶保存于 20％甘油水溶液中。
5.2.2.2 银染
电泳后用至少 5 倍于凝胶体积的凝胶固定液固定凝胶上的蛋白质，室温下平缓摇动 2 小时以上，50％乙醇洗两次，每次平缓摇动 20 分钟，弃去乙醇，加入新鲜配制的 0.02％硫代硫酸钠溶液浸泡 1 分钟，再用10 倍体积的去离子水洗三次，弃去最后一次洗涤用水后，将凝胶浸泡于至少 5 倍体积的银染液中，室温下平缓摇动 30 分钟，弃去银染液，凝胶两面用去离子水略加冲洗后，加入新鲜配制的显色液，待蛋白条带达到所需强度时立即用终止液终止显色反应。
5.2.3 蛋白质含量的测定
试剂盒蛋白浓度测定（BCA protein Assay Kit）
首先制作标准曲线样品。将BSA原液分别稀释配制 2mg/ml，1.5mg/ml，1.0mg/ml，0.75mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.025mg/ml及 0mg/ml浓度的样品。再将待检测的蛋白质干粉溶于1ml无菌水中。取试剂盒中的A液 5ml与B液 100μl混匀。在 9 个标准样品与 25μl待测蛋白溶液中各加入200μl的A、B混合液。轻混匀后将所有样品置于 37℃反应 30 分钟。然后用酶标仪在 490nm与 630nm的波长下测定样品的OD值。根据标准样品的浓度及OD值制作标准曲线，以蛋白质的浓度为横坐标，OD值为纵坐标作图。再从标准曲线上查出待测样品OD值相应的蛋白浓度，测定范围为 0.01～2.0mg/ml。
6.1.包涵体按每克 20ml比例，用包涵体溶解液（50mM Tris-HCl，2mM EDTA，100mM NaCL，10mM DTT，7M盐酸胍，pH 9.0）溶解包涵体，过 0.45μm孔径的滤膜。
6.2.反相柱：平衡缓冲液为 10％的乙腈：洗脱缓冲液为 90％的乙腈。上样后先用起始缓冲液冲洗柱子，再用 20％的洗脱缓冲液洗 1 个柱体积，20％～60％的洗脱缓冲液洗 5 个柱体积，并在 60％维持 2 个柱体积。用A 260 及A 280 监测，收集各洗脱峰进行SDS-PAGE电泳鉴定。然后，合并含有目的蛋白的各管冷冻抽干。
6.3.离子柱：平衡缓冲液为 0.1M乙酸钠，pH约为 5.1；洗脱缓冲液为 2M氧化钠＋0.1M乙酸钠。用平衡缓冲液溶解冻干后样品，用 20％～80％的梯度洗脱，当电导值达到 100mS/cm时，目的蛋白被洗脱下来，收集各洗脱峰进行SDS-PAGE电泳鉴定。
6.4.疏水柱：平衡缓冲液为 2M氯化钠＋0.1M乙酸钠；洗脱缓冲液为 0.1M乙酸钠，pH约为 5.1。合并目的蛋白峰，0～100％梯度洗脱，当电导降到 100mS/cm时，目的蛋白被洗脱下来，收集各洗脱峰进行SDS-PAGE电泳鉴定。
7.1.按Sambrook等人（分子克隆实验手册第 2 版）所述的方法裂解菌体。
7.2.收集上清，加入 1MCaCl 2 ，使其终浓度为 0.2M，12000g/min离心 10min。
7.3.层析捕获，将澄清的裂解液上Hitrap DEAE阴离子交换柱，此介质能强有力结合核酸；平衡缓冲液为 25mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH8.0；洗脱缓冲液为25 mM Tris-Cl，1mM EDTA，1M NaCl，pH 8.0。上样后先用起始缓冲液冲洗柱子，然后用洗脱缓冲液 0～100％进行洗脱，约 5 个柱体积。当电导值达到 35mS/cm时，DNA和RNA被洗脱下来，收集各管琼脂糖电泳检测。
7.4.精制，将收集的核酸组分上第二根高分辨率的阴离子交换柱resourceQ进一步纯化，除去残余的RNA、染色体DNA、蛋白及内毒素。平衡缓冲液为 25 mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH 8.0；洗脱缓冲液为25 mM Tris-Cl，1mM EDTA，1M NaCl，pH 8.0。洗脱的梯度为 20％～100％，当电导值达到 70mS/cm时目的峰洗脱下来，收集各管琼脂糖电泳检测。
本实施例所用融合蛋白GTTS既作为靶向蛋白，又作为DNA结合蛋白。由于SON富含带正电的赖氨酸，将与带负电性的DNA分子结合，从而使整个复合物分子整体电性趋近于中性，在琼脂糖电泳上表现出电泳迁移率滞后的现象。
将DNA与蛋白溶液按不同比例混合（1∶1，2∶1，4∶1，8∶1），在 0.8％琼脂糖电泳凝胶上观察电泳迁移率变化（图10）。0.8％琼脂糖电泳凝胶上可见DNA-蛋白混合液有明显拖后，其中 1∶1 混合后的滞留结果最好。另外，DNA与蛋白复合物在 4℃放置一个月，0.8％琼脂糖电泳检测，DNA仍几乎完全滞留在加样孔中（图11），说明形成复合物后在 4℃可以稳定保存。
GTTS与含绿色荧光蛋白的质粒pIRES-EGFP复合物转染HeLa细胞（图12）（图略）。
10.1 DNA-蛋白复合物转染细胞后MTT法检测
1.在 96 孔培养板上孵育细胞，每孔约 1×10 4 细胞，18～24 小时。
2.弃去培养液，加入不同浓度的DNA-蛋白复合物 200μl，每个样品做 3 复孔，在有氧或缺氧条件下孵育 36 小时。
3.每孔加入 10μl 10mg/ml MTT，孵育 2～4 小时。
4.加入终止液（20％ SDS，50％二甲基甲酰胺）100μl，37℃孵育。
5.酶标仪波长 490nm检测OD值。
在有氧条件下，蛋白与pGL3-PEⅢ对GnRH阳性的细胞在 8μg/ml剂量组与对照组OD值相比， P ＜ 0.05，均有显著性差异；对GnRH阴性对照细胞无杀伤作用， P ＞ 0.05。对GnRH阳性的HEK293（人胚肾细胞）、HepG2（肝癌细胞）、HeLa（宫颈癌）和MCF-7（乳腺癌）的杀伤率（1-存活率）分别为72.9％、57.9％、54.1％和 51.7％。由此证明了GnRH具有很好的导向性。但这一结果同时说明，这种在有氧条件下出现的强烈的杀伤作用亦可发生在其表面有GnRH受体的一切非肿瘤的正常细胞。因此，这个设计方案对临床应用研究可能有一定的毒副作用。而这一结果，则可以作为下述设计的一个依据。非病毒载体GTTS与pGL3-4HRE-miniCMV-PEⅢ复合物在有氧条件下，对GnRH阳性细胞即使在 8μg/ml剂量组与对照组OD值相比，P ＞ 0.05，没有显著性差异。
在缺氧条件下，非病毒载体蛋白与pGL3-PEⅢ对GnRH阳性的细胞在 8μg/ml剂量组与对照组的OD值相比，P ＜ 0.05，均有显著性差异。对GnRH阳性细胞HepG2、HeLa和MCF-7 的杀伤率（1-存活率）分别为 61.3％、60.1％和 53.9％。这一结果进一步说明，利用SV40 启动子的设计在获得高杀伤率的同时会有一定的毒副作用。只有实现功能基因可控表达设计，才可实现准确的靶向杀伤设计。非病毒载体蛋白与pGL3-HRE4-miniCMV-PEⅢ对CmRH阳性细胞在 8μg/ml剂量组与对照组OD值相比，P ＜ 0.05，具有显著性差异。对HepG2、HeLa和MCF-7 的杀伤率（1-存活率）分别为 57.1％、56.9％和 41.7％。
表1 MTT法检测有氧情况下GTTS与毒素表达型重组体复合物对各种细胞的影响（光密度值反映细胞存活情况）并计算杀伤率（
n
＝3，
± SD）
注：*为与空白对照组进行统计学分析，P＜ 0.05，均有显著性差异：（）内的数值为进一步计算杀伤率的结果
DNAa为pGL3-4HRE-miniCMV-PEⅢmut
DNAb为pGL3-PEⅢmut
蛋白为GTTS
表2 MTT法检测缺氧情况下GTTS与毒素重组体复合物对各种细胞的影响（光密度值反映细胞存活情况）并计算杀伤率（
n
＝3，
± SD）
注：*为与空白对照组进行统计学分析，P＜ 0.05，均有显著性差异：（）内的数值为进一步计算杀伤率的结果
DNAa为pGL3-4HRE-miniCMV-PEⅢmut
DNAb为pGL3-PEⅢmut
蛋白为GTTS
〈110〉中国医学科学院基础医学研究所
〈120〉N型非病毒载体以及包含其的药物组合物
〈130〉 I20031304CB
〈160〉 12
〈170〉 PatentIn version 3.1
〈210〉 1
〈211〉 30
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 1
caacattggt cttatggtct gcgtccgggt 30
〈210〉 2
〈211〉 261
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 2
gtaagatcat cttcaagaac cccgagtgac aagcctgtag cccatgttgt agcaaaccct 60
caagctgagg ggcagctcca gtggctgaac cgccgggcca atgccctcct ggccaatggc 120
gtggagctga gagataacca gctggtggtg ccatcagagg gcctgtacct catctactcc 180
caggtcctct tcaagggcca aggctgcccc tccacccatg tgctcctcac ccacaccatc 240
agccgcatcg ttgtcttttt a 261
〈210〉 3
〈211〉 126
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 3
atgtccgacg ctcaggacgg tccgcgtgtt cgttacaacc cgtacaccac ccgtccgaac 60
cgtcgtggtg acacctggca cgaccgtgac cgtatccacg ttaccgttcg tcgtgaccgt 120
gctccg 126
〈210〉 4
〈211〉 216
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 4
aaagttaaag acactcacga aaaatccaaa aaaaacaaaa accgtgacaa aggtgaaaaa 60
gaaaaaaaac gtgactcttc cctgcgttct cgttccaaac gttccaaatc ttctgaacac 120
aaatcccgta aacgtacttc cgaatctcgt tctcgtgctc gtaaacgttc ctctaaatcc 180
aaatctcacc gttctcagac ccgttcccgt tcccgt 216
〈210〉 5
〈211〉 218
〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
〈400〉 5
〈210〉 6
〈211〉 660
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 6
atgcaacatt ggtcttatgg tctgcgtccg ggtgaattcg taagatcatc ttcaagaacc 60
ccgagtgaca agcctgtagc ccatgttgta gcaaaccctc aagctgaggg gcagctccag 120
tggctgaacc gccgggccaa tgccctcctg gccaatggcg tggagctgag agataaccag 180
ctggtggtgc catcagaggg cctgtacctc atctactccc aggtcctctt caagggccaa 240
ggctgcccct ccacccatgt gctcctcacc cacaccatca gccgcatcgt tgtcttttta 300
tacgtaatgt ccgacgctca ggacggtccg cgtgttcgtt acaacccgta caccacccgt 360
ccgaaccgtc gtggtgacac ctggcacgac cgtgaccgta tccacgttac cgttcgtcgt 420
gaccgtgctc cgggtaccaa agttaaagac actcacgaaa aatccaaaaa aaacaaaaac 480
cgtgacaaag gtgaaaaaga aaaaaaacgt gactcttccc tgcgttctcg ttccaaacgt 540
tccaaatctt ctgaacacaa atcccgtaaa cgtacctccg aatctcgttc tcgtgctcgt 600
aaacgttcct ctaaatccaa atctcaccgt tctcagaccc gttcccgttc ccgttgataa 660
〈210〉 7
〈211〉 174
〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
〈400〉 7
〈210〉 8
〈211〉 528
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 8
atgcaacatt ggtcttatgg tctgcgtccg ggtgaattcg taagatcatc ttcaagaacc 60
ccgagtgaca agcctgtagc ccatgttgta gcaaaccctc aagctgaggg gcagctccag 120
tggctgaacc gccgggccaa tgccctcctg gccaatggcg tggagctgag agataaccag 180
ctggtggtgc catcagaggg cctgtacctc atctactccc aggtcctctt caagggccaa 240
ggctgcccct ccacccatgt gctcctcacc cacaccatca gccgcatcgt tgtcttttta 300
ggtaccaaag ttaaagacac tcacgaaaaa tccaaaaaaa acaaaaaccg tgacaaaggt 360
gaaaaagaaa aaaaacgtga ctcttccctg cgttctcgtt ccaaacgttc caaatcttct 420
gaacacaaat cccgtaaacg tacttccgaa tctcgttctc gtgctcgtaa acgttcctct 480
aaatccaaat ctcaccgttc tcagacccgt tcccgttccc gttgataa 528
〈210〉 9
〈211〉 213
〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
〈400〉 9
〈210〉 10
〈211〉 47
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 10
ccacagtgca tacgtgggct ccaacaggtc ctcttccctc ccatgca 47
〈210〉 11
〈211〉 60
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 11
ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc 60
〈210〉 12
〈211〉 639
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 12
atgctcggcg acggcggcga cgtcagcttc agcacccgcg gcacgcagaa ctggacggtg 60
gagcggctgc tccaggcgca ccgccaactg gaggagcgcg gctatgtgtt cgtcggctac 120
cacggcacct tcctcgaagc ggcgcaaagc atcgtcttcg gcggggtgcg cgcgcgcaac 180
caggacctcg acgcgatctg gcgcggtttc tatatcgccg gcgatccggc gctggcctac 240
ggctacgccc aggaccagga acccgacgca cgcggccgga tccgcaacgg tgccctgctg 300
cgggtctatg tgccgcgctc gagcctgccg ggcttctacc gcaccagcct gaccctggcc 360
gcgccggagg cggcgggcga ggtcgaacgg ctgatcggcc atccgctgcc gctgcgcctg 420
gacgccatca ccggccccga ggaggaaggc gggcgcctgg agaccattct cggctggccg 480
ctggccgagc gcaccgtggt gattccctcg gcgatcccca ccgacccgcg caacgtcggc 540
ggcgacctcg acccgtccag catccccgac aaggaacagg cgatcagcgc cctgccggac 600
tacgccagcc agcccggcaa accgccgaag gacgaactg 639
图1
图6 重组体pGL3-4HRE的构建示意图
图7 重组体pGL3-PEⅢ mut 的构建图谱
图8 重组体pGL3-4HRE-miniCMV-PEⅢ mut 构建示意图
图9 GnRH-TNF87-TAP-SON（GTTS）、GnRH-TNF87-SON（GTS）两种蛋白诱导结果
图14 有氧条件下 2BS细胞不同给药组的OD值
图15 有氧条件下HEK293 细胞不同给药组的OD值
图16 有氧条件下HepG2 细胞不同给药组的OD值
图17 有氧条件下HeLa细胞不同给药组的OD值
图18 有氧条件下MCF-7 细胞不同给药组的OD值
图19 缺氧条件下 2BS细胞不同给药组的OD值
图20 缺氧条件下HepG2 细胞不同给药组的OD值
图21 缺氧条件下Hela细胞不同组药组的OD值
图22 缺氧条件下MCF-7 细胞不同给药组的OD值
图23 实验流程图