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人心钠素基因、其强效突变型与人脑钠素基因在治疗相关疾病中的应用
本发明涉及强效突变型人心钠素基因，包含所述基因的表达型重组体及所述基因在基因治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压中的应用。由所述基因编码的强效突变型人心钠素多肽也是本发明的一个方面。另外，本发明还涉及所述强效突变型人心钠素基因、野生型人心钠素基因、人脑钠素基因单独或复合治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压的应用。
1.编码强效突变型人心钠素的多核苷酸，其为SEQ ID NO∶3 所示的序列。
2.强效突变型人心钠素多肽，其为SEQ ID NO∶4 所示的氨基酸序列。
3.包含权利要求 1 的多核苷酸的表达型重组体。
4.如权利要求 3 所述的表达型重组体，其是基于逆转录病毒、腺病毒或腺病毒相关病毒的病毒载体或含有真核细胞表达元件的普通质粒载体的表达型重组体。
5.如权利要求 4 的表达型重组体，其为pLHY24，图谱见图4。
6.如权利要求 4 所述的表达型重组体，其为pYF1，图谱见图5。
7.包含权利要求 3～6 任一项的表达型重组体的基因治疗药物。
8.权利要求 3～6 任一项的表达型重组体在制备用于治疗肾病综合征的基因治疗药物中的应用。
9.权利要求 3～6 任一项的表达型重组体在制备用于治疗慢性心功能不全的基因治疗药物中的应用。
10.权利要求 3～6 任一项的表达型重组体在制备用于治疗高血压的基因治疗药物中的应用。
11.包含权利要求 3～6 任一项的编码强效突变型人心钠素的表达型重组体和选自如下一组的编码人脑钠素的表达型重组体的基因治疗药物，其中所述组成为：a）包含人脑钠素基因的表达型重组体，其中人脑钠素基因的核苷酸序列为SEQ ID NO∶5 所示，b）表达型重组体pLT28，图谱见图8，及c）表达型重组体pYF2，图谱见图9。
12.权利要求 3～6 任一项的编码强效突变型人心钠素的表达型重组体和选自如下一组的编码人脑钠素的表达型重组体在制备用于复合治疗肾病综合征的基因治疗药物中的应用，其中所述组成为：a）包含人脑钠素基因的表达型重组体，其中人脑钠素基因的核苷酸序列为SEQ ID NO∶5 所示，b）表达型重组体pLT28，图谱见图8，及c）表达型重组体pYF2，图谱见图9。
13.权利要求 3～6 任一项的编码强效突变型人心钠素的表达型重组体和选自如下一组的编码人脑钠素的表达型重组体在制备用于复合治疗慢性心功能不全的基因治疗药物中的应用，其中所述组成为：a）包含人脑钠素基因的表达型重组体，其中人脑钠素基因的核苷酸序列为SEQ ID NO∶5 所示，b）表达型重组体pLT28，图谱见图8，及c）表达型重组体pYF2，图谱见图9。
14.权利要求 3～6 任一项的编码强效突变型人心钠素的表达型重组体和选自如下一组的编码人脑钠素的表达型重组体在制备用于复合治疗高血压的基因治疗药物中的应用，其中所述组成为：a）包含人脑钠素基因的表达型重组体，其中人脑钠素基因的核苷酸序列为SEQ ID NO∶5 所示，b）表达型重组体pLT28，图谱见图8，及c）表达型重组体pYF2，图谱见图9。
本发明涉及强效突变型人心钠素基因，包含所述基因的表达型重组体及所述基因在基因治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压中的应用。本发明还涉及由所述基因编码的强效突变型人心钠素多肽。本发明还涉及所述强效突变型人心钠素基因或野生型人心钠素基因单独或与人脑钠素基因复合治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压的应用。
心钠素是一种主要由心房肌细胞合成和分泌的多肽类激素，脑钠素则主要由心室肌细胞合成和分泌。利用心钠素和/或脑钠素多肽所做的研究表明，它们均具有强烈的抑制肾素-血管紧张素（RAS）系统、利尿、利钠、舒张血管和参与水电平衡调节等广泛的生理作用。虽然体内外实验均已证实心钠素多肽和脑钠素多肽具有上述广泛的生理作用，人们也希望利用它们来治疗某些疾病如肾病综合征、慢性心功能不全和高血压，但现实情况却是，人们无法克服其半衰期短的缺陷。静脉滴注似乎可以弥补此不足，可长时期灌注也不现实。因此，有关心钠素和脑钠素的基础研究和临床应用都是不能令人满意的。
另一方面，因为心钠素和脑钠素具有抑制RAS系统、利尿、利钠、舒张血管和调节电解质平衡等广泛的生理作用，所以，用心钠素和/或脑钠素基因作为功能基因的基因疗法来治疗或辅助治疗肾病综合征和慢性心功能不全还是极有可能的。但是目前的基因治疗方案大多是根据单基因遗传病基因治疗的策略（补偿、抑制或活化等）来制定的。比如，抑制癌基因或激活抗癌基因的表达、补偿明显缺乏的某种功能分子等等。可以看出，这些方案对于疾病遗传基础的针对性和对其遗传背景知识的依赖性都是非常强的。然而，对于多基因疾病来说，当前还无法了解或彻底揭示其遗传本质。再者，就是在已经肯定了它们的相关基因或致病基因的情况下，也难以采用上述策略来一一对应地来同时纠正多个缺陷基因的功能。由此看来，“缺什么补什么”的原则是不适于多基因疾病的基因治疗的，至少目前是如此。还有，据估计，在 6000 多种遗传性疾病中，单基因疾病只占 30％，而多基因疾病却占 70％。多基因疾病的发病率高、危害严重、损失巨大并且难以治愈的特点又要求人们不断寻求新的治疗手段。有鉴于此，本发明人提出了表型基因治疗的策略。这是一种在不了解疾病的遗传背景的情况下，直接针对其表型（症状）而进行的基因治疗。就是利用基因治疗的原理和方法将某种或几种可以产生消除病征、恢复正常生理表型的物质的基因（在本发明中是心钠素基因和脑钠素基因）导入患者体内，并在其中持续、稳定地表达，从而实现治疗或治愈患者本身疾病的目的。这就像是将微型药厂建在体内，可以连续不断地为患者提供药物分子。也就是说，与传统治疗手段相比，表型基因治疗只是在药物形式和给药方式上有所改变，即直接使用DNA药物。如能将此设想变为现实，将为许多发病率高、危害严重而现时又难以治疗的多基因疾病的治疗开辟一条新路。
因此，本发明的一个目的在于提供一种强效突变型人心钠素基因，其编码的强效突变型人心钠素相比于野生型人心钠素具有延长的半衰期。
本发明的另一目的在于提供包含所述强效突变型人心钠素基因、野生型人心钠素基因或人脑钠素基因的表达型重组体。
本发明的再一目的在于提供所述强效突变型人心钠素基因或野生型人心钠素基因单独或与人脑钠素基因复合在基因治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压中的应用。
根据本发明的一个方面，提供了一种强效突变型人心钠素的重组DNA（mhANP）及包含所述DNA的表达型重组体。所述强效突变型人心钠素的重组DNA（mhANP）的核苷酸序列如SEQ ID NO∶3 所示，其是将野生型人心钠素 28 肽（hANP28）编码区的第 8 和第 12 个氨基酸的密码子TTC/Phe 8 和ATG/Met 12 分别突变成mhANP中对应的TCC/Ser 8 和ATA/Ile 12 的结果，以下简称该重组DNA为mhANP。mhANP所编码的活性多肽mhANP 28 的氨基酸序列如SEQ ID NO∶4 所示。
本发明的基因mhANP可以根据本领域公知的技术引入各种表达载体以构建表达型重组体，从而表达所述强效突变型人心钠素多肽mhANP 28 。这些表达重组体也可用于治疗肾病综合征、慢性心功能不全、高血压等疾病。这样的表达型重组体的例子包括pLHY24、pYF1 等（详见实施例）。
本发明的另一方面涉及强效突变型人心钠素基因或野生型心钠素基因在基因治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压中的应用。
本发明的再一方面涉及强效突变型人心钠素基因或野生型人心钠素基因与人脑钠素基因复合在基因治疗肾病综合征、慢性心功能不全和高血压中的应用。
在本发明的这一治疗应用方面，利用了一种具有少尿特征的肾病综合征动物模型，即由阿霉素（adriamycin，ADR）诱导的大鼠肾病综合症（NS）模型。以大鼠NS模型作为心钠素基因体细胞基因治疗的对象，主要是为了探讨在肾功能出现障碍的情况下，心钠素基因以及心钠素和脑钠素基因经体细胞转移后的长期利尿、利钠作用和肾保护功能，为治疗肾病综合征提供参考。在本发明的一个实施方案中，经肌肉将mhANP的真核细胞表达重组体pLHY24 的裸露DNA导入这种具有少尿特征的模型动物体内，最后观测到了持续和明显的利尿作用，对受损肾脏也有明显的保护作用，而且没有发现明显的毒副作用（见实施例）。
另外，本发明利用了一种机械损伤所致的心力衰竭模型动物，即心瓣膜损伤法获得的大鼠心衰模型，并采用基因治疗的直接体内法，经肌肉将mhANP和hBNP的表达型重组体pLHY24 和pLT28 的裸露DNA导入心力衰竭模型动物体内，最后观测到了缺血心脏心电图的明显改善、心肌增生受到抑制和能量代谢显著改善等变化，说明利钠多肽基因如心钠素和脑钠素在体内的持续表达对心力衰竭具有良好的治疗作用。
本发明还利用了自发性高血压大鼠（SHR）模型测试了本发明的mhANP多肽对降低动物血压或抑制动物血压升高的作用。
如上所述，本发明的提供的是一种表型基因治疗的策略，与传统的治疗手段相比，表型基因治疗所用药物在形式上有了根本性的改变，不再是某种基因的最终表达产物，而是编码这种表达产物的基因本身，即所谓的基因药物或DNA药物。所以，本发明具有重要的理论意义和现实意义。
在本发明中，例如，为了获得肯定的结果，首先用 5mg/kg体重的剂量，采用基因治疗中基因转移的直接体内法，将hANP和mhANP的真核细胞表达型重组体pLHY19 和pLHY24 以裸露DNA的形式分别导入没有任何遗传背景的NS模型动物体内，最后，观测到了持续和明显的利尿作用。对导入DNA药物后第 5 天、第 10 天和第 15 天的尿量/体重比的增长量（分别与治疗前的值相比）的分析表明，mhANP在第 5 天和第10 天的利尿作用强度分别是hANP的 1.60 倍（2.75/1.72）和 2.04 倍（6.89/3.37）。该结果说明，通过将野生型的hANP改造成突变型的mhANP，我们达到了预期的突变增效的目的，获得了强效突变型的人心钠素基因mhANP。
以下将参照序列表、附图和实施例详细描述本发明，其中：
SEQ ID NO∶1 是野生型人心钠素基因hANP的核苷酸序列，其中的黑体字示活性多肽hANP 28 的编码区序列。
SEQ ID NO∶2 是hANP所编码的蛋白质的氨基酸序列，其中的黑体字示活性多肽hANP 28 的氨基酸序列
SEQ ID NO∶3 是mhANP的核苷酸序列，其中的黑体字示活性多肽mhANP 28 的编码区序列，黑斜体并且有下划线者是mhANP 28 特有的突变密码子。
SEQ ID NO∶4 是mhANP所编码的蛋白质的氨基酸序列，其中的黑体字示活性多肽mhANP 28 的氨基酸序列，黑斜体并且有下划线者为活性多肽mhANP 28 特有的氨基酸。
SEQ ID NO∶5 是野生型人脑钠素基因hBNP的核苷酸序列，包括 3 外显子，2 个内含子。其中的大写字母示外显子，小写字母示内含子。
SEQ ID NO∶6 是hBNP所编码的蛋白质的氨基酸序列，其中的黑体字表示活性多肽hBNP 32 的氨基酸序列。
图1 示出了重组体pLT17 的构建过程。
图2 示出了重组体pLT18 和pLT19 的构建过程。
图3 示出了重组体pLHY19 的构建过程。
图4 示出了重组体pLHY24 的构建过程。
图5 示出了重组体pYF1 的构建过程。
图6 示出了重组体pYB1 的构建过程。
图7 示出了重组体pLT25 的构建过程。
图8 示出了重组体pLT28 的构建过程。
图9 示出了重组体pYF2 的构建过程。
图10 示出了静脉注射阿霉素对大鼠体重的影响（实施例4）。
图11 示出了静脉注射阿霉素对大鼠尿量的影响（实施例4）。
图12 示出了静脉注射阿霉素对大鼠尿尿蛋白的影响（实施例4）。
图13 示出了突变对心钠素基因利尿作用的影响（实施例4）。
图14 示出了心钠素基因突变对动物“尿量/体重比的增长量”的影响（实施例4）。
图15 示出了静脉注射阿霉素对大鼠体重的影响（实施例5）。
图16 示出了静脉注射阿霉素对大鼠尿量的影响（实施例5）。
图17 示出了静脉注射阿霉素对大鼠尿尿蛋白的影响（实施例5）。
图18 示出了逆转录病毒载体介导mhANP和hBNP基因转移对动物尿量的影响（实施例5）。
图19 示出了逆转录病毒载体介导mhANP和hBNP基因转移对动物尿蛋白的影响（实施例5）。
图20 示出了普通质粒载体介导mhANP和hBNP基因转移对模型动物尿量的影响（实施例6）。
图21 示出了肌内注射mhANP和hBNP基因两周后对慢性心功能不全动物心脏重量的影响（实施例7）。
图22 示出了肌内注射mhANP和hBNP基因两周后对慢性心功能不全动物心脏指数的影响（实施例7）。
图23 示出了肌内注射mhANP和hBNP基因对慢性心功能不全动物心率的影响（实施例7）。
图24 示出了肌内注射mhANP和hBNP基因对慢性心功能不全动物能量代谢物质ATP的影响（实施例7）。
图25 示出了肌内注射mhANP和hBNP基因对慢性心功能不全动物能量代谢物质Pcr的影响（实施例7）。
图26 示出了肌内注射mhANP和hBNP基因对慢性心功能不全动物能量代谢物质LA的影响（实施例7）。
图27 示出了肌内注射mbANP和hBNP基因对慢性心功能不全动物血压的影响（实施例7）。
图28 示出了肌内注射mhANP和hBNP基因对慢性心功能不全动物体重的影响（实施例7）。
图29 示出了肌内注射mhANP基因对慢性心功能不全动物心电图的影响（实施例7）。
图30 示出了mhANP基因经胶原法转移对SHR大鼠血压的影响（实施例8）。
图31 示出了mhANP基因经胶原法转移对SHR大鼠尿量的影响（实施例8）。
为提高心钠素基因产物的生理活性和延长其半衰期，用定点突变法对其基因进行了改造。
1.编码hANP 28 第 8 和 12 位氨基酸的密码子的突变改造
为延长心钠素的半衰期和提高其生理活性，对野生型人心钠素基因中成熟 28 肽hANP 28 编码区的第 8 和第12 位密码子进行突变改造。将TTC/Phe 8 和ATG/Met 12 分别突变成TCC/Ser 8 和ATA/Ile 12 ，从而获得突变型的人心钠素基因mhANP。为达此目的，设计、合成和选择使用了下列PCR引物（引物T3 和T7 为通用引物），其序列如下：
T3∶5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’
T7∶5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3’
Pm1∶5’-GCTGCTC CTGCAG GGGGCAGGATAGACAGGATTGG-3’
Pm2∶5’-CTGCCCC CTGCAG GAGCAGCTGGATCTCCG-3’
对于Pm1 来说，除了要将hANP 28 编码区第 12 位氨基酸Met的密码子ATG改为Ile的密码子ATA外，还在其 5’端的CG之间加入了四个碱基TGCA，以引进一个PstI酶切位点。对于Pm2 来说，除了要将第 8位氨基酸的密码子由TTC/AAG 8 改成TCC/AGG 8 外，也在其旁边引进了PstI酶切位点。引物T3 和Pm2 的PCR扩增产物长 450bp，Pm1 和T7 的扩增产物长 120bp。
1.1.对hANP 28 第 8 位氨基酸密码子的突变改造
以重组体pLHY9（克隆有野生型hANP cDNA的pBluescript Ⅱ SK载体，本发明人早期构建）中的hANP cDNA为模板，首先利用引物T3 和Pm2（其中含有 1 个PstI位点和hANP 28 第 8 位氨基酸的突变密码子TTC/Phe 8 -TCC/Ser 8 ）进行PCR，以完成对hANP 28 第 8 位氨基酸密码子的突变改造。PCR反应参数为：100ul反应体系，引物各 25pmol，dNTP 20nmol，水浴中煮沸 10 分钟，立即置冰浴中 5 分钟，加pfu DNA聚合酶 2 单位，石蜡油 50ul，混匀后直接进入循环：94℃35 秒、54℃60 秒、72℃60 秒，共 30 个循环，72℃延伸PCR产物 10 分钟。抽提、纯化引物T3 和Pm2 的PCR扩增产物，用BamHI和PstI双酶切后，用低融点琼脂糖凝胶电泳法回收PCR产物中的 400bp片段，与同样经BamHI和PstI处理过的质粒载体相连，从而获重组体pLT17（图1）。
2.2.对hANP 28 第 12 位氨基酸密码子的突变改造
以重组体pLHY9（见上述）的hANP cDNA为模板，用引物T7 和Pm1（其中含有 1 个PstI位点和hANP 28 第 12 位氨基酸的突变密码子ATG/Met 12 →ATA/Ile 12 ）进行PCR，以完成对hANP 28 第 12 位氨基酸密码子的突变改造。PCR反应参数同前。抽提、纯化引物T3 和Pm2 的PCR扩增产物，用PstI和KpnⅠ双酶切后再抽提、纯化之，直接与同样经BamHI和PstI处理过的质粒载体相连，获重组体pLT18（图2）。
由重组体pLT18 中hANP cDNA的序列分析结果知道，在BamHI至KpnⅠ之间的序列中，除了我们特意加的PstI位点中间的 4 个碱基外，其他序列已与预计的突变改型hANP（hmANP）cDNA一致。用PstI酶切、T4 DNA聚合酶削平PstI酶切后产生的突出的 3’端后自身连接的办法正好可以除去这 4 个额外的碱基。所以，用PstI切割重组体pLT18，在dNTP存在的条件下用T4 DNA聚合酶削平，自身连接获重组体pLT19（图2）。
为实现在真核细胞中表达心钠素的目的和研究突变对心钠素多肽的生理活性及其半衰期的影响，用逆转录病毒载体构建了hANP和mhANP的表达型重组体pLHY19 和pLHY24，用普通质粒载体构建了mhANP的表达型重组体pYF1。
1.含hANP的重组体pLHY19 的构建
构建pLHY19 时用到的pLHY17 是一过渡质粒，它是将人巨细胞病毒CMV的启动子（CMV）、兔β-珠蛋白基因的第二内含子（intron）和野生型人心钠素基因（hANP）共同组成的表达元件组合克隆进普通质粒载体pBluescriptⅡ SK＋/-中的结果。构建该过渡质粒的目的在于便于将这一表达元件组合整体克隆进逆转录病毒载体pLNCX。
pLNCX全长 6620bp，主要由Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）的长末端重复序列（5’LTR和 3’LTR）、其 5’LTR启动子控制的便于真核细胞筛选的抗性基因Neo r 、大肠杆菌素复制起点（ColE1）、便于原核细胞筛选的抗性基因Amp r 和供外源基因插入的多克隆位点等组成。
构建pLHY19 的目的是为了便于野生型人心钠素基因hANP在真核细胞中表达。构建的方法是用XbaI切重组质粒pLHY17，在dNTP存在的条件下，用Klenow补平，再用HindⅢ切割，回收由人巨细胞病毒的启动子CMV、兔β-珠蛋白基因的第二内含子（intron）和野生型人心钠素基因hANP共同组成的表达元件组合（1870bp的片段），然后与经BamHI、Klenow和HindⅢ处理过的逆转录病毒载体pLNCX相连，从而获重组体pLHY19（图3）。
2.含mhANP的重组体pLHY24 的构建
构建pLHY24 时所用到的pLHY23 也是一过渡质粒，它是将CMV的启动子、兔β-珠蛋白基因的第二内含子和突变型人心钠素基因mhANP共同组成的表达元件组合克隆进质粒载体pBluescript Ⅱ SK＋/-中的结果。构建该过渡质粒的目的是将这一表达元件组合整体克隆进逆转录病毒载体pLNCX。
构建pLHY24 的目的是突变型人心钠素基因mhANP在真核细胞中的表达。其方法是用XbaI切重组质粒pLHY23，在dNTP存在的条件下，用Klenow补平，再用HindⅢ切割，回收 1870bp的片段，然后与同样经XbaI、Klenow和HindⅢ处理过的逆转录病毒载体pLNCX相连，从而获重组体pLHY24（图4）。
3.含mhANP的重组体pYF1 的构建
构建pYF1 所用质粒载体pcDNA3.1（-）Myc-His A是Invitrogen公司的产品。在该载体中，除一般质粒都具有的抗性基因Amp r 、复制起点ColE1 和供目的基因插入的多克隆位点外，还有控制目的基因表达的启动子CMV、牛生长激素（BGH）poly（A）信号BGHpA、SV40 启动子、由SV40 启动子控制的抗性基因Neo r 和SV40 的poly（A）信号。
构建pYF1 的目的在于用普通质粒来介导突变型人心钠素基因mhANP在真核细胞中的表达。其方法是用SalI和HindⅢ双酶切重组质粒pLHY24，回收由兔β-珠蛋白基因第二内含子（Intron）和mhANP cDNA构成的 1120bp片段，与经XhoI和HindⅢ处理过的质粒载体pcDNA3.1（-）Myc-HisA相连，从而获重组体pYF1（图5）。
1.重组体pYB1 的构建
为获得编码人脑钠素的基因组DNA hBNP，设计了两个PCR引物P1 和P2，在P1 和P2 中分别引入了EcoRI和ClaI识别切割位点，其序列如下：
P1：5’-CGC GAA TTC ACC ATG GAT CCC CAG ACA GCA CC-3’
P2：5’-CGC ATC GAT TTA ATG CCG CCT CAG CAC-3’
PCR反应参数为：100ul反应体系，以 100ng人基因组DNA作模板，引物各 25pmol，dNTP 20nmol，水浴中煮沸 10 分钟，立即置冰浴中 5 分钟，加pfu DNA聚合酶 2 单位，石蜡油 50ul，混匀后直接进入循环：94℃30 秒、56℃36 秒、72℃90 秒，共 30 个循环，72℃延伸PCR产物 10 分钟。抽提、纯化引物PCR产物，用EcoRI和ClaI分别切之，用低融点琼脂糖凝胶电泳法回收 1.2kb PCR产物，再抽提、纯化一次，与同样经EcoRI和ClaI处理过的质粒载体pBluescript Ⅱ SK相连，从而获重组体pYB1（图6）。
2.重组体pLT25 的构建
pLHY16 也是一过渡质粒，它是将CMV的启动子、兔β-珠蛋白基因的第二内含子组成的表达元件组合克隆进质粒载体pBluescriptⅡ SK＋/-中的结果。构建该过渡质粒的目的是为了便于将有关目的基因克隆到这一表达元件组合的下游，进而便于将它们整体克隆进有关的表达载体中。
构建pLT25 的目的是为了野生型人脑钠素基因hBNP在真核细胞中表达。其方法是用EcoRI切质粒pYB1，在dNTP存在的条件下用Klenow补平，再用KpnⅠ切割，回收 1.2kb的片段，然后与经BamHⅠ、Klenow和KpnⅠ处理过的质粒pLHY16 相连，获重组体pLT25（图7）。
3.hBNP的逆转录病毒表达重组体pLT28 的构建
用SalI切割pLT25，回收1.84kb的DNA片段，然后与经SalI和XhoI处理过的质粒pLHY24 相连，获重组体pLT28（图8）。
4.hBNP的普通质粒型表达重组体pYF2 的构建过程
用EcoRⅠ切重组体pYB1，在dNTP存在的条件下用Klenow补平，再用XhoⅠ切割，回收 1.2kb的hBNP片段，与经BamHⅠ、Klenow和XhoI处理过的质粒pYF1 相连，获重组体pYF2（图9）。
1.hANP和mhANP表达重组体pLHY19 和pLHY24 质粒DNA的制备
1.1 用碱裂解法大量制备质粒DNA
1.2 用PEG沉淀法纯化质粒DNA
具体步骤见分子克隆实验手册。
2.大鼠肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）动物模型的制备
5 周龄雄性Wistar大鼠购回后适应环境 1～2 周，编号、称体重、随机分组。腹腔注射 2％戊巴比妥钠（45mg/kg体重）麻醉，待麻醉药物生效后于温水中浸泡鼠尾，使血管扩张。将水擦干，用 75％酒精棉球擦拭鼠尾。按 5.0mg/kg体重的剂量经尾静脉缓慢注入溶于生理盐水的阿霉素（adriamycin，ADR，2mg/ml）。每周定时称量体重、收集尿液和测定尿蛋白浓度等指标。
3.代谢笼法收集尿样
定时按 5ml生理盐水/100g体重的剂量给大鼠灌胃，置代谢笼中（1 只/笼），禁食、禁水 6 小时并收集尿样。准确测定尿液体积，3000rpm离心 5 分钟，以去除颗粒性杂质，用于测定尿蛋白浓度等指标。
4.裸露DNA的肌内注射
将经纯化的重组体pLHY24 和pLHY19 的裸露DNA溶于生理盐水中，使成 1mg/ml的溶液。用腹腔注射戊巴比妥钠（25mg/kg体重）的方法麻醉具少尿特征的肾病综合征模型动物，按 2.5mg/kg体重的剂量在其双后肢肌肉（3 处/肢）分别注入约占总量 1/6 的DNA溶液，缓慢推入溶液，迅速拔针，并在注射部位略加按摩。
5.尿蛋白的定性、定量分析
5.1 定性分析
取尿样 1ml，加 20％硫柳酸（20％磺基水杨酸∶95％酒精＝2∶1）1～2 滴，混匀后以混浊程度初步判断蛋白含量。如结果为（-）～（＋），定量分析时，尿样不稀释，如结果为＋＋、＋＋＋和＋＋＋＋，尿样需分别稀释 4、6 和 8 倍。
5.2 定量分析
试剂：25％牛血清白蛋白（25mg牛血清白蛋白，5ml 10％叠氮钠，加去离子水至 100ml），12.5％三氯醋酸（AcCl 3 ）。
方法：
标准对照：
标准管：4ml牛血清白蛋白＋1mlAcCl 3
对照管：4ml生理盐水＋1ml AcCl 3
样品管：
a.不稀释时：
标准管：4ml尿样＋1ml AcCl 3
对照管：4ml尿样＋lml去离子水
b.稀释 4 倍时：
标准管：1ml尿样＋3ml去离子水＋1ml AcCl 3
对照管：1ml尿样＋4ml去离子水
c.稀释 6 倍时：
标准管：1ml尿样＋5ml去离子水＋1ml AcCl 3
对照管：1ml尿样＋6ml去离子水
d.稀释 8 倍时：
标准管：1ml尿样＋7ml去离子水＋1ml AcCl 3
对照管：1ml尿样＋8ml去离子水
测定条件：72-1 分光光度计，波长 420nm，用对照管调零和调 100。
计算公式：样品OD值/标准OD值×25×稀释倍数＝尿蛋白浓度（mg％）
6.统计学处理
对尿量/体重比和尿蛋白浓度等实验数据进行统计学处理。
7.结果
为获得肯定结果，首先使用了较高剂量的基因药物。hANP和mhANP的表达型重组体pLHY19 和pLHY24 裸露DNA的剂量均为 5mg/kg体重。采用直接体内法，经后肢肌肉将其分别注入NS模型动物体内，其结果如下：
7.1 大鼠NS动物模型的制备
按 7.5mg/kg体重的剂量经尾静脉缓慢注入溶于生理盐水的ADR后，每周定时观测体重、尿量和尿蛋白浓度等指标。经统计学分析，发现注射ADR后，大鼠体重的增长速度明显降低，尿量明显减少，尿蛋白浓度明显增加。结果见图10、图11 和图12。
7.1.2 心钠素基因突变前后利尿活性的比较
ADR诱导的大鼠NS动物模型具有少尿的特征。通过肌内注射法将hANP和mhANP基因的表达型重组体pLHY19 和pLHY24 分别导入动物体内后，与注射空载体的非治疗组的动物相比，治疗组动物的尿量明显增加，到第 10 和第 15 天时，mhANP组的尿量已恢复到正常组的水平。hANP和mhANP利尿作用的有效期分别为 2 周和 3 周（结果见图13）。
经对导入DNA药物后动物“尿量/体重比的增长量”（分别与治疗前的值相比）的分析，发现mhANP在第 5、10 和 15 天的利尿作用强度分别是hANP的 1.60 倍（2.75/1.79）、2.04 倍（6.89/3.37）和 1.91倍（10.05/5.26）。心钠素基因突变对模型动物“尿量/体重比的增长量”的影响见图14。
以上结果说明，通过对hANP基因的定点突变，达到了预期的增强生物活性和延长有效作用时间的目的，亦即我们获得了强效突变型的人心钠素基因mhANP。
1.方法：除有特别说明外，试验方法同前。
在本实施例中所用的mhANP基因的逆转录病毒表达型重组体为pLHY24。为增强本策略的实用性和探讨治疗的最佳方案，把基因药物的剂量降到了 2.5mg/kg体重，还专门为重组体pLHY24 设 1 个“0.25mg/kg体重”组。
本实施例所用的mhANP基因的表达型重组体是pLHY24。构建它们所用的载体是在国内外获广泛应用的逆转录病毒载体pLNCX。至今未见逆转录病毒载体因为重组而恢复复制能力的报道、也未见其因为随机插入而导致肿瘤的报道的事实说明，逆转录病毒载体的安全性是非常高的。
2.结果：
2.1 NS动物模型的制备
所用ADR的剂量为 5mg/kg体重。具有少尿特征的NS模型动物的体重、尿量和尿蛋白浓度等指标的变化情况见图15、图16 和图17。
2.2 肌内注射mhANP基因对NS动物尿量的影响
ADR诱导的NS动物具有少尿的特征。通过肌内注射法将mhANP基因的表达型重组体导入其体内后，与注射空载体的非治疗组的动物相比，治疗组动物的尿量明显增加，有的已达到或超过了正常组的水平。这种基因导入方法的利尿作用有效期为 2～3 周。结果见图18。
2.3 肌内注射mhANP和hBNP基因对NS动物尿蛋白的影响
在导入mhANP基因后的三周内，与非治疗组动物相比，治疗组动物的尿蛋白有降低的趋势。结果见图19。
2.4 尿钠和尿钾
与非治疗组的模型动物相比，治疗组动物的尿钠和尿钾浓度无明显变化。
2.5 组织学改变
mhANP基因经体细胞转移，可以减轻ADR所致NS动物组织器官的损伤程度和促进其恢复。对肾脏来说，mhANP基因的导入，可减轻肾小管上皮的变性坏死和促进其恢复再生，减少肾曲管和集合管内的蛋白管型，减少炎症细胞的浸润。同样，mhANP基因导入后，模型动物的心脏损伤也有恢复趋势。比如心肌颗粒性变减轻，间质中炎性细胞浸润减少，心肌细胞排列较整齐，无明显肌凝集现象等。
1.方法：除有特别说明外，试验方法同前。
在本实施例中所用的mhANP基因的表达型重组体为pYF1。为进一步增强本策略的实用性和探讨治疗的最佳方案，把基因药物的剂量降到了 0.25mg/kg体重。
本实施例所用的mhANP基因的表达型重组体是pYF1。构建它们所用的载体是获广泛应用的普通质粒载体pcDNA3.1（-）Myc-HisA。
2.结果：
2.1 NS动物模型的制备
制备NS动物模型的方法同前。
2.2 肌内注射mhANP基因对NS动物尿量的影响
将mhANP基因的普通质粒表达型重组体pYF1 的裸露DNA导入其体内的方法同前，剂量为 0.25mg/kg体重。非治疗组动物则注射等容积、等质量的空载体pcDNA3.1（-）Myc-His A。对肌内注射mhANP基因后第 3、6 和 9 天的尿量/体重比进行分析，发现治疗组动物的尿量明显增加。mhANP基因组的有效期为 9天。结果见图20。
2.3 肌内注射mhANP和hBNP基因对NS动物尿蛋白的影响
在导入mhANP和hBNP基因后的 9 天内，动物尿蛋白浓度未见明显降低。
2.4 尿钠和尿钾
在导入mhANP和hBNP基因后的 9 天内，动物尿钠和尿钾浓度无明显变化。
1.mhANP和hBNF表达重组体pLHY24 和pLT28 质粒DNA的制备
1.1 碱裂解法大量制备质粒DNA
1.2 PEG沉淀法纯化质粒DNA
具体步骤详见分子克隆实验手册（冷泉港实验室出版社）。
2.慢性心功能不全动物模型的构建
采用机械性心瓣膜损伤法构建心力衰竭动物模型。腹腔注射戊巴比妥钠（50mg/kg体重）麻醉动物，分离右颈总动脉，缓慢插入前端剪成斜面的心导管，心导管的另一端连接压力换能器（YP100 型），由LMS-2B型二道生理记录仪记录血压。将心导管缓慢插入，根据血压波形判断心导管前端的位置。当导管通过主动脉瓣进入心室，记录心室内压波，再轻拉导管使其退出心室，出现动脉血压波。推拉导管，使其反复进出心室，以破坏主动脉瓣。大鼠主动脉瓣受损后，心脏因为动脉血回流，心脏排空不全，前负荷增加，术后 4～6 周，动物会出现心肌缺血性心电图，心肌因为明显的代偿性增生而肥大，心脏重量和心脏指数（心脏重量/体重）增加，心肌内的能量物质如ATP（三磷酸腺苷）、Pcr（磷酸肌酐）含量减少，而能量代谢废物LA（乳酸）的含量则明显增加。Sham组（假手术组）动物是指经同样手术但心瓣膜未受损伤的动物。对于这种动物的处理，除其心瓣膜未受损伤外，其他则与采用机械性心瓣膜损伤法构建心力衰竭动物模型时的完全一样。
3.裸露DNA的肌内注射
将经纯化的mhANP和hBNP基因的重组体pLHY24 和LT28 的裸露DNA溶于生理盐水中，使成 1mg/ml的溶液。用腹腔注射戊巴比妥钠（30mg/kg体重）的方法麻醉模型动物。按 5mg/kg体重的剂量在其后双肢肌肉（3 处/肢）分别注入约占总量 1/6 的DNA溶液。缓慢推入溶液，迅速拔针，并在注射部位略加按摩。对照组（非治疗组）和假手术组动物注射等容积的生理盐水。
4.治疗结果
4.1 肌内注射mhANP和BNP基因对模型动物心脏重量的影响
大鼠主动脉瓣受伤后，心脏因动脉血回流而排空不全，前负荷增加，饲养 6 周后，心脏表现出明显的代偿性增生，心肌肥大，心脏重量和心脏指数（心脏重/体重）增加。对照组（非治疗组）动物平均心脏重量比假手术组增加 50％以上。心衰形成后（术后 4 周），给治疗组动物经肌内注射mhANP和hBNP的表达重组体pLHY24 和pLT28 的裸露DNA（5mg/kg体重）一次，两周后可见心脏的缺血情况缓解，心重和心脏指数均显著降低（p＜ 0.01）。肌内注射mhANP和hBNP基因两周后对模型动物心重和心脏指数的影响分别见图21 和图22。
4.2 肌内注射mhANP和hBNP基因对模型动物心率的影响
对照组大鼠主动脉瓣受损 2 周后，心率有所加快，假手术组未见明显变化。大鼠主动脉瓣受损 4 周后，经肌内注射mhANP和hBNP的表达型重组体pLHY24 和pLT28 的裸露DNA（5mg/kg体重）一次，多数动物心电图的缺血性变化都有所改善。缺血动物心率有所加快，个别动物出现心律失常，假手术组心率变化不明显（图23）。
4.3 肌内注射mhANP和hBNP基因对动物心肌能量代谢的影响
心力衰竭动物心肌内的能量物质如ATP、Pcr含量降低，而能量代谢废物LA的含量则明显增加。表明心力衰竭的心脏在前负荷增加、自身代偿的同时，能量代谢也发生了的变化。肌内注射mhANP和hBNP的表达型重组体pLHY24 和pLT28 两周后，心脏的能量代谢状况获明显改善，能量储备增多，乳酸蓄积减少（图24、图25 和图26）。
4.4 肌内注射mhANP和hBNP基因对模型动物血压的影响
已有大量文献报到，心钠素和脑钠素多肽均有排钠、利尿和降压等多方面的作用，但心力衰竭动物肌内注射mhANP和hBNP基因后，其血压未见明显变化。心力衰竭动物治疗后的血压较术前略有降低，脉压增加（图27）。图27 中SAP示收缩压，DAP示舒张压。
4.5 肌内注射mhANP和hBNP基因对模型动物体重的影响
实验期间，动物体重正常增长，各组之间未见明显差异（图28）。
4.6 肌内注射mhANP和hBNP基因对模型动物心电图的影响
大鼠主动脉瓣受损 2 周后，心率有所加快，心电图可见缺血性变化。假手术组动物的心电图未见明显变化。在大鼠主动脉瓣受损 4 周后，经肌内注射mhANP和hBNP基因表达型重组体，治疗组多数动物的心电图缺血性变化都有所改善。图29 示出了给动物肌内注射mhANP基因后治疗组和非治疗组（注射等量生理盐水）动物心电图的变化情况。
1.mhANP真核细胞表达型重组体pLHY24 质粒DNA的制备
1.1 常规的碱裂解法大量制备质粒DNA
1.2 常规的PEG沉淀法纯化质粒DNA
2.脂质体介导的基因转移
采用脂质体介导的基因转移方法来将质粒pLHY24 转染进逆转录病毒包装细胞系PA317 细胞中。具体过程是：消化、收集并计数细胞，以能铺满ϕ35mm的六孔板皿底 30％～35％的密度接种PA317 细胞（约5×10 4 /皿），加 2ml完全培养基，于 37℃、5％ CO 2 条件下培养 24 小时左右，具体时间以细胞密度不超过60％～65％为宜以。在 12×75mm灭菌管中制备溶液A：2μg超螺旋质粒DNA＋100μl最适培养液（OPTIMEM Ⅰ Reduced Serum Medium），轻轻吹吸 7～8 次以充分混匀，溶液B：将 10μl Lipofectamine Regent试剂于 100μl最适培养液中充分混匀，室温下静置 15 分钟，将溶液A和B轻轻混匀，室温下静置 45 分钟以形成DNA-脂质体复合物，再加入 800μl最适培养液并混匀。在 45 分钟的期限到来之前用 2ml生理盐水洗涤培养皿中的细胞 1 次，弃尽洗涤液，立即加入溶液A和B的混合物（1ml/孔）。37℃、5％ CO 2 条件下培养 3～5 小时后，每孔添加 1ml含 30％小牛血清的D-MEM继续培养。转染进行 24 小时后换正常培养液。转染 48～72 小时后（具体时间视细胞密度而定，以其不超过 95％为宜），以能铺满培养瓶 30％～40％的密度传代，加正常培养基于 37℃、5％ CO 2 条件下培养。
3.PA317 细胞抗性克隆的筛选和扩增
3.1 G418 初始筛选浓度的确定
不同的细胞对G418 的敏感性有区别，应预先确定适当的初始筛选浓度。将PA317 细胞接种子六孔板中，待细胞长至 50％～60％，按一定的浓度梯度每孔加G418，3～4 天换液一次，观测 10 天左右。选择培养 3～4 天后细胞开始死亡、6～7 天后全部死亡的G418 浓度作为初始筛选浓度。
3.2 转染细胞G418 抗性克隆的筛选和扩增
待上述转染细胞完全展开后，换加含初始筛选浓度G418 的DMEM进行筛选培养，同时设定不转染的对照组，3 天换 1 次液。转染组约 10～14 天即可形成G418 抗性细胞克隆。扩增抗性细胞克隆。
4.G418 抗性细胞基因组DNA的提取
消化、收集培养的细胞，PBS洗 2 次，将细胞重悬于 0.5ml TE中（5×10 细胞/ml），加 5ml细胞裂解液（0.5％ SDS；0，1mol/L EDTA，pH8.0；10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；20μg/ml RNase），转移至 50ml锥形瓶中，轻轻混匀，37℃温育 1 小时。加蛋白酶K至终浓度为 100μg/ml，用一玻棒温和将酶混入黏滞溶液中。将裂解细胞的悬液置 50℃水浴 3 小时，并不时摇动该黏滞溶液。将溶液冷至室温，并移入离心管中，加等体积经 0.5mol/L Tris-Cl（pH8.0）平衡的酚，缓慢来回颠倒离心管 10 分钟，室温 5000rpm 15 分钟用大口径移液管或枪头移上清置另一离心管，再用酚重复抽提 2 次，用氯仿抽提 1 次。上清中加 2 倍体积 95％乙醇，1/10 体积 3M NaAc沉淀，稍加转动即见丝状基因组DNA出现，用Tip头将丝状DNA移至 1.5ml Eppendorf管中，用 70％乙醇洗 1 次，晾干后溶于 1ml TE（pH8.0）中，-20℃保存。
5.复制缺陷型病毒颗粒的收集及其滴度测定
待 24 孔板中的PA317 细胞长到 80％～100％时，换不含G418 的培养液，继续培养 24 小时，收集病毒上清，用 0.45μml滤膜过滤除去细胞及杂质，取出一部分，用放免法（RIA）测定目的基因表达产物mhANP 28 的表达水平，另一部分于-70℃保存，用于病毒滴度测定和/或感染细胞。
采用快速法测定复制缺陷型病毒颗粒的滴度。将 1×10 5 NIH 3 T 3 细胞接种于 6 孔板中，置 37℃、5％ CO 2 条件下培养，24 小时后，弃培养液，每孔加新鲜培养液 1ml及病毒上清 100μl，加polybrene至终浓度 8μg/ml，继续培养 24 小时后，按 1∶6 的比例传代，视细胞的生长情况于 24～48 小时后用含G418 的培养液进行筛选培养。10～14 天后形成抗G418 的细胞克隆。挑几个抗性细胞克隆进行扩增培养，分别冻存备用。
6.SHR大鼠新生鼠皮肤成纤维细胞的原代培养
将新生SHR乳鼠（出生后 24 小时内）整体浸泡于 70％的乙醇中，5 分钟后移入另一杯 70％乙醇中，再浸泡 5 分钟。剪取背部皮肤，将剪下的皮肤组织块置 70％乙醇中浸泡 10 分钟。尽可能去除脂肪组织，将皮片剪成 0.5cm 2 左右大小，用含青霉素、链霉素各 400u/ml和 400μg/ml的生理盐水漂洗 2 次，5 分钟/次。取出皮片并尽可能去除液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎。用弯头吸管将“泥状”组织点种于培养瓶壁，加少许D-MEM培养液（小牛血清 15％，青、链霉素各 100u和 100μg/ml），培养液的量以能将整个瓶壁湿润为限。将培养瓶倒置于 37℃、5％ CO 2 条件下 10～30 分钟，以便“泥状”组织能较牢固地贴附于瓶壁。轻缓地倒转培养瓶，以使点种的“泥状”组织与培养液接触。如果培养液的量不足，可用弯头滴管将培养液缓缓置于目标组织块的周围。置于 37℃培养。一般三天后组织块周围即可见梭形细胞长出。第三天换液一次。由于第一次所加培养液极少，故第一次换液时不用弃旧液，即仅为加液。少量旧培养液继续留于培养瓶中，可避免加新培养液后细胞的生长环境变化太大。待不同组织块周围的细胞连接成片时传代：弃旧培养液，生理盐水清洗长有细胞的瓶壁一次，加 0.025％ EDTA 0.5ml左右，转动培养瓶以便与细胞均匀接触，再加几滴 0.25％的胰酶，混匀后再转动培养瓶以消化细胞，待 1/2 左右的细胞变圆后，加适量培养液（15％小牛血清）终止消化，轻轻吹散细胞，视细胞多少而移于 1～几个新培养瓶中继续培养。
7.体外感染SHR新生鼠的皮肤成纤维细胞
将SHR新生鼠的皮肤成纤维细胞以 5×10 5 接种于 250ml培养瓶中，于 37℃、5％ CO 2 条件下培养，待铺满瓶底 70％左右时加入目的基因表达水平和病毒滴度均较高的病毒悬液，同时加入polybrene至终浓度 6μg/ml，继续培养 24 小时后，以 1∶5 传代于 250ml培养瓶中，视细胞的生长情况于 24 至 48 小时后加入G418 进行筛选培养。
8.mhANP高表达细胞系的筛选
用G418 筛选出Neo r 阳性细胞克隆，用PCR法检测基因mhANP在Neo r 阳性细胞克隆中的整合情况，用RIA测定基因mhANP表达产物的分泌水平，选出并扩大培养mhANP高表达的遗传工程细胞。
9.大鼠尾胶原的制备
-20℃冻存的大鼠（300～500g）尾 3 根，70％乙醇中浸泡 30 分钟，抽取尾腱（如不易抽出，可先剪成小段），尽可能剪碎，用 0.02M冰醋酸 400ml于 4℃浸泡 48 小时，4℃ 5000rpm离心 1.5 小时，移上清于另一管中，4℃，15000rpm离心 2 小时，吸集上清，加 0.1MNaOH（6∶1，V/V）中和冰醋酸后胶原蛋白即沉淀，室温 2000rpm离心 10 分钟，弃上清，用等体积新配制的 0.02M冰醋酸再溶解胶原蛋白沉淀，4℃保存备用。
10.胶原移植物的制各
首先将基因组中整合了外源基因mhANP并能高表达和分泌mhANP多肽的遗传工程细胞悬浮于培养液中（1.5×10 6 细胞/ml），然后按大鼠尾胶原（2mg/kg体重）∶5×D-MEM∶小牛血清∶细胞悬液＝3.0∶1.0∶0.5∶0.5的比例制备胶原移植物。
11.表达分泌mhANP 28 的遗传工程细胞对SHR大鼠的移植实验
让购回的 4 周龄（平均重 66g）SHR适应新环境 1 周，然后进行编号、称量和随机分组等工作。用腹腔注射戊巴比妥钠（40mg/kg体重）的方法麻醉动物，皮下注射胶原移植物。按 5ml/只SHR的量分四点注入SHR背部两侧的皮下。移植前后每周均定期进行体重称量、血压测定、尿样收集（测定尿量、尿中电解质浓度）和眼眶取血（测定其中电解质和ANP浓度）。
12.代谢笼法收集尿样
按 5ml生理盐水/100g体重的剂量灌胃，置代谢笼中（1 只/笼），禁食、禁水 6 小时并收集尿样。准确测定尿液体积，3000rpm离心 5 分钟，以去除颗粒性杂质，用于钾、钠等电解质浓度的测定。
13.采集血样
从眼眶取血，分成两份。一份不加抗凝剂，凝固后分离血清，用于血中钾、钠等电解质浓度的测定。另一份则预先加入 20μl的EDTA和 10μl抑肽酶，分离血浆，用于ANP浓度的测定。如不能及时测定，则低温冰冻保存。
14.测量血压
用鼠尾夹法测量血压。每只SHR每次精确测量三次，取其平均值。注：动物的预热时间应大于 15 分钟，以使其尾部血管充分膨胀。
15.治疗结果
15.1 mhANP基因转移对SHR大鼠血压的影响
在植入了胶原移植物后，虽然所有治疗组动物的血压与对照组的一样，会随动物年龄的增大在逐渐升高，但是，在移植后的 7 周内始终低于对照组。与非治疗组相比，从移植后的第 1 周开始，治疗组动物血压的增长速率就明显降低，显效期为 7 周。治疗组与非治疗组动物之间血压差最大者出现于第 2 周，达34mmHg（124.04 ± 22.41 和 158.83 ± 5.94，p ＜ 0.001）。结果见图30。
15.2 mhANP基因转移对SHR大鼠尿量的影响
从治疗开始后的第二周起，治疗组动物的尿量就明显大于非治疗组，显效期可维持 2 周。与非治疗组相比，治疗组动物治疗后的尿液增长量可达前者的 2.3（2.44/1.03）-3.2（2.44/0.83）倍。结果见图31。
15.3 对其他生理指标的影响
经检测，在移植后的整个实验过程中，除上文所述血压和尿量外，mhANP基因经间接体内法导入体内并表达的结果对SHR大鼠血液和尿液中的钾、钠等电解质浓度没有明显影响，其血浆ANP水平也无明显变化。
SEQ ID NO∶1（hANP的核苷酸序列）
ATG AGC TCC TTC TCC ACC ACT CAA GCT AGC TTC CTC CTT
TTA CTG GCA TTC CAG CTC CTA GGT CAG ACC AGA GCT AAT
CCC ATG TAC AAT GCC GTG TCC AAC GCA GAC CTG ATG GAT
TTC AAG AAT TTG CTG GAC CAT TTG GAA GAA AAG ATG CCT
TTA GAA GAT GAG GTC GTG CCC CCA CAA GTG CTC AGT GAG
CCG AAT GAA GAA GCG GGG GCT GCT CTC AGC CCC CTC CCT
GAG GTG CCT CCC TGG ACC GGG GAA GTC AGC CCA GCC CAG
AGA GAT GGA GGT GCC CTC GGG CGG GGC CCC TGG GAC TCC
TCT GAT CGA TCT GCC CTC CTA AAA AGC AAG CTG AGG GCG
CTG CTC ACT GCC CCT CGG AGC CTG CGG AGA TCC AGC TGC
TTC GGG GGC AGG ATG GAC AGG ATT GGA GCC CAG AGC GGA
CTG GGC TGT AAC AGC TTC CGG TAC TGA
SEQ ID NO∶2（hANP所编码的蛋白质的氨基酸序列，其中最后 28 个黑斜体字示hANP 28 的氨基酸序列）
Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Gln Ala Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala Phe
Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val Ser Asn
Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu Glu Lys Met
Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser Glu Pro Asn Glu
Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val Pro Pro Trp Thr Gly
Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala Leu Gly Arg Gly Pro Trp
Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu
Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp
Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
SEQ ID NO∶3（mhANP的核苷酸序列）
ATG AGC TCC TTC TCC ACC ACT CAA GCT AGC TTC CTC CTT
TTA CTG GCA TTC CAG CTC CTA GGT CAG ACC AGA GCT AAT
CCC ATG TAC AAT GCC GTG TCC AAC GCA GAC CTG ATG GAT
TTC AAG AAT TTG CTG GAC CAT TTG GAA GAA AAG ATG CCT
TTA GAA GAT GAG GTC GTG CCC CCA CAA GTG CTC AGT GAG
CCG AAT GAA GAA GCG GGG GCT GCT CTC AGC CCC CTC CCT
GAG GTG CCT CCC TGG ACC GGG GAA GTC AGC CCA GCC CAG
AGA GAT GGA GGT GCC CTC GGG CGG GGC CCC TGG GAC TCC
TCT GAT CGA TCT GCC CTC CTA AAA AGC AAG CTG AGG GCG
CTG CTC ACT GCC CCT CGG AGC CTG CGG AGA TCC AGC TGC
TCC GGG GGC AGG ATA GAC AGG ATT GGA GCC CAG AGC GGA
CTG GGC TGT AAC AGC TTC CGG TAC TGA
SEQ ID NO∶4（mhANP所编码的蛋白质的氨基酸序列，其中最后 28 个黑体三连字示mhANP 28 的氨基酸序列）
Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Gln Ala Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala Phe
Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val Ser Asn
Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu Glu Lys Met
Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser Glu Pro Asn Glu
Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val Pro Pro Trp Thr Gly
Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala Leu Gly Arg Gly Pro Trp
Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Set Lys Leu Arg Ala Leu Leu
Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Ser Gly Gly Arg Ile Asp
Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr
SEQ ID NO∶5（hBNP的核苷酸序列，其中大写字母示外显子，小写字母示内含子）
ATGGATCCCCAGACAGCACCTTCCCGGGCGCTCCTGCTCCTGCT
CTTCTTGCATCTGGCTTTCCTGGGAGGTCGTTCCCACCCGCTGG
GCAGCCCCGGTTCAGCCTCGGACTTGGAAACGTCCGGGTTACA
G
gtgagagcggagggcagctcagggggattggacagcagcaatgaaagggtcctcacctgctgtccca
agaggccctcatctttcctttggaattagtgataaaggaatcagaaaatggagagactgggtgccctgac
cctgtacccaaggcagtcggttcacttgggtgccatgaagggctggtgagccaggggtgggtccctga
ggcttggacgcccccattcattgcag
GAGCAGCGCAACCATTTGCAGGGCAAACTGTCGGAGCTGCAGG
TGGAGCAGACATCCCTGGAGCCCCTCCAGGAGAGCCCCCGTCC
CACAGGTGTCTGGAAGTCCCGGGAGGTAGCCACCGAGGGCATC
CGTGGGCACCGCAAAATGGTCCTCTACACCCTGCGGGCACCAC
GA AGCCCCAAGATGGTGCAAGGGTCTGGCTGCTTTGGGAG
GAAGATGGACCGGATCAGCTCCTCCAGTGGCCTGGGCTGC
AAAG
gtaagcaccccctgccaccccggccgccttcccccattccagtgtgtgacactgttagagtcactttggg
gtttgttgtctctgggaaccacactctttgagaaaaggtcacctggacatcgcttcctcttgttaacagcctt
cagggccaaggggtgcctttgtggaattagtaaatgtgggcttatttcattaccatgcccacaataccttct
ccccacctcctacttcttatcaaaggggcagaatctcctttgggggtctgtttatcatttggcagcccccca
gtggtgcagaaagagaaccaaacatttcctcctggtttcctctaaactgtctatagtctcaaaggcagaga
gcaggatcaccagagcaatgataatccccaatttacagatgaggaaactgaggctcagagagttgcatt
aagcctcaaacgtctgatgactaacagggtggtgggtggcacacgatgaggtaagctcagcccctgcct
ccatctcccaccctaaccatcatcaccctctctctttccctgacag
TGCTGAGGCGGCAT TAA
SEQ ID NO∶6（hBNP所编码的蛋白质的氨基酸序列，其中的黑体字示hBNP 32 的氨基酸序列）
Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu
His Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser
Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gin Glu Gln Arg Ash His Leu Gln
Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gin Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln
Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Tip Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu
Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg
Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp
Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His
图1
图2
图3
图4
图5
图6
图7
图8
图9
图10 体重变化（g）
图11 尿量/体重比（ml/kg）
图12 尿蛋白浓度（mg％）
图13 尿量/体重比（ml/kg）
图14 尿量/体重比增量（ml/kg）
图15 体重（g）
图16 尿量（ml）
图17 尿蛋白浓度（mg％）
图18 尿量/体重比（ml/g）
图19 尿蛋白浓度（mg％）
图20 尿量/体重比（ml/kg）
图21 心脏重量（g）
图22 心脏指数
图23 心率（次/分）
图24 ATP量的变化
图25 Pcr量的变化
图26 LA量的变化
图27 血压（mmHg）
图28 体重（g）
图29 心电图变化
图30 血压（mmHg）
图31 尿量变化（ml/6h）