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目前，至少已经有 17 种维生素K依赖蛋白（VKDPs）被报道 ［1］ ，包括凝血因子Ⅱ（凝血酶原）、凝血因子Ⅶ（前转变素稳定因子）、凝血因子Ⅸ（血浆凝血活酶）、凝血因子X（StuartPower 因子）、抗凝血蛋白C、抗凝血蛋白S、抗凝血蛋白Z、基质γ-羧基谷氨酸蛋白（MGP）、生长停滞特异蛋白 6（Gas6）、骨钙素（OC）、Gla富含蛋白（GRP）、骨膜素（亚型 1-4）、骨膜素样因子（PLF），富含脯氨酸Gla蛋白 1（PRGP1）、富含脯氨酸Gla蛋白2（PRGP2）、跨膜Gla蛋白 3（TMG3）和跨膜Gla蛋白 4（TMG4） ［2-5］ ，有的文献中还将γ-谷氨酸羧化酶（GGCX）列入其中 ［6］ 。2002 年，在人体内仅有 14 种维生素K依赖蛋白被确认 ［2］ 。维生素K是GGCX的辅酶，可以促进维生素K依赖蛋白中的谷氨酸残基（Glu）向γ谷氨酸残基（Gla）转化 ［7 ，8］ 。凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和X和抗凝血因子C、S和Z，这些维生素K依赖蛋白均依靠维生素K 1 在肝脏的活化 ［3］ 。骨钙素、MGP、Gas6 和GRP在肝脏外的组织依靠维生素K进行转录后的修饰 ［3］ 。然而，PRGP1、PRGP2、TMG3 和TMG4的功能仍然并不清楚 ［2］ 。环氧合酶和羧化酶都存在于微粒体中，环氧合酶表现出对氢醌形式的维生素K的催化作用，可以将其转化为 2，3-环氧化物的形式。环氧化物在环氧化物还原酶的作用下被转化为单醌形式的维生素K。最终，单醌形式的维生素K可能被还原为氢醌形式的维生素K。通过这样的方式，完成维生素K的循环。该循环产生的环氧化物形式的维生素K，由此“再生”了维生素K ［9］ 。
全球范围内，骨质疏松症是一个与高频的脆性骨折相关的疾病 ［10］ 。老年人以及绝经后的女性非常易于发生骨折。1990 年报道髋关节的骨折发病人数达到了 166 万人，由此粗略估计在 2050 年该病发病人数将达到 626 万人 ［11］ 。补充钙可能有助于增加骨骼密度，提升骨骼强度预防骨质疏松，然而，一些报道表明增加摄入的钙补充剂可能增加了心脏相关疾病的风险，这可能与加强了钙在血管壁和软组织的沉积有关 ［12 ~ 17］ 。另外，γ-羧基化的骨钙素可以避免钙在血管的沉积并且将钙绑定到骨基质。据报道OC的这种与骨骼矿物质化合物（羟基磷灰石）结合的能力可以部分的解释其影响骨骼矿化的能力 ［18］ 。
心血管疾病（CVD）在世界范围内是导致死亡的主导原因。据全球疾病负担（Global burden of disease，GBD）数据报道在 1990 年有 1259 万死亡病例（95% CI 1238 万~1280 万）是由于CVD导致的；在 2015 年，该死亡人数已经增加到 1792 万（95% CI 1759 万~1828万）。在 2015 年，CVD占所有死亡人数的比例约 1/3，并且预计还有 422 万CVD患者 ［19 ，20］ 。世界卫生组织预测在 2030 年还将会增加到 2330 万 ［21］ 。据报道，动脉钙化常常见于老年个体，在 > 70 岁的人群中，大于 96%的人被发现主动脉和冠状动脉存在钙化现象 ［22］ 。由于动脉钙化与动脉粥样硬化、心肌梗死和肾脏疾病的风险相关，因此密切关注动脉钙化具有重要的临床意义 ［23］ 。维生素K作为Gla蛋白羧基化的辅因子，促进了谷氨酸的修饰，修饰后的谷氨酸称为γ-羧基化的谷氨酸 ［24］ 。据报道维生素K 2 与抑制动脉硬化和钙化相关 ［25 ，26］ 。此外，较高剂量摄入维生素K可降低冠状动脉钙化水平，降低随后发生CVD的风险、冠心病相关死亡率、动脉和主动脉瓣钙化的发生风险 ［23 ，27 ，28］ 。维生素K 2 依赖性的MGP已被证明是一个潜在的血管钙化抑制剂 ［29］ 。
（1）OC的生成：OC由 49 个氨基酸残基构成，谷氨酸残基位于该蛋白氨基酸序列的第21、24 和 27 位。
它由成骨细胞、成牙质细胞和肥厚软骨细胞合成和分泌，人类骨钙素的基因位于 1 号染色体上，其中OC最早的蛋白形式是OC原蛋白。随后，其信号肽被移除 ［30］ ，在培养的人类成骨细胞中，1，25（OH） 2 羟维生素D 3 可以刺激维生素K 2 依赖的环氧化物水合酶（γ-谷氨酰羧化酶）对OC的生成 ［31］ 。由于γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）和维生素K的作用，其中维生素K充当着辅酶作用，未羧基化的骨钙素（uOC）被转化为羧基化的骨钙素（cOC）。
（2）OC与骨骼：OC的另一个名字是骨Gla蛋白。产生于成骨细胞的OC经历γ-羧基化过程，有 3 个γ-羧基化的谷氨酸残基位于成熟的OC上，每个残基拥有一个钙结合部位，因此，cOC能够结合钙离子并且将钙离子整合到形成骨基质的羟基磷灰石晶体中 ［32 ，33］ ，并且同时增加骨密度（图 3-1） ［34］ 。cOC还调控成骨细胞和破骨细胞的活动 ［35 ，36］ ，另外，据报道骨睾丸蛋白酪氨酸磷酸酶（Osteotesticular protein tyrosine phosphatase，OST-PTP）在OC羧基化程度中具有促进作用（图 3-1） ［37］ 。在此之前，一些研究证实血清未羧基化的骨钙素可能是骨关节炎（OA）的一个生物标志物 ［38］ 。cOC被大量的沉积到骨基质中，另外一小部分（约 20%）被分泌到血液循环中。
（3）OC和动脉粥样硬化：有研究发现，与未钙化的斑块相比，骨形态生成蛋白-6（BMP6）、OC和其他可以促进骨形成的蛋白因子在钙化的斑块中增加 ［39］ 。而在钙化的斑块事件中血管中炎性因子如白介素-8 和单核细胞趋化因子-1 减少 ［40 ，41］ 。
图 3-1 骨钙素在骨和心血管发挥调节功能的机制及其成熟过程（注：“-”表示抑制作用）
（4）甲基萘醌-7（MK-7），OC和骨质疏松症：在预防和治疗骨质疏松方面，日本推荐摄入的维生素K 2 形式是MK-7，剂量为 250~300μg/d ［40］ 。研究表明日常摄入MK7 > 100μg/d会促进OC的γ-羧基化 ［42］ 。在短期的摄入MK-7 后，OC的γ-羧基化即可降低uOC的浓度，而长期摄入可以维持OC的γ-羧基化状态并且促进骨骼新陈代谢，因此提高促进了骨骼健康。另外，人体药代动力学研究证实血液中MK-7 含量明显地高于维生素K 1 （7~8 倍高于维生素K 1 ） ［42 ，43］ 。相比于MK-4，MK7 由于其更长的异戊二烯链，故有更长的半衰期 ［44］ 。另外，该分子的化学-物理特性允许其通过血浆脂蛋白转运，增加其肝外的可利用性，并表现出最长的半衰期（3 天） ［45］ 。
（5）OC在人类和小鼠上的一些区别：实验室中经常用小鼠作为模型动物，然而，关于OC，人类和小鼠之间存在一些差异。第一，在人类仅仅有一个单OC基因，然而在小鼠已被确认有 3 个不同的OC基因。相比于人，在小鼠约有 60%的蛋白序列是保守的 ［46 ，47］ 。第二，在对 1，25（OH） 2 D 3 的应答反应中，人类OC基因的表达呈现出剂量依赖性的上调，然而小鼠OC基因却表现出被 1，25（OH） 2 D 3 下调的效果 ［48 ，49］ 。另外，在大多数物种中，在OC上 3 个维生素K依赖的γ-羧基化的谷氨酸残基均是被羧基化的，然而在人类，OC在骨骼和血清中是不完全羧基化的（undercarboxylated OC） ［46］ ，有研究认为，由于OC羧基化不足，人类骨骼和血液循环中的cOC浓度仅为其他物种的 20% ［50］ 。
成骨细胞、肥大软骨细胞和成骨样血管平滑肌细胞均可以产生骨钙素。转录激活因子 4（ATF4）在原骨钙素形成过程中发挥着调控作用。1，25（OH） 2 D 3 在人类和大鼠可以促进骨钙素的表达，在小鼠则会降低骨钙素的表达。之后，原骨钙素经历一个信号肽的去除过程并且转化为未羧基化的骨钙素（uOC）。由于γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）和维生素K为辅酶的催化活动，在uOC中位于第 21、24 和 27 位的Glu（谷氨酸残基）转化为Gla（γ-羧基化谷氨酸残基）。Glu有一个羧基末端（-CH 2 COOH），而Gla有两个羧基末端［-CH（COOH） 2 ］，由此成熟的骨钙素即cOC拥有了更强的吸引和绑定钙离子的能力。Esp基因的表达产物跨膜受体样骨睾丸蛋白酪氨酸磷酸酶（OST-PTP），可以维持cOC的羧基化状态，而瘦素则可以加强Esp基因的表达。在骨钙素成熟后的去路中，约 20%的骨钙素会进入血液循环，而大多数会在将钙绑定后沉积到骨基质；另外，羧基化的骨钙素会抑制破骨细胞的骨吸收活动。在一定情况下，例如破骨细胞的活动产生有机酸，该环境下cOC可以被脱羧基为不完全羧基化骨钙素（ucOC）和uOC，它们会进入血液循环。对于羧基化的骨钙素在进入血液循环后是否会对血管壁的钙化发挥作用，目前并不清楚。
（6）ATF4：转录激活因子 4；GGCX：γ-谷氨酰羧化酶；OST-PTP：跨膜受体样骨睾丸蛋白酪氨酸磷酸酶；Esp：OST-PTP蛋白表达的基因。
（1）MGP的来源和成熟：MGP分泌自软骨细胞，动脉内血管平滑肌细胞（VSMC） ［35］ 、成纤维细胞和血管内皮细胞。MGP在大量软组织中出现，包括动脉壁 ［51］ 、心脏、肺、肾脏和皮肤。据报道，在骨细胞中维生素D可能上调MGP的表达 ［52］ 。MGP的成熟过程包括两个修饰步骤，最初未磷酸化-未羧基化的MGP（dpucMGP）被转化为羧基化但是未磷酸化的MGP（dp-cMGP）。这个过程可以使 5 个谷氨酸残基被转化为γ-羧基化的谷氨酸残基，这时这些残基被称为Gla残基，它们具有靶向凋亡小体、钙离子和基质囊泡的结合位点。在蛋白质修饰的第二步，dp-cMGP被转化为磷酸化-羧基化的MGP（p-cMGP），这个过程涉及3 个丝氨酸残基 ［53 ，54］ 。然而，这些丝氨酸残基的功能目前并不清楚（图 3-2）。
图 3-2 MGP的保护血管功能机制及其成熟过程（注：“-”表示抑制作用）
（2）MGP与血管：根据流行病学的研究，异位钙化对CVDs的发生和发展有不利的影响 ［55］ 。通过体外实验证明，升高的无机磷酸盐（Pi）诱导了VSMC的钙化，其中无机磷酸盐（Pi）是经过钠-依赖的磷酸盐共转运体来摄入的，另外，VSMC向成骨细胞样的转化和凋亡小体的死亡同样也会造成这些钙化 ［56 ~ 62］ 。
VSMC的成骨样分化是被大量的成骨基因调控的，包括骨桥蛋白、runt相关转录因子 2和OC ［54 ，58］ 。VSMC还影响着基质囊泡的生成，对于钙在血管壁的沉积，基质囊泡可能提供合适的微环境 ［63］ 。外膜成纤维细胞和间充质干细胞（MSCs）也可能参与动脉钙化 ［64］ 。
关于钙在血管的结晶和沉积作用中，MGP充当着抑制剂的作用。羧基化的MGP通过结合钙晶体抑制异位矿化作用，从而抑制其生长，并且还通过结合和抑制BMP-2 发挥抑制作用 ［65 ~ 67］ 。另外，在动物实验中被观察到胎球蛋白-矿化复合物，这种复合物由MGP（2%）、胎球蛋白A（80%）、钙和磷离子（18%）组成（图 3-2）。胎球蛋白-矿化复合物可能有效地抑制矿物质生长，聚集和沉积。因此MGP也可能通过胎球蛋白-MGP-矿化复合物影响异位矿化 ［68］ 。维生素K 2 的缺乏会导致羧基化的MGP的减少，降低了其对血管钙化的抑制作用。因此，维生素K 2 的缺乏可能增加血管钙化的风险。
（3）MGP、维生素K和骨关节炎（OA）：OA是中老年人的常见病，是骨关节的退行性疾病。OA的症状常见如软骨组织和半月板的钙化，骨赘是其常见体征。骨赘也称骨质增生或骨刺，指在骨骼的边缘形成新的骨组织，该病严重影响老年人群的生活质量。目前，并没有很好的治疗措施来减缓OA的进展 ［69］ 。有研究表明，低水平的循环维生素K与手和膝骨关节炎有关 ［70 ，71］ 。
研究证实，亚临床条件下维生素K缺乏可能有助于促进增加膝关节骨关节炎和基于磁共振成像的软骨损伤风险 ［71］ 。事实上，来自正常和OA的软骨细胞均可以产生MGP；来源于骨关节炎的软骨细胞主要产生未羧基化的MGP，这种形式的MGP没有功能。同时，来自正常软骨的软骨细胞产生羧基化的MGP，上述MGP的不同功能形式表明OA可能与无功能的MGP有关 ［72］ 。由此，我们假设MGP羧基化的缺乏可能是导致OA的重要原因。
持续的低膳食摄入维生素K，导致维生素K的缺乏，可能导致维生素K依赖的MGP和Gas6 功能的抑制，随后通过骨赘和软骨的破坏作用调节OA的发病进程 ［73］ 。根据发布在2003 年的综述，3 个VKDPs在骨骼中被发现，即OC、MGP和蛋白S ［74］ 。此外，某些研究已经证明GRP和Gas6 也存在于骨和软骨中 ［71 ，75］ 。因此，在某种程度上，维生素K（特别是维生素K 2 ），可能在预防骨赘方面起到有益的作用，特定潜在机制和效果有待进一步的研究。
（4）不同类型的MGP：血液循环中的总体-未羧基化的MGP（t-ucMGP）浓度比dp ucMGP高出 1000 倍，其中t-ucMGP被提示主要由磷酸化的ucMGP（p-ucMGP）组成。dp-ucMGP没有钙结合基团因此不能被保留在血管内 ［51］ 。此外，多因素Logistic分析提示dp-ucMGP表现出是外周动脉钙化的独立预测因子，独立于年龄、性别、既往CVD史和t-ucMGP的水平，并且与外周动脉钙化呈现正相关 ［76］ ，高水平的dp-ucMGP还与不同阶段的慢性肾脏疾病（CKD）患者的主动脉钙化相关 ［76 ，77］ 。此前有报道称，高水平的dp ucMGP被认为与CVD风险的提高有关，特别是在外周动脉疾病和心力衰竭；在 2 型糖尿病患者，却并没有观察到变化的MGP种类和CVD风险变化的关联性 ［51 ，78］ 。
Dalmeijer ［79］ 证实低水平的维生素K可能与升高的CVD风险相关。事实上，血清中dp-ucMGP的浓度被作为血管平滑肌和血管钙化中维生素K浓度的标记物 ［80］ 。在之前的研究中，与较低位水平的患者比较，经历透析的患者中表达dp-ucMGP较高三分位水平的患者拥有明显更高的钙化分数 ［80］ 。此外，非磷酸化-羧基化的MGP水平的降低显示与CVD死亡率增加相关，且与透析患者的血管钙化相关 ［54］ 。Schurgers等 ［77］ 研究证实在 107 例CKD患者（包括 40 例血液透析患者）发现dp-ucMGP水平与钙化积分呈正相关。另外，dp ucMGP还与CKD患者主动脉钙化的严重程度相关 ［79 ，80］ 。此外，在肾功能表现正常或有轻度改变的 2 型糖尿病患者，高dp-ucMGP水平被提示与膝下动脉钙化分数独立相关，因此提示估计的肾小球滤过率仍然是MGP水平的一个强预测因子 ［51］ 。
dp-ucMGP可以由骨骼和心血管系统产生；在心血管是血管内皮细胞，血管平滑肌细胞和巨噬细胞，在骨则是软骨细胞和破骨细胞。在MGP形成过程中，第一步，激活素样受体激酶 1（ALK1）可以上调dp-ucMGP的产生，之后dp-ucMGP将要完成羧基化修饰，由于GGCX和辅酶维生素K的催化作用，5 个Glu转变为Gla；第二步，位于dp-cMGP第 3、6、9 位的丝氨酸残基将要经历磷酸化过程，进一步得到具有功能的p-cMGP。
MGP通过以下途径来保护血管：①在病理条件下（例如长期维生素拮抗剂的摄入，如华法林），位于血管壁中层的VSMC会产生凋亡小体，凋亡小体可能成为钙化的病灶。成熟的MGP可以形成胎球蛋白-A矿化复合物（80%胎球蛋白-A、2%Gla、18%磷离子）来抑制矿化物晶体的生长，由此，它减少钙化灶的数量和抑制其对血管钙化的促进作用；②在病理条件下，血管平滑肌细胞产生的基质囊泡可能会成为血管壁的钙化中心，而成熟的MGP可以消除基质囊泡；③ MGP激活吞噬细胞对凋亡小体的吞噬作用，从而避免异位钙化。病理条件刺激下的VSMC分化为成骨样细胞并且可以产生骨桥蛋白、核心结合因子α1、碱性磷酸酶、骨钙素和BMP-2；④成熟的MGP可以结合在血管的游离的钙磷离子进而阻止这些离子在血管壁的沉积；⑤在软骨细胞BMP-2 会拮抗GRP的形成，并且促进VSMC的成骨样分化，然而，成熟的MGP抑制BMP-2 的产生；⑥对于MGP是否与骨钙素会出现拮抗作用以及骨钙素对血管壁的作用目前仍然不清楚。
注：Glu：谷氨酸残基；Gla：γ谷氨酸残基；dp-ucMGP：未磷酸化-未羧基化的MGP；dp-cMGP：羧基化但是未磷酸化的MGP；p-cMGP：羧基化且磷酸化的MGP；GGCX：γ-谷氨酰羧化酶；BMP-2：骨形态发生蛋白-2；GRP：Gla富含蛋白；VSMCs：血管平滑肌细胞。
GRP是最近鉴定的VKDP家族的成员，它名字的由来是因包含大量的Gla残基 ［69］ ，部分文献中又称其为独特的软骨基质相关蛋白（unique cartilage matrix-associated protein） ［81］ 。GRP第一次被鉴定是在鲟鱼钙化软骨（亚德里亚海鲟鱼钙化的软骨的GRP有 16 个Gla残基），在人体内的GRP被推测有 15 个Gla残基 ［69 ，82 ~ 85］ ，其主要分布在骨骼，软骨，皮肤血管系统，在这些位置GRP在抑制血管钙化方面发挥着重要作用 ［82 ~ 84 ，86］ 。
（1）GRP与骨骼：GRP的功能被认为是成骨分化的一个负性调控因子 ［84］ 。GRPF5 小鼠被敲除了 2 号外显子，GRP-F6 小鼠被敲除了外显子 3，因此，GRP-F5 小鼠表现出完全的失去了γ-羧基化的功能，而GRP-F6 小鼠表现出部分的失去了分泌功能 ［87］ 。GRP缺陷小鼠被证明在骨骼结构的生长和钙化中没有明显的表型改变 ［87］ ，GRP可能减慢成骨细胞的分化和成熟并且降低碱性磷酸酶的活性和成骨基因的表达，另外，GRP与OA中炎症和关节组织钙化之间的串扰有关 ［88］ 。骨形态发生蛋白-2（BMP-2）是一个与骨相关的蛋白，据报道能够拮抗软骨细胞中GRP的表达 ［89］ 。一些研究数据表明，GRP可能被Runt相关转录因子 2和转录因子Osterix上调，随后诱导成骨细胞的分化和结节的形成 ［90］ 。此外，先前发表的文章表明，在对照组和OA衍生的细胞中的钙化和炎症情况中，GRP表现出类似的作用 ［88］ 。因此，GRP可能具有作为治疗OA潜在靶点的作用，其效果可能表现在对钙化和炎症的过程中。比较数据表明，羧基化不足的GRP在软骨异位钙化点和OA的滑膜位置被共定位 ［87］ 。因此，维生素K不足与膝盖骨关节炎相关 ［70 ，71 ，73］ 。另外，Rafael等 ［87］ 研究证实OA与GRP和MGP的羧基化缺乏之间的关联是一致的。
（2）GRP和羧基化系统：GRP被报道在心血管系统中的功能是作为钙化抑制剂 ［86］ 。根据GRP和BMP-2 之间的关系，GRP可能在VSMC向成骨样细胞分化和血管钙化的过程发挥调节作用。GRP与许多疾病的矿化过程联系在一起，其中涉及异位钙化 ［82 ，84 ，86 ，87 ，91］ 。与MGP相同，在血管和关节组织GRP作为一个钙化的抑制剂。目前，对于GRP发挥其矿化抑制剂作用，GRP的γ-羧基化修饰被认为是必需的。GRP被报道涉及VSMC衍生的细胞外囊泡矿化能力 ［45 ，90］ ，并且，在胎球蛋白-A-MGP钙化抑制剂系统中可能潜在的涉及到GRP（图 3-3）。
图 3-3 GRP的作用机制（注：“-”是指抑制作用）
GRP：Gla富含蛋白；GGCX：γ-谷氨酸羧化酶；BMP-2：骨形态发生蛋白-2；MGP：基质Gla蛋白
GRP在γ-羧基化后发挥其独特的功能。这个过程依赖于两个重要的酶：GGCX酶和作为辅酶的维生素K。主要分布于骨、软骨、皮肤和血管系统。GRP可抑制成骨细胞分化成熟，碱性磷酸酶活性及成骨基因表达。GRP作为成骨分化的负调节因子通过上述 3 条途径发挥作用。BMP-2 是一种与骨相关的蛋白，能拮抗软骨细胞中GRP的表达。GRP与MGP相似，在血管和关节组织中起钙化抑制剂的作用。GRP还可能涉及胎球蛋白A-MGP钙化抑制系统和基质小泡的形成。因此，GRP可抑制异位钙化。
（1）骨膜素的来源和分布：骨膜素的分子量约 90kD，是最近发现的VKDP，它包含150 个氨基酸长的重复结构域，并且在进化上显示是保守的 ［92］ 。骨膜素，也被称为成骨细胞特异性因子 2，是一种细胞外基质（ECM）蛋白并且也是Fascilin-1 蛋白家族的成员 ［93］ 。在骨骼中骨膜素第一次被鉴定，并且位于皮质骨膜（骨膜细胞）和牙周膜中。骨膜素和PLF都存在于高级脊椎动物中 ［94-97］ ，在胚胎发育期骨膜素影响心脏发育和重塑 ［98 ，99］ 。然而，在心室肥厚和纤维化期间，观察到骨膜蛋白表达增加 ［100］ 。骨膜素是ECM分泌的一种脂溶性分泌蛋白；骨膜素有 4 个重复的筋膜蛋白结构域，可以与其他ECM蛋白相互作用显示多种功能 ［101 ，102］ 。
骨膜素最初产生和分泌自成骨细胞及其前体细胞，然而，成纤维细胞也可以分泌，并且表达于成年哺乳动物骨骼和心脏瓣膜。骨膜素在肺和肾脏有较低程度的表达 ［102］ 。骨膜素是一个黏附分子通过与细胞表面受体结合，促进成骨细胞分化、聚集、黏附和的增殖。它还参与胶原蛋白的折叠，而折叠对基质组装至关重要，基质组装负责其与骨强度的关联 ［103］ 。骨膜素也已被证明对心脏的发育具有重要作用 ［104］ ，在心室中表达的骨膜素可能在动脉粥样硬化中发挥重要作用 ［105］ ，另外还包括心内膜垫的形成和心脏瓣膜的形成（图 3-4） ［98 ，106］ 。
（2）骨膜素与骨骼：骨膜素表达水平的增加可能作为一个骨组织持续承受高压的标记。PLF的水平可能被作为一个早期的适应性骨重塑的预测指标，在职业性肌肉骨骼疾病的早期诊断和治疗中起着重要作用。在成年人的骨骼中，PLF被报道在骨折愈合的条件下被上调 ［107］ ，骨膜素和PLF均在机械过载或肌肉骨骼系统的损伤和修复的条件下被表达 ［108］ 。另外，骨膜素显著增高了MC3T3-E1 细胞黏附于Ⅰ型胶原或纤维连接蛋白覆盖的表面的能力，这些表面是MC3T3-E1 细胞黏附的既定刺激物 ［109 ，110］ 。
（3）骨膜素和心脏：经历了心脏主动脉瓣膜狭窄手术的小鼠和心衰的患者 ［111 ，112］ 骨膜素的表达水平较高。据报道骨膜素在心脏的过表达导致了心功能障碍和增加纤维化的风险 ［99］ ，然而，骨膜素敲除的小鼠表现出在随后长期心脏应激超负荷的情况下纤维化减少的结果 ［112］ ，因此骨膜素可能在心脏纤维化中发挥着重要作用，并且在心压超负荷后心力衰竭的心功能重建中发挥作用。另外骨膜素可能在大鼠和小鼠中有不同的效果。结缔组织中的骨膜素与机械压力之间可能存在一定关联性，例如，骨膜素被证实在肾损害患者中的心脏瓣膜和肾小球中表达 ［113］ ，并且在心脏组织损伤后也表现出高度的上调 ［103］ 。骨膜素也是一个血管损伤后的转录产物之一，Lindner等 ［114］ 研究证实骨膜素的mRNA在大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞、内膜和中膜均有表达。骨膜素和PLF均是维生素K依赖的γ-羧基化蛋白，并且都表达于CVD ［114］ 。
图 3-4 骨膜素的作用机制
GGCX：γ-谷氨酸羧化酶；Pn：Periostin，骨膜素
（4）心脏中骨膜素的不同亚型：骨膜素有 4 种亚型（图 3-4），分别被命名为Pn1、Pn2、Pn3 和Pn-4，它们通过外显子 17 和 21 存在或缺乏来区分 ［4］ 。Pn1 是全长形式，Pn-2 缺失外显子 17，Pn3 缺失外显子 21，Pn4 缺失外显子 17 和 21 ［4］ ，骨膜素的这些亚型在心肌梗死的大鼠心脏中高表达 ［4， 115］ 。Taniyama等 ［4］ 研究指出骨膜素的 4 种亚型的表达水平在心肌梗死后 5~7 天达到峰值。另外，原位杂交结果显示，在心肌梗死边缘区域 5 天内，骨膜素表达升高，并逐渐向未缺血区扩散。
此外，Pn1 对心肌成纤维细胞和心肌细胞的黏附有抑制作用，而Pn-2 表现出相反的效果 ［4， 106］ ，Pn-2 显著增加血管的形成，但Pn-1 没有观察到类似的效果。Pn-1 促进心肌梗死后的心肌纤维化和重塑，然而Pn-2/4 预防梗死区心脏破裂。根据体外实验，Pn-2 和Pn-1 对细胞黏附和血管生成具有相反的作用，这可能导致心脏重塑中的相反作用 ［4， 106］ 。
（5）骨膜素的作用机制：骨膜素由成骨细胞、成纤维细胞和成年哺乳动物的心脏瓣膜产生，在GGCX酶和维生素K作为辅酶介导下，骨膜素通过γ-羧基化作用发挥其独特的功能。骨膜素有 4 种不同的亚型，分别称为Pn-1、Pn-2、Pn-3 和Pn-4。Pn-1 对心肌成纤维细胞与心肌细胞的黏附有抑制作用，而Pn-2 则相反。此外，Pn-2 能显著促进血管形成，而Pn-1 则无此作用。Pn-1 也被报道促进心肌梗死后的心脏重构。骨膜素可增加心肌肥厚，心肌纤维化和心脏功能障碍。此外，在胚胎阶段，骨膜素可能影响心脏发育和胚胎期心脏重塑。
（1）Gas6 的产生：Gas6 和血浆抗凝蛋白S的同源性为 44%，其氨基酸序列末端含有11~12 个Gla残基 ［116］ 。Gas6 包括 3 个部分，即氨基末端、一个包含重复氨基酸序列的区域和羧基末端。Gas6 最初从静止期的成骨细胞分离出来 ［117］ ，据报道其也可以从成骨细胞中分泌出来 ［118］ 。当维生素K存在的时候，GGCX修饰位于谷氨酸富集区域的谷氨酸残基并将其转化为γ-Glu残基。Gas6 通过抑制VSMC凋亡抑制血管钙化（图 3-5） ［99］ 。此外，Gas6 可由血小板和血管壁产生，并影响血栓形成和细胞形成 ［93］ 。
图 3-5 Gas6 的作用机制（注：“-”指的是抑制作用）
Gas6：生长停滞特异性蛋白 6；GGCX：γ-谷氨酸羧化酶
（2）Gas6 和心脏：Gas6 在心、肺、肠、肾、脑、脾、卵巢、睾丸、骨髓、血管平滑肌细胞和巨噬细胞中高表达；在肝脏中的表达水平较低 ［109 ，110］ ，在病理条件下，VSMC分化为具有分泌功能的成骨样细胞，成骨样细胞可合成和分泌成骨相关蛋白。Gas6 已被证实参与血管重塑、稳态和动脉粥样硬化。另外凋亡小体与血管钙化之间存在着一定的相关性。Gas6 还被报道保护内皮细胞和VSMCs免受凋亡 ［119 ，120］ 。Gas6 被证实在人类扩张型心肌病、心肌肥厚的小鼠和血管紧张素Ⅱ治疗的小鼠心脏中表达上调 ［121］ 。Gas6 通过激活有丝分裂原激活的蛋白激酶 1/2-细胞外信号调节激酶 1/2 信号通路损害心室对慢性压力超负荷的适应 ［121］ 。值得注意的是，Gas6 的缺失被报道可以减弱脱氧皮质酮诱导的心肌肥厚和纤维化 ［122］ 。
（3）Gas6 的作用机制：Gas6 由静止的成纤维细胞，成骨细胞，血管平滑肌细胞和巨噬细胞产生。GGCX以维生素K为辅酶，有助于Gas6 羧化的完成。随后，Gas6 对内皮细胞和VSMCs的凋亡发挥抑制作用，从而预防血管狭窄，保护血管。存在 3 种情况Gas6 可能在心脏中上调，包括人类扩张型心肌病、小鼠心肌肥厚和血管紧张素Ⅱ治疗的心脏。
6.小结 VKDPs在维生素K的作用下完成γ-羧基化，维生素K作为其中的辅因子 ［24］ 。羧基化的VKDPs表现出在骨骼和心血管系统中的保护作用，并促进钙的正确沉积。MGP抑制钙在血管内壁沉积甚至可能在一定程度上逆转钙的异常沉积，促使钙进入骨骼。另外，羧基化的OC可能吸引并结合钙离子并将钙离子转移到骨基质，因此对血管和骨骼的健康有利 ［18 ，25 ~ 29］ 。这些机制现已明确，同时其他的VKDPs也可能被涉及。据报道VKDPs，特别是维生素K 2 ，表现出在骨骼和心血管系统中的保护作用。且迄今为止，还没有关于维生素K严重副作用的报道 ［123 ，124］ 。
目前已经确认共有 17 种VKDPs，然而一些研究也指出，可能有 19 种 ［125 ，126］ 。骨膜素有 4 种亚型，PLF也是骨膜素的亚型 ［124］ ，如果这些骨膜素亚型中的每一个都被认为是VKDPs，这样将使VKDPs的数目将正好是 19 种。一般来说，凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、X，还有抗凝蛋白C、S、Z都被认为是VKDPs ［3］ 。这些蛋白涉及凝血平衡，由于在不同的组织表达多种VKDPs，它们各自发挥一定的功能，例如凝血与抗凝血的拮抗作用进而在人体内维持稳态。当异位钙化发生时，VSMC分化为成骨样细胞 ［62］ ，其产生骨钙素，在动脉粥样硬化血管壁骨钙素的表达则表现出增加 ［55 ，127 ，128］ 。据报道MGP可以保护血管壁并且阻止异位钙化，其中羧基化的OC在正常情况下促进钙沉积进入骨骼 ［18 ，129 ，130］ 。目前，关于OC和MGP是否会在此表现出拮抗作用或其他相互作用仍有待进一步确定。根据每个VKDP的特点，GRP、Gas6 和MGP在抑制心血管的钙化中似乎有协同效应。在雄性小鼠中增加表达的骨膜素与骨强度的增加相关 ［131 ，132］ ，由此，骨膜素可能与OC具有协同作用。由此，暂且将这些VKDPs粗略分为两组，第一组：MGP、GRP和Gas6；第二组：OC和骨膜素。在一定的钙化条件下可能会被观察到两组间的拮抗作用。在骨膜素中，由于其本身含有 4 种特性不同的亚型 ［4］ ，骨膜素的 4 种亚型之间可能表现出拮抗平衡。由于两组蛋白质均是VKDPs，我们推测当摄入充足的维生素K 2 后，可以维持这个平衡，当摄入不足时可能会导致一些疾病如血管钙化，相信该问题在今后的研究中将会逐步被解决，最终实现对患者的最佳治疗。
我们提出假设骨骼和心血管系统之间存在一些联系。在人类胚胎发育过程中，心血管系统分化发育自中胚层间质，而骨骼系统发育自腹侧中胚层其可能来自于原位间充质，不包括生骨节 ［133 ~ 135］ 。因此，心血管系统和骨骼系统的来源有相似之处，此外，骨髓间充质干细胞（MSCs）已经被应用于临床前研究和临床应用中 ［136 ，137］ ，包括肌肉骨骼组织的生物工程和心脏疾病的治疗 ［138 ~ 141］ 。先前的研究揭示了内皮细胞可以作为骨形成细胞形成新骨组织的模板，这提示“血管结构”可能诱导骨形成 ［142］ 。基于这些认识，在胚胎发育时期心血管系统和骨骼系统可能起源于胚胎发育时期的中胚层。间充质可能在这一过程中起重要作用，骨骼和心血管系统可能密切相关。
因此，本文提出了以下的假设，心血管系统和骨骼系统是生物机体的不同结构，各自承担着不同的生理功能。然而，它们在胚胎发育时期源于相似的区域，当机体成熟后它们已分化成为不同的组织或器官但仍保留一些相似的特征，这种特征在其经历某些短期或持续的刺激时将会表现出来。例如，缺少维生素K导致的羧基化的MGP的缺乏，将会造成之后的异位钙化，进一步的血管的钙化不是一个被动的钙和磷沉积过程。观察到血管中的VSMC分化为成骨样细胞，且与骨骼形成的基质具有一定程度的相似性 ［62］ ；在骨骼系统会出现骨质疏松和OA等症状，其关键特征包括关节软骨的损失，骨赘形成和其他退行性疾病 ［38 ，71］ 。当其受到压力刺激时，持续性室性高压可造成心力衰竭和心肌梗死，关节或足跟部的高压引起骨赘。另外，蛋白的分泌，例如骨膜素存在于骨膜中，也出现在心血管系统 ［99 ，104］ 。
我们还提出了如下猜想，在胚胎发育时期，如果不同组织器官的发育位置密切相关且有共同来源，则这些组织器官在相同性质的持续刺激下可能保持相似的发育趋势或分泌能力，例如压力刺激和骨膜素。然而，一般情况下当没有共同的特异性刺激时则没有这种类似的反应。总之，第一，不同的维生素K依赖蛋白之间可能存在一定的协同和拮抗作用，从而维持体内稳态。第二，骨和心血管系统在胚胎发育时期位置关系密切，这可能是血管平滑肌细胞可以分化为成骨样细胞，并分泌BMP-2 和其他成骨蛋白，以及心脏在负荷下产生骨膜素的重要原因。这些是作者根据文献做出的一些总结和推测，还需要进一步的科学探究来完善我们对维生素K依赖蛋白在骨骼和心血管方面的认识。
目前为止，已进行了许多研究来探讨VKDPs对恶性肿瘤的作用及机制，其中涉及的VKDPs如OC、MGP、GRP和Gas6 等。目前对各个不同蛋白的研究程度也不同，如Gas6/TAM相关通路在多种恶性肿瘤发生机制上有更多的研究进展，所以本文对此做了更多的介绍，包括Gas6 在其中产生作用的一些结构介绍。VKDPs对不同类型的癌症具有促进或抑制作用，各个蛋白的不同作用及彼此之间的相互作用仍是目前研究中值得关注的领域。
1.骨钙素（OC）前列腺癌是世界上许多地区最常见的男性恶性肿瘤。在美国等一些发达国家，前列腺癌是男性最常见的非皮肤癌症 ［143 ，144］ ，其发病率在亚洲国家也有上升趋势，这种趋势非常突出，尤其是在亚洲东北部地区，包括中国、韩国和日本 ［145］ 。前列腺癌的病因在很大程度上仍然不确定，年龄、种族和家族历史是唯一确定的危险因素 ［146］ 。雄激素剥夺疗法（ADT）是转移性和局部晚期前列腺癌的标准治疗方法。在其他相关研究中，一个值得注意的发现是在ADT治疗后血清ucOC水平显著升高，在ADT治疗后 3 个月就已经表现明显。ucOC增加表明维生素K的不足和/或骨形成减少 ［147］ 。有趣的是，另一个骨形成标志物Ⅰ型前胶原前肽（P1NP），其来源于成骨细胞，ADT后未表现出类似的变化，由此提示维生素K不足更可能是ADT的背景 ［148］ 。
对经证实有骨转移的前列腺癌OC水平的研究未能证明OC水平与骨转移的之间有任何相关性 ［149 ，150］ 。此外，与无骨转移的甲状腺癌患者相比，有骨骼转移的患者OC水平出现升高 ［151］ 。对于那些不确定的结果（OC水平），其可能原因是肿瘤引起的骨病变性质不同，即可能是溶解性的，也可能是再结晶性的，或者两者兼有 ［152］ ；因此需要进一步研究阐明OC作为骨肿瘤标志物的潜在作用。在德国的一项研究中，维生素K 2 （Menaquinones，MKs；vitamin K 2 ）的摄入量和血清未羧化骨钙素（unOC）与完整的总骨钙素的比率与晚期前列腺癌的风险显著降低相关 ［153］ 。然而，相反的实验结果也依然存在，如有研究指出膳食摄入叶绿醌，Mks和总维生素K并没有与晚期总的前列腺癌的风险显著相关 ［154］ 。目前关于OC在前列腺癌方向的研究结果仍存在争议，其中OC的不同羧基化形式是否与前列腺癌风险显著相关还需要进一步的研究。
OC被认为是骨骼中维生素K状态的标志物，在骨转换增加的受试者中，如儿童和绝经女性，已经证明ucOC水平升高 ［155］ 。由于OC与骨代谢活动存在相关性，OC与骨癌的关系已被研究，然而结果一直没有定论。在肺癌患者中，OC水平的降低和升高均有报道 ［156 ，157］ ，然而没有对其是否羧基化进一步讨论。
2.MGP 研究表明，MGP在地中海贫血（β-珠蛋白生成障碍性贫血） ［158］ 、动脉粥样硬化和慢性肾病中异常表达 ［159 ，160］ 。除了与异常钙化相关的病理学，还发现在不同类型的恶性肿瘤中，包括乳腺癌 ［161］ 、结肠癌 ［162］ 和恶性胶质瘤 ［163 ，164］ 异常的MGP表达，但是其功能和意义仍有待阐明。MGP的表达与几种癌症类型的进展相关，例如原发性肾细胞癌、前列腺癌、睾丸生殖细胞肿瘤、卵巢癌、胃癌和乳腺癌 ［165 ，166］ 。
转录因子（Transcription factor）RUNX2 是MGP转录的调节因子 ［169 ，170］ 。RUNX2 被证明与结直肠癌更高的风险相关（2011 年），同时RUNX2 被认为是结直肠癌可能的预后因素（2012 年） ［171 ，172］ 。RUNX2 是非洲爪蟾MGP转录已知的调节因子（2010 年） ［169］ ，在啮齿类动物中RUNX2 还通过PKA和ERK/MAPK信号通路通过甲状旁腺激素调节MGP表达，据报道RUNX2 也是乳腺癌转移中的MGP调节因子（2009 年） ［173］ 。有研究指出MGP和RUNX2 的高表达水平与大肠癌的最差预后相关，特别是当与一组已确定的预测因素一起分析时，并且是区分大肠癌患者生存结果更好或更差的重要预测因素。另外，不同患者群体的这些基因表达差异，可能是因为不同患者之间存在遗传变异，这可能解释了MGP和RUNX2 在肿瘤黏膜中的不同表达模式 ［174］ 。
在乳腺癌和胶质母细胞瘤中，MGP上调与不良预后之间相关（2009 年），据报道在乳腺癌患者中 ［175 ，176］ ，MGP可以作为预后不良的生物标志物。结果显示，与正常组织相比，MGP mRNA在预后不良肿瘤患者中的表达上调，MGP mRNA可作为疾病的预后检测指标，然而在蛋白质水平和总生存率之间还没有确立相关性。最近的研究表明，microRNA介导的MGP表达抑制可诱导乳腺癌MCF-7 细胞增殖 ［177］ 。与MGP在肿瘤细胞增殖中的作用一样，MGP在外周肿瘤细胞迁移和侵袭中的作用也存在争议。在早期文献报道中，在肾细胞癌中，MGP表达与肿瘤大小、淋巴结转移和肿瘤分级呈负相关 ［178］ ；近期报道中，在乳腺癌肿瘤细胞系MCF-7 中MGP表达的沉默可增加MCF-7 细胞侵袭性 ［178］ 。然而在小鼠模型中，实验结果表明MGP在体外改变内皮黏附和跨内皮迁移，以及促进骨肉瘤体内转移至肺 ［179］ 。
在对人多形性胶质母细胞瘤（GBM）标本中MGP表达的观察已经明确表明，MGP表达与GBM分级呈正相关 ［180 ，181］ 。虽然短暂抑制人脑胶质瘤细胞系（U373fast，H4 和U343MG）中MGP的表达可以减少这些细胞的迁移和侵袭 ［181］ ，但MGP表达的稳定下降是否可以延长下降胶质瘤细胞行为尚不清楚。研究证实MGP在胶质母细胞瘤中的过度表达，并提示该蛋白的上调可能由于侵袭性增加而导致不良预后 ［181］ 。MGP被认为可能是多形性胶质母细胞瘤的治疗靶点（2010 年），这是脑肿瘤中血管最丰富的一种。抑制MGP导致肿瘤体积更小，血管化减少，表明MGP在血管生成中的作用 ［182］ 。通过比较WHO Ⅱ级胶质瘤和复发性高级别（WHO Ⅲ或Ⅳ级）胶质瘤之间的转录谱，提示MGP表达水平升高与肿瘤进展呈正相关 ［180］ 。
近期研究表明（2018 年），MGP在大鼠胶质瘤细胞中的表达有助于肿瘤细胞迁移能力的正向控制 ［181］ 。结合更高级胶质瘤中MGP表达增加的临床相关性，提示在高度增殖的大鼠胶质瘤细胞模型中MGP的上调可以促进胶质瘤细胞在体外和体内的迁移；这一发现揭示了GBM标本中MGP高表达/增殖性高的胶质瘤亚群特征的重要性，因此MGP可以作为抗胶质瘤浸润的一个新的治疗靶点，以获得更有效的肿瘤根除效果 ［181］ 。MGP表达的升高参与了抑制因子 4（ID4）介导的胶质瘤细胞增殖和ID4 诱导的血管生成 ［182］ 。在多形性胶质母细胞瘤（GBM）来源的肿瘤中高表达分化ID4 的细胞，在MGP减少的实验组中血管化的肿瘤较少且形成肿瘤体积也比较小，提示ID介导的MGP表达增加和促进肿瘤血管生成 ［181］ 。尽管MGP信使RNA（mRNA）表达瞬时干扰可以引起人脑胶质瘤细胞系的细胞迁移减少 ［175］ ，但需要进一步的证据来支持MGP介导的对恶性胶质瘤细胞迁移能力的调节作用。
MGP还被发现在其他类型的肿瘤中过表达，包括如泌尿生殖（1992 年） ［183］ 、卵巢（2001 年） ［184］ ，皮肤（2007 年） ［185］ 和胃（2010 年） ［186］ 。在结直肠癌中，MGP基因表达的功能仍然不明确。2016 年开展的一项研究显示，与正常组织相比，在肿瘤组织中观察到MGP基因表达的显著上调 ［187］ ；而先前的一项研究显示了相反的情况，发现与其做参照的正常组织样品相比，在结直肠肿瘤组织中MGP mRNA的水平下调 ［162］ 。MGP在许多不同癌症类型中都会表达，但是没有建立其明确的作用 ［188］ 。在此之前，在人类结直肠腺癌 ［162］ 和MCF-7 乳腺癌细胞系 ［189］ 中显示MGP mRNA出现下调。其作用机制可能是MGP干扰骨形态发生蛋白 2（BMP-2）介导的Smad1 的激活，以及降低参与细胞黏附和迁移的细胞外基质蛋白玻璃体连接蛋白的抑制作用。反之，其他研究报道在一些癌症类型中MGP mRNA表达增加，其中MGP被认为通过结合玻璃体连接蛋白、纤维连接蛋白促进细胞侵袭和增殖，并诱导血管内皮生长因子（VEGF）表达 ［175 ，182］ 。然而，这些研究没有探究MGP羧基化的程度在其中的影响。另外有些肿瘤或许会分泌非羧基化的MGP进入其周围，从而发挥类似于非羧基化的凝血酶原的功能，即作为肝癌细胞的有丝分裂原的促瘤作用；对此还需进一步的研究。
3.GRP GRP和异位钙化之间存在一定关联性，特别是与乳腺癌肿瘤的诊断相关；研究结果提示，GRP可能作为一个维生素K抗癌潜力的新靶标 ［190］ 。癌症中新的VK靶点的发现，如GRP，可能解开了维生素K在各种类型的癌症发展中功能作用的潜在机制。已知微钙化在乳腺癌早期诊断中发挥着重要作用，而乳腺癌又是导致女性癌症死亡的第二大原因 ［191］ 。相比于没有钙化的乳腺癌类型，伴随着钙化的乳腺癌被预测具有更强的侵袭性和更差的预后 ［192-195］ 。目前，乳腺癌发生过程中微钙化形成的分子机制仍不清楚，探明GRP在乳腺癌和皮肤癌中预防微钙化的可能作用，可能有助于更好地理解微钙化在癌症病理中的过程。
VieGas等研究了基底细胞癌和浸润性导管癌微钙化发生过程中GRP的γ-羧化状态。该研究证实了cGRP和ucGRP两种形式在健康组织和恶性肿瘤组织中不同的积累模式，结果表明，cGRP和ucGRP在健康皮肤和乳腺组织中同时存在，表明在正常生理条件下GRP羧基化状态不完全现象依然存在。而在肿瘤组织的微钙化部位，ucGRP是主要形式，而cGRP水平降低。非羧基化的GRP即ucGRP与异位微钙化有关，这些常见于恶性乳腺肿瘤，部分原因是BMP-2 的上调导致 ［196］ 。最近的一项关于GRP在健康和恶性组织中表达的研究表明，在健康条件下cGRP和ucGRP共定位，这表明健康受试者的羧基化状态不完全。肿瘤细胞和微钙化通常与较高浓度的ucGRP相关，表明ucGRP有可能作为异位钙化的标志物 ［197］ ；另外这些发现提示GRP可作为VK抗癌作用的潜在靶点，cGRP可能被作为异位钙化在肿瘤发生的可能标志物，所以ucGRP被认为可能是与肿瘤细胞相关的主要形式。
4.Gas6
（1）蛋白S与Gas6：蛋白S（ProS）是一种维生素K依赖性蛋白，在胶质瘤细胞系中的ProS，是胶质瘤侵袭性的主要因素 ［198 ，199］ 。有些文献中将肿瘤分泌性ProS命名为ProS1 ［200］ 。ProS是一种分泌型多功能糖蛋白，作为TAM（Tyro3、Axl和MerTK）家族的两种酪氨酸激酶受体Tyro3 和Mer TK的配体 ［199］ 。ProS最近被鉴定为多种细胞类型的细胞迁移的调节因子和作为胶质瘤侵袭性的主要因素 ［201 ~ 204］ 。有研究支持脑内源性神经干/祖细胞（NSPC）具有受蛋白S/Tyro3 通路调节的趋瘤性，实验表明内源性NSPC降低胶质瘤的生长和克隆形成，而且还表明它们通过一个涉及ProS的机制进而吞噬凋亡的胶质瘤衍生的碎片 ［205］ 。
癌细胞是功能性ProS1 的来源，ProS1 是一种潜在的旁分泌或自分泌的Tyro3 配体 ［195］ 。
除了ProS1，Gas6 也被发现在一些特定的癌细胞类型中呈高表达，在MDA-MB-231 乳腺癌细胞中有最高表达水平。因此，某些肿瘤细胞除了表达TAM受体之外还表达TAM配体，这表明肿瘤细胞具有自分泌或旁分泌调节的功能。研究发现人类癌细胞中ProS1-Tyro3-Erk信号转导途径，不同于先前报道的Gas6-Axl-Akt途径 ［206］ 。之前报道显示，这两个维生素K依赖性蛋白，Gas6 和ProS1 对 3 种TAM受体具有不同的特异性和结合亲和力 ［207 ，208］ 。已显示Gas6 在不存在磷酯酰丝氨酸（PtdSer）的情况下优先结合和激活Axl，但是当PtdSer存在的情况下则会激活所有 3 个类似的TAM RTKs ［200］ 。相反，ProS1 在存在和不存在PtdSer的情况下都优先激活Tyro3 和Mer TK ［209 ，210］ 。此外，Gas6 与Axl的两个串联免疫球蛋白（Ig）结构域中的每一个内在的接触位点同时相互作用，而在Tyro3 中仅认为存在一个接触位点 ［211］ 。该研究数据表明，在培养细胞中，在RTK是内源性和功能性的情况下，ProS1 是比Gas6 更强的Tyro3 配体 ［200］ 。
一些研究显示Gas6/ProS1 通过抑制血管再生表现出对肿瘤生长的抑制效果 ［212 ，213］ 。该研究显示，在同时存在Tyro3 和Axl的细胞中，分立的信号通路ProS1-Tyro3-Erk和Gas6-Axl-Akt同时存在 ［200］ 。在骨骼中，发现Gas6 通过Tyro3 刺激小鼠破骨细胞的功能，并激活Erk和Erk信号介导的Tyro3 在乳腺癌的增殖中的调节作用 ［214 ，215］ 。由于ProS1-Tyro3 连接到Erk进行信号转导，提示该通路具有调节细胞生长的潜力，而Gas6-Axl-Akt则调节细胞存活和/或侵入性信号转导 ［216 ~ 218］ 。
进一步而言，在该背景下，ProS1 是更显著的TAM配体，因为它能够刺激细胞内Erk和Akt信号通路，而Gas6 仅在两个TAM受体都存在的情况下刺激Akt信号通路。这些新的发现表明，当假定ProS1 只激活Tyro3 而不激活Axl时，Tyro3 也通过ProS1 的作用与癌细胞存活和增殖相关。
Gas6 已被证明在不同类型的癌症中表现出促进生长和治疗抗性 ［219 ，220］ 。一项调查胃肿瘤的研究显示Gas6 和Axl在癌组织中的表达增加，而正常黏膜仅显示微弱的表达；此外，在人胃癌细胞系中发现Gas6 mRNA，因此推测肿瘤细胞具有分泌Gas6 到细胞外环境中的能力 ［221］ 。与其他一些Gla蛋白类似，Gas6 依赖于γ-羧基化转化为其活性形式，事实证明Gla-缺陷的Gas6 表现出较差的受体结合活性 ［222］ 。由此，提示VKA治疗抑制Gas6 与Axl受体的相互作用，这降低了抗凋亡信号传导并抑制恶性肿瘤进展 ［220-223］ 。即未γ-羧基化的Gas6 蛋白可能作为“配体陷阱”结合并阻止随后的TAM激活，从而可能被开发为癌症治疗药物。这可能提供了一个分子机制解释，因此体内给华法林可以阻断胰腺癌模型中的Gas6Axl信号复合物 ［220］ ，以及华法林通过NK细胞Cbl-Gas6-TAM轴在小鼠中发挥抗转移（癌细胞）作用 ［224］ 。此处需要注意的是，也存在未羧基化的Gas6 促瘤作用的报道。如有研究指出与凝血酶原不同，Gas6 在其未羧基化状态下对肝细胞产生促肿瘤作用，Gas6 需要γ-羧基化进而结合和激活TAM酪氨酸激酶 ［119］ 。
由于VKA治疗阻断维生素K的作用，又失去维生素K的抗癌保护作用，因此在此处，仅从Gas6 与Axl凋亡信号通路角度看待抑制恶性肿瘤的问题，似乎补充维生素K在对肿瘤的治疗中产生了一定的拮抗效果，这一点还需要进一步的研究。
（2）Gas6 在癌症中发挥作用的结构：Gas6 于 1988 年被鉴定，并于 1993 年在小鼠胚胎NIH3 T3 成纤维细胞中得到进一步鉴定 ［225］ 。Gas6 在结构上与蛋白S相似，在细胞周期调控中起生长因子的作用。Gas6 是Tyro3、Axl和MerTK（TAM）家族受体的配体，通过它可以激活抗凋亡蛋白激酶B和丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）。Gas6 是一种由 678 个氨基酸组成的蛋白质，属于维生素K依赖蛋白（VKDP）家族。Gas6 的分子N端含有 11 个γ-羧基化谷氨酸残基（Gla），这些残基赋予VKD蛋白与细胞表面阴离子磷脂结合的能力 ［227］ 。在Gla结构域之后是一个环形结构和四个表皮生长因子（EGF）样结构域 ［226］ 。TAM受体（包括Axl，Mer和Tyro3）是一种受体酪氨酸激酶，具有一个胞内酪氨酸激酶结构域和一个胞外结构域，胞外结构域包含两个N端免疫球蛋白（Ig）样结构域和两个纤维连接蛋白Ⅲ型（FN Ⅲ）重复序列的组合 ［227 ~ 229］ 。TAM受体在许多人类癌症中异位表达或过度表达，并参与肿瘤的发展 ［230 ~ 232］ 。值得注意的是，Gas6 通过与TAM受体结合来调节癌细胞的增殖、存活和迁移。
在TAM的 3 个受体中，Gas6 对Axl的亲和力最高，其次是Tyro3，然后是Mer ［210］ 。Gas6 通过其性激素结合球蛋白（SHBG）结构域与Tyro3，Axl和Mer受体相互作用，并激活下游信号通路，如磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K），细胞外信号调节激酶（ERK）和活化的B细胞的核因子kappa轻链增强子（NF-κB）通路，进而调节增殖、迁移、分化、黏附和凋亡 ［226 ~ 235］ 。
大量研究表明上调Gas6/TAM（Axl、Tyro3 和Mer）可以促进一些癌症的发展 ［235 ，236］ 。所以临床上，Gas6 和TAM受体的表达总是预示着不良的预后 ［237］ 。Gas6/TAM是细胞增殖和迁移所必需的，一些研究表明，Axl和Mer的敲除可抑制肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡 ［238 ，239］ 。动物实验结果表明，人类前列腺癌细胞系在移植的Gas6-/-脊椎动物的生长情况明显比Gas6 +/+的动物更好 ［240］ 。另外，Gas6 在肿瘤微环境中也有作用。肿瘤可通过在微环境中产生白细胞介素 10（IL-10）和巨噬细胞集落刺激因子（MCSF），诱导瘤内巨噬细胞过度表达和分泌Gas6 ［241］ 。此外，Gas6 可与自然杀伤（NK）细胞上的TAM受体结合，增强其抗肿瘤免疫作用 ［242］ ，并且Gas6 可与血管平滑肌细胞（VSMCs）中的TAM受体结合，抑制其凋亡 ［243］ 。有趣的是，另一项研究报道，内源性产生的Gas6 对于Ca 2+ 动员生长因子而不是受体酪氨酸激酶诱导的VSMC增殖至关重要 ［222］ 。
（3）Gas6 过表达的相关研究：目前已知，关于Gas6 过表达的机制研究较少。已知，Gas6 在黑色素瘤、神经鞘瘤、胶质瘤和胰腺导管腺癌（PDA）细胞系中也存在过表达 ［235 ，238 ，244 ，245］ 。多项研究表明，Gas6 在卵巢癌和甲状腺癌患者的标本中上调 ［237 ，246］ ；一项乳腺癌的研究中显示Gas6 在乳腺癌中被扩增 ［247］ 。另外，Gas6 与Axl结合并诱导细胞存活，增殖和迁移 ［248 ~ 252］ ，Axl的过表达促进多种类型癌症的发展。研究表明，Axl在非小细胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤、骨肉瘤、急性髓细胞白血病（AML）、神经鞘瘤、胶质瘤和甲状腺癌细胞系中表达上调 ［231 ，235 ，253 ~ 255］ ，并且Axl在NSCLC、骨肉瘤、AML和甲状腺癌患者的肿瘤组织中过表达 ［230 ，231 ，254］ 。
（4）Gas6/TAM在癌细胞生存中作用：Gas6/TAM在癌细胞的存活中起着重要的作用。例如，在骨肉瘤细胞系MG63 和U2OS中，重组人Gas6 激活Axl可以保护肿瘤细胞免受血清饥饿引起的凋亡 ［230］ ，Axl的敲除抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导凋亡。此外，当用shRNA下调AML细胞系Nomo-1 和Kasumi-1 中的Mer表达时，使血清饥饿反应引起的成髓细胞凋亡率增加了 2~3 倍 ［256］ 。在这项研究中，研究人员还用Mer水平降低的Nomo-1 成髓细胞移植NOD-SCID-gamma小鼠，结果显示，与移植对照细胞系的小鼠相比，移植Mer水平降低的Nomo-1 成髓细胞的NOD-SCID-gamma小鼠的存活时间明显延长。
Gas6 和Axl相互作用激活PI3K-蛋白激酶B（Akt）途径，促进细胞存活 ［248 ，251］ 。Akt的激活通过NF-κB依赖性机制下调促凋亡基因Bad，并增加抗凋亡蛋白抑制B细胞淋巴瘤 2（Bcl-2）基因表达 ［249］ 。Gas6 与Mer结合并引起Grb2 的激活，Grb2 通过Ras和MEK1 促进ERK1/2 表达的增加 ［257］ 。Gas6/Mer相互作用还激活P38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）以促进细胞存活 ［258］ ，而Gas6/ Tyro3 刺激Akt存活途径，导致NF-κB的核易位和NF-κB靶基因的上调 ［235］ 。Gas6/TAM参与癌细胞存活的潜在机制的研究，预计将来可能涉及基因突变或上游调控因子等方面（图 3-6）。
图 3-6 Gas6/TAM在癌细胞和肿瘤微环境中的作用 ［265］
Gas6：生长停滞特异性基因 6；IL：白细胞介素；MCSF：巨噬细胞集落刺激因子；NK：自然杀伤细胞；VCMC：血管平滑肌细胞
Gas6/TAM在肿瘤细胞中的作用：Gas6 与TAM受体结合并促进癌细胞的增殖和迁移，抑制其凋亡。Gas6/TAM在肿瘤微环境中的作用：肿瘤可以通过向微环境中分泌IL-10 和MCSF来诱导瘤内巨噬细胞过度表达和分泌Gas6。Gas6 与NK细胞上的TAM受体结合，抑制其抗肿瘤免疫作用。此外，Gas6 还能与血管平滑肌细胞上的TAM受体结合，促进血管平滑肌细胞的增殖和血管生成。
（5）Gas6/TAM在癌细胞增殖中的作用：Gas6 是一种在细胞周期的G 0 ~G 1 期被上调的细胞有丝分裂原 ［260］ 。Gas6 通过诱导Akt和MAPK的磷酸化促进前列腺癌细胞表达Axl进而促进该细胞系的增殖 ［263］ 。敲除Axl可能通过抑制Akt通路，降低骨肉瘤细胞的增殖 ［262］ 。在动物实验中，在转染的NSCLC和甲状腺癌细胞中敲除Axl降低了裸鼠的肿瘤生长 ［253 ，262］ ，而Mer敲除后抑制裸鼠皮下NSCLC异种移植物的生长 ［252］ 。Gas6 受体Mer在大多数原发性急性髓系白血病（AML）患者的细胞中异常过表达，并参与AML的白血病发生 ［256］ 。成骨细胞分泌的Gas6 以旁分泌作用激活在Mer过表达的（q23；p13）转移的（E2A/PBX1）阳性急性淋巴细胞白血病细胞中有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路，促进细胞增殖和抗凋亡 ［263 ~ 265］ 。
另一项研究揭示Gas6/Axl相互作用于神经鞘瘤细胞增殖的潜在机制涉及Src，黏着斑激酶（FAK）和NF-κB ［235］ 。其他参与癌细胞增殖的机制还包括Gas6 与Axl结合而诱导ERK信号转导等 ［244］ 。
（6）Gas6/TAM在癌细胞的迁移中的作用：对Gas6 的应答后表现出癌细胞迁移的癌症包括前列腺癌和乳腺癌。Lee等人研究了DU145（前列腺癌）和A431（皮肤癌）细胞，发现Gas6 与Axl的结合主要通过上调Slug表达来诱导迁移 ［266］ 。Slug是Snail家族成员，在转移性乳腺癌，肺癌，间皮瘤和黑色素瘤中其表达增强 ［267］ ，并参与转移性前列腺癌细胞的侵袭和迁移 ［268 ，269］ 。
Gas6 不仅在正常血液和骨髓（BM）细胞中表达，而且在几种癌细胞中也表达 ［270 ~ 276］ 。致瘤过程与Gas6/TAM信号通路有关，Gas6/TAM信号通路可能是一种预后和预测性生物标志物，以及潜在的治疗靶点 ［273 ，277］ 。BM环境中的Gas6/AXL轴调节前列腺癌细胞的侵袭，增殖和存活，从而导致BM微环境（niche）中的转移休眠 ［279］ 。
（7）Gas6 在癌症转移中作用：Gas6 通过调节肿瘤细胞侵袭促进其转移 ［267］ 。肿瘤细胞的侵袭性是肿瘤转移的主要前提，而Gas6 明显参与了肿瘤的侵袭。使用DU145（前列腺癌）和A431（皮肤癌）细胞，Lee等 ［266］ 研究证实Gas6 降低E-cadherin（钙黏蛋白）的表达并诱导波形蛋白的表达。
通过磷酸化激活蛋白-1 和转录因子c-Jun以及激活转录因子-2，Gas6/Axl在癌细胞中促进c-Jun N末端激酶（JNK）和ERK1/2 信号转导，诱导Slug的表达，Slug是属于锌指因子蜗牛超家族的E-钙黏蛋白转录阻抑制因子，是细胞迁移所必需的 ［266 ，278］ 。另一项研究也表明Gas6/Axl轴诱导前列腺癌细胞侵袭骨髓，并在转移过程中增强细胞存活 ［279］ 。在乳腺癌中，Axl在细胞侵袭，EMT和癌症进展中所必需，它驱动细胞迁移，新生血管形成和肿瘤生长 ［280 ，281］ 。此外，恶性细胞通过刺激浸润性的白细胞产生有丝分裂原Gas6 来促进肿瘤生长 ［241］ 。另外，Gas6 可以促进前列腺癌细胞向骨髓扩散 ［276］ 。一旦这些细胞迁移到骨髓，扩散性肿瘤细胞（DTCs）可能会休眠数年，无法被标准临床方法检测到。这些DTCs在骨髓中的静止状态可能受到微环境控制的调节，微环境控制来自主要由成骨细胞，内皮细胞和其他骨髓元件组成的细胞“微环境”。Gas6 可与前列腺癌细胞表达的TAM受体结合，诱导前列腺癌休眠。另外，Dormady等 ［283］ 发现Gas6 在支持骨髓多潜能造血干细胞方面发挥重要作用，提示Gas6 在造血系统中的作用可能促进我们了解Gas6 在造血和淋巴组织或造血和淋巴恶性肿瘤中的作用。致瘤过程与Gas6/TAM信号通路有关，Gas6/TAM信号通路可能是一种预后和预测性生物标志物，以及潜在的治疗靶点 ［272 ，273］ 。BM环境中的Gas6/AXL轴调节前列腺癌细胞的侵袭，增殖和存活，从而导致BM niche（微环境）中的转移休眠 ［277］ 。总之，Gas6 具有促进肿瘤细胞侵袭和转移的能力。
（8）靶向Gas6/TAM的癌症治疗的研究进展：在多种癌细胞中Gas6/TAM的上调和其在促进癌细胞生存，增殖和迁移提示Gas6/TAM可以作为潜在的治疗靶点。一些研究表明，在胰腺导管腺癌（PDA）和骨肉肿瘤细胞中敲除Axl可以抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡 ［238 ，239］ 。此外，在NSCLC和甲状腺癌细胞中转染shRNA进行Axl敲除抑制裸鼠体内的肿瘤生长 ［253 ，256］ ；在多种情况下对选择性抑制肿瘤细胞的Axl结果表明，肿瘤细胞Axl酪氨酸激酶活性的抑制是在癌症患者中观察到的华法林疗效的关键决定因素 ［282］ 。
多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一种血液肿瘤，其特征是恶性浆细胞的增殖，部分是由于自分泌和涉及周围微环境的旁分泌环路；然而，其疾病进展的机制在很大程度上仍然是未知的 ［283 ~ 285］ 。由于Gas6/Mer自分泌信号轴促进MM细胞的增殖和存活，提示该信号通路可能是治疗不可治愈性恶性肿瘤的一个新的候选干预治疗方式 ［285］ 。有研究指出在MM细胞和骨髓间充质干细胞（BMSCs）中Gas6 与IL-6 协同的自分泌和旁分泌作用对MM细胞的凋亡抑制和细胞增殖提供了新的观点，发现Gas6/Mer下游信号通路与IL-6协同可能对MM的进展起关键作用，因此它们是治疗MM的很有吸引力的治疗靶点 ［286］ 。Gas6/TAM在肿瘤微环境中的免疫抑制作用也提供了有效的癌症治疗手段。如靶向肿瘤微环境中的Mer可能在临床中具有增强抗肿瘤免疫应答，进而促进免疫治疗策略的实施 ［287］ 。
5.骨膜素（periostin）骨膜素（有文献命名为POSTN）由间充质基质细胞产生，2008年报道含有Gla残基 ［179］ 。骨膜素通常在肿瘤细胞中过度表达，高水平的骨膜素与非小细胞肺癌和肝细胞癌（HCC）的较差预后相关 ［288 ，289］ 。骨膜素参与从骨和牙齿发育到细胞迁移 ［291 ，292］ ，血管生成和心肌重塑的多种功能 ［292］ 。转化生长因子β-诱导蛋白（big-h3）在结构上类似骨膜素，并且也被认为在多种癌症类型中具有促肿瘤生长特性 ［293］ 。对于骨膜素和big-h3 是否确实是Gla蛋白存在一些争议，2015 年的一项研究显示，尽管条件已经具备，然而其γ-羧基化仍未被检测到 ［294］ 。
骨膜素已被证明与成骨细胞和几种正常细胞和癌细胞中的整合素结合，包括αvβ3 和αvβ5，在这些细胞中它引起FAK、PI3-激酶和AKT信号通路的激活 ［296 ~ 297］ 。这些发现提示骨膜素在许多细胞环境中都可以作为一种前（促）生存蛋白。然而，Gla残基的功能却鲜为人知。值得注意的是，骨膜素中有 28 个谷氨酸残基（Glu），这些残基可以经翻译后修饰生成羧基谷氨酸残基（Gla） ［179］ 。与骨骼中的其他Gla蛋白（如OC和MGP）中所含的Gla残基的数量形成对比，骨膜素中存在数量众多的潜在Gla残基，而这两个蛋白则分别只有3 个和 5 个Gla残基。
在前列腺癌组织中，在肿瘤间质、癌上皮细胞以及恶性肿瘤周边区均可以检测到骨膜素。间质成分中，骨膜素的高表达与患者较短的生存期相关，而癌上皮细胞中骨膜素的低表达与较短的无进展生存期显著相关，提示间质成分中骨膜素水平高而癌上皮细胞中骨膜素水平低的患者预后较差 ［298］ 。事实上，有文献根据前列腺、癌肺、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌、膀胱癌、骨肉瘤和其他一些癌症进行了文献汇总，结果表明，一般而言，骨膜素高水平表达通常与更具侵袭性的肿瘤行为，晚期或不良预后相关，提示骨膜素水平可以是一个有用的预后生物标志物 ［299］ 。
6.未羧基化凝血酶原 血液循环中增加的未羧基化的凝血酶原（Des-γ-carboxy prothrombin，DCP或PIVKA-Ⅱ），即异常凝血酶原，可以被用来作为肝癌诊断和预后的标志物（与α-甲胎蛋白联合使用时） ［175 ，300 ~ 308］ ；另外PIVKA-Ⅱ目前的临床应用还包括支持新生儿维生素K缺乏性出血的诊断，监测维生素K拮抗剂的暴露情况 ［308］ 。根据PIVKA-Ⅱ特性，使用一种针对低羧基化促凝血酶的单克隆抗体，可以用来评估肝脏维生素K的状态。与凝血酶原时间（PT-INR）和活化部分凝血活酶时间（aPTT）等标准凝血试验相比，PIVKA-Ⅱ对维生素K缺乏更为敏感 ［259］ 。
在癌症患者中，受损的GGCX的活动与γ-羧基化不足的凝血酶原有关 ［309 ，310］ 。多项研究显示HCC患者PIVKA-Ⅱ升高，PIVKA-Ⅱ被认为是可靠的肿瘤标志物和预后指标。PIVKA-Ⅱ的作用机制是通过ERK1/2MAPK途径刺激基质金属蛋白酶（MMP）9 和MMP-2的分泌 ［311］ 。MMPs是一种蛋白水解酶，具有降解细胞外基质以促进其转移的能力 ［312］ 。PIVKA-Ⅱ也被认为是通过刺激Met-JAK-STAT通路作为HCC细胞的自分泌/旁分泌有丝分裂原的功能而发挥作用 ［313］ 。在胃肠道恶性肿瘤患者中，大多数患者术前PIVKA-Ⅱ水平高于参考范围，术后进一步升高，而常规凝血试验基本未受影响 ［314］ 。
7.蛋白Z（PZ）研究显示浆细胞肿瘤患者的PZ水平降低，并且与IL-6 水平呈负相关，推测可能是由于IL-6 对肝细胞的影响。这可能是浆细胞肿瘤相关的高凝机制之一，但PZ在多发性骨髓瘤及其相关并发症的发病机制中的作用尚需进一步研究 ［315］ 。PZ参与凝血调节，而凝血异常是肿瘤医生最常遇到的并发症之一，归因于多种因素，如肿瘤类型、疾病分期等。在恶性肿瘤患者中，PZ浓度下降与肿瘤进展相一致，可能意味着预后不良 ［316］ 。
8.讨论 在诸如癌症等长期慢性疾病患病期间，长期的低于维生素K最佳营养摄入剂量，导致除了失去维生素K的抗肿瘤作用之外，还可能影响Gla蛋白（VKDP）的功能 ［259］ 。不同VKDPs在对恶性肿瘤的增殖中体现出的促进或抑制作用，在促进或抑制恶性肿瘤的过程中，不同VKDPs之间可能体现出协同作用与拮抗作用。
据报道，目前在恶性肿瘤涉及的VKDP研究中，未羧化凝血酶原对肝细胞产生促肿瘤作用，与此相反，Gas6 需要γ-羧基化进而来结合和激活TAM酪氨酸激酶 ［118］ 。Gas6 具有调节肿瘤细胞增殖、抗凋亡和侵袭以及血液凝固中的负调节因子信号分子的作用 ［317］ 。而在肿瘤组织的微钙化部位，ucGRP是主要形式，而cGRP水平降低。对于MGP（已羧基化）则存在一些争议，在促瘤与抑瘤中均有报道。UCGRP可能是伴随着微钙化的肿瘤标志物，由于羧基化形式的OC对钙的吸附沉积作用，因此在微钙化特征的相关肿瘤中，羧基化OC可能也是一个恶性肿瘤标志物。PIVKA-Ⅱ目前已被认为是可靠的肿瘤标志物。综上在肿瘤促进作用当中可能涉及VKDP：PIVKA-Ⅱ、MGP、Gas6；对肿瘤的抑制作用中涉及的VKDP有MGP；肿瘤标志物有PIVKA-Ⅱ、OC和ucGRP（图 3-7） ［218］ 。另外由前文，笔者推测骨膜素可能也属于促瘤作用一组。在肿瘤促进和肿瘤抑制这两个相互拮抗的机制中，不仅上述不同分组的VKDP之间可能存在拮抗平衡，同一VKDP自身也可能存在自身的平衡，如MGP。
图 3-7 肿瘤促进和抑制的诊断和预后标志物
几项大型人群研究显示，维生素K摄入量与癌症发病率呈负相关关系，除了维生素K独立发挥的抗癌特性外，维生素K的作用还表现为通过影响Gla蛋白来发挥作用；由于许多Gla蛋白需要羧基化以达到最佳功能，维生素K摄入不足可降低或改变其功能 ［218］ 。因此，羧基化对于VKDP活化及抗癌治疗中应有重要意义。最新文献报道（2020 年）γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）也是VKDP中一员 ［318］ ，GGCX是VKDP中Glu转化为Gla的关键酶，所以当维生素K摄入不足时，GGCX无法成为具有活性的GGCX，这样维生素K缺乏事实上造成其本身（GGCX辅酶作用）和GGCX两者在功能上均被抑制，进而加重各个VKDP的羧基化受阻，影响机体细胞的正常代谢调控。这可能是导致机体恶性肿瘤细胞在促进和抑制机制平衡被打破的一个重要原因，进而提高恶性肿瘤的发病风险。同时VKDP中凝血因子C、S、Z和抗凝血蛋白Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ之间平衡关系可能也会被影响，由此可能导致上文中提及的“胃肠道恶性肿瘤患者中，大多数患者术前PIVKA-Ⅱ水平高于参考范围”现象 ［314］ 。
综上所述，补充推荐剂量的维生素K对于恶性肿瘤的防治具有积极的作用，由于我们目前阐明的机制仅是VKDP在这方面完整信号调控网络中的一部分，对部分蛋白在某些种类癌症中的作用存在争议有助于我们进一步的挖掘探究。此处，比较遗憾的是有的研究尽管有很多相关收获，由于其未关注VKDP在不同羧基化状态时对恶性肿瘤进行更加具体的分类对比检测，所以，未能在此进行更全面、统一的对比分析。相信在之后的研究中能填补这些空白，扩充我们对于VKDP在恶性肿瘤方面的认识。我们进一步推测，从我们的角度观察，恶性肿瘤细胞作为一个细胞为了追求永生，放弃其本身作为多细胞生命个体中分化细胞的身份，而私自实现自身使命和利益最大化，最终导致多细胞个体生命死亡。反之，或许是多细胞生命个体利用细胞自身对永生的本能追求，进而采用诸多调控网络的精确控制手段才实现了正常生命周期的推进，而VKDP的调控网络或许便是该宏大调控网络中的重要一部分。因此希望，借由VKDP的相关作用机制，引领我们进一步扩展对生命运作机制的认识。
1.与肥胖相关的Gas6 肥胖已被证明在慢性代谢紊乱的进展中是一个主要的危险因素，如糖尿病、慢性肾衰竭、CVD和高血压 ［319］ 。
Gas6 已被报道参与各种细胞类型（脂肪细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、骨髓细胞等）和组织（卵巢、心脏、肾脏等）的增殖、分化和炎症反应过程 ［320 ~ 322］ 。另外，在树突状细胞和巨噬细胞中，Gas6 负向调节炎症反应，但它促进凋亡细胞的吞噬，还积极参与自然杀伤细胞的成熟 ［323］ 。另外Gas6 与TAM受体相互作用，TAM受体可能同时作为炎症促发剂和炎症抑制剂发挥作用 ［324 ，325］ 。在维生素K依赖性蛋白中，Gas6 是最经常与炎症相关的，同时肥胖被认为是慢性炎症疾病。因此，鉴于Gas6 涉及肥胖和相关炎症，且在其中发挥着重要作用，本文对此内容做一些介绍。
2.Gas6 信号在肥胖进展中的作用 Hsiao等 ［326］ 研究了血液循环中Gas6 的功能和可溶性Axl（sAxl）在台湾超重和肥胖青少年人口在肥胖进展和胰岛素抵抗中的作用。其结果表明，超重和肥胖青少年血液循环中Gas6 和sAxl水平显著高于瘦体型组（ P < 0.05）。在超重和肥胖青少年中，通过校正年龄、性别、Tanner分期、饮酒和吸烟状况后，Gas6 水平与HOMA-IR呈显著正相关（r=0.268， P < 0.01）。有趣的是，血浆Gas6 浓度每增加 1ng/ml与超重和肥胖青少年中胰岛素抵抗风险增加 15%~19%。然而，对老年 2 型糖尿病患者进行的临床研究显示，与健康个体相比，血浆Gas6 水平（14.3ng/ml vs 11.5ng/ml）与体重指数（BMI，23.9kg/m 2 vs 26kg/m 2 ）和血糖水平呈负相关 ［327 ，328］ ，这意味着衰老和高血糖可能是影响血液循环中Gas6 水平的重要共同因素。超重的男性和女性的血浆Gas6 水平没有差别 ［329］ 。然而，绝经后超重女性血浆Gas6 水平明显低于绝经前超重女性，提示雌激素可能影响Gas6 的表达 ［330］ 。观察表明，Gas6 的表达水平不仅与肥胖有关，还与年龄、性激素和高血糖等其他因素有关。另外在动物实验中，当饲喂高脂肪饮食时，高脂喂养小鼠皮下脂肪中Gas6 表达增加 ［331］ 。相比于野生型小鼠，Gas6 缺陷小鼠的皮下脂肪和性腺脂肪蓄积明显减少 ［321］ 。
3.Gas6 信号在肥胖相关的炎症中作用 肥胖被认为是一种慢性炎症疾病。血浆和脂肪组织水平的炎性细胞因子例如IL-6，TNF-α被报道随着肥胖的进展而增加 ［332 ，333］ 。Axl是Gas6 的一个重要受体，最初在人髓系白血病细胞中被表征为转化基因，现已被证明在调节炎症中发挥作用 ［334］ 。在临床研究中发现超重和肥胖青少年中，血液循环中的Gas6 和溶解性Axl的水平与血浆中的TNF-α、IL-6 和C反应蛋白（CRP）水平相关 ［326］ 。
此外，携带Gas6 rs8191974 基因型GG多态性的男孩CRP水平显著升高 ［335］ 。这些观察表明，青少年血液循环中Gas6 和可溶性Axl水平与肥胖诱发的炎症发作呈正相关，尤其是在男孩中。而在女性中显示Gas6 表达与血浆CRP水平升高所指示的全身炎症之间的相关性较低 ［336］ 。女性患者血浆CRP水平升高，与Gas6 表达与系统性的炎症发作的相关性较低 ［336］ ，这可能与雌激素在Gas6 表达与炎症之间的作用有关，尚需进一步研究。此外，Gas6 信号转导已被证实与各种慢性心脏代谢紊乱相关，包括血栓形成、糖尿病、慢性肾衰竭、CVD和癌症 ［337 ~ 341］ 。
在青少年中，血液循环中Gas6 与BMI和炎症细胞因子呈正相关 ［326］ 。此外，Gas6 是TAM受体中唯一已知的诱导Axl下游级联反应受体的配体，与Gas6 一样，青少年血浆Axl水平与BMI和炎症细胞因子呈正相关 ［326］ 。药物R428 干预减少了脂质摄取，导致皮下和性腺脂肪量减少，使小鼠体重增加 ［342］ 。这提示Gas6 受体Axl可能是肥胖及相关并发症治疗策略发展的重要靶点。
4.Gas6 信号转导在肥胖治疗中的临床意义 Gas6 的正常血浆浓度在 20~50ng/ml范围内，癌症或炎症患者表现出更高的浓度 ［343］ 。
Gas6/Axl信号通路在肥胖及相关并发症的炎症反应机制中起重要作用。然而，Gas6 与肥胖相关的心脏代谢异常之间的因果关系仍有争议。从临床的角度来看，阐明Gas6 信号转导的作用（由实验到临床）将为肥胖和其相关的并发症的预防和治疗策略的发展提供很大的帮助 ［343］ 。Gas6 可能与肥胖和炎症有关，然而，这种关联性可能被高血糖和衰老这两个因素所掩盖。
5.与炎症信号分子相关的Gas6 Gas6/TAM信号在多种人类疾病中的触发系统性炎症反应的作用中具有重要作用，这些疾病包括肥胖、感染、急性脑卒中和急性冠状动脉综合征 ［334 ，344］ 。Toll样受体（TLR）的激活，特别是TLR2 和TLR4 的激活在炎症的发病机制中起重要作用 ［345］ 。研究表明，Gas6/AXL通路通过下调TLRs和细胞因子受体信号分子的活化，在抑制炎症病理生理过程中发挥作用 ［336 ，337］ 。TLRs通常被病原体相关分子（如LPS）激活，并通过NF-κB（核因子κB）信号通路的激活诱导炎症反应。作为对TLR/细胞因子信号的回应，Axl表达被上调，随后与干扰素α和β受体（IFNAR1）相互作用。AXL/IFNAR1 复合物导致信号转导和转录因子激活因子（STAT1）的螯合和激活，以诱导细胞因子和TLR抑制剂的表达，其中抑制剂来自细胞因子信号（SOCS）分子抑制剂家族，例如SOCS1、SOCS3 和Twist1 ［338 ，349］ 。SOCS家族蛋白是细胞因子和TLR信号转导的负调节因子。总之，Gas6/AXL在调节细胞因子信号转导中发挥重要作用，进而起到预防血管炎症、胰岛素抵抗和糖代谢受损的作用。
6.与 2 型糖尿病（T2D）相关的Gas6 2 型糖尿病（T2D）正逐渐成为世界范围内最严重和日益扩大的健康问题之一 ［350］ 。低度慢性炎症和先天免疫系统的激活在T2D的发展中起重要作用 ［351］ 。Hung等 ［327］ 研究了血浆Gas6 浓度与 2 型糖尿病患者人群糖耐量和胰岛素敏感性改变的关系；其实验包括 278 例台湾成年人，96 例糖耐量正常（NGT）、82 例糖耐量受损（IGT）、100 例糖尿病患者（T2D），结果显示相比于NGT实验对象（14.30±0.66ng/ml），T2D患者血浆Gas6 浓度明显降低（11.50±0.42ng/ml）（ P < 0.001）。多元stepwise回归分析显示，女性血浆Gas6 浓度与BMI呈负相关（r=0.186， P =0.022），腰围（r=0.187， P =0.022），腰臀比（r=0.189， P =0.022），餐后 2 小时胰岛素（r=0.171， P =0.035），HOMAIR（r=0.171， P =0.035）与胰岛素敏感性（QUICKI）呈正相关（r=0.168，P=0.039），而这种关联（QUICK）在男性群体则没有体现。同时作者提到女性雌激素可激活下游的PI3K/Akt信号通路，通过与Gas6 启动子功能性雌激素应答分子结合调节胰岛素敏感性和胰岛素抵抗 ［329］ 。
7.讨论 在前文中，2013 年的一项研究表明，台湾青少年中肥胖青少年血液循环Gas6（12.3ng/ml vs 13.9ng/ml）和可溶性Axl（3.8ng/ml vs 4.7ng/ml）明显的增加，并且与BMI（19.5kg/m 2 vs 27.8kg/m 2 ）和体脂质量呈正相关 ［326］ 。动物实验的结果也与此一致，并且在Gas6 缺陷小鼠中更明显，即Gas6 表达水平与脂肪蓄积呈正相关。而在老年 2 型糖尿病患者中，血浆Gas6 水平与BMI和血糖水平却是呈负相关，由此推出衰老和高血糖可能影响循环中Gas6 的水平，另外显然Gas6 水平还会被雌激素影响，不过其具体机制还需要进一步的探究。Axl是Gas6 结合的受体TAM中与之亲和力最高的亚型，由此Gas6/Axl信号通路涉及文中诸多机制，如Gas6/Axl-TLR（TLR2 与TLR4）-NF-κB的通路诱发炎症。同时肥胖被认为是一种慢性炎症，在血液循环中的Gas6 与Axl（溶解性）水平与BMI呈现正相关（尤其青少年人群），这一结果与上述炎症通路机制一致，提示Gas6 的该炎症机制或许诱导肥胖。此外，除了NF-κB，Gas6 还通过其SHBG结构域与TAM受体相互作用以激活下游信号通路，例如PLCγ、PI3K、ERK，进而调节细胞存活、增殖、迁移、分化、黏附和凋亡 ［230 ，231］ 。分析Gas6 和TAM受体信号，似乎已经是进一步促进理解相关疾病的进程和治疗方法发展的基础。
由于Gas6 是VKDP中的一员，维生素K辅助其完成羧基化成为成熟的Gas6 形式，然而目前进行的文献调研中，并未明确不同羧基化形式的Gas6 对Gas6/TAM机制中的作用，相信将来的研究能更清楚地阐释这一点。
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