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公元325年，罗马帝国皇帝君士坦丁一世（280—337）定基督教为国教。他建立了壮丽宏伟的教堂，并制定了一套礼拜仪式。但在礼拜仪式中演唱统一的圣歌，是到了六世纪才实现的。从四世纪至六世纪，有一位主教和一位教皇以致力于统一教会歌曲而闻名于世。
四世纪时，米兰主教安布罗斯在米兰建立了一所大教堂，立志整顿教会歌曲，改革圣歌的唱法。由他收集、整理和创作的圣歌，世称“安布罗斯歌曲”。安布罗斯还在教会歌曲中引进“对唱”的形式，也就是两个歌队一唱一和的唱法。这种唱法相传是安布罗斯所发明的，但也有人说是二世纪初安提阿主教圣伊格那修斯（约50—约107）梦见天使唱歌时一唱一和，因而得到启发，才创造了对唱的形式。其实这种形式在古代希伯来人的礼拜仪式中早已存在。《圣经·旧约·诗篇》常由一系列上下句组成，由分列两边的歌队一唱一和，或由领唱者和歌队一领众和。如《诗篇》第19篇就是这种形式：
〔甲〕诸天述说神的荣耀，
〔乙〕穹苍传扬他的手段。
〔甲〕这日到那日发出言语，
〔乙〕这夜到那夜传出知识。
……
安布罗斯歌曲据说有不少是安布罗斯自己创作的，其中最著名的一首是《我颂赞你，上帝》，它的起句是：
相传安布罗斯给圣奥古斯汀（354—430）施行洗礼，两人同时心血来潮，一唱一和地对唱起来，唱的就是《我颂赞你，上帝》。这当然是荒诞无稽的传说。这首早祷时所唱的圣歌，后来被许多作曲家处理成节日的欢歌。从十六世纪的帕莱斯特里那、十八世纪的亨德尔和巴赫，到十九世纪的柏辽兹、布鲁克纳、德沃夏克和威尔第，都曾为它谱过曲。
格列高利一世
六世纪时，罗马教皇格列高利一世锐意改革基督教会的仪式音乐。他在罗马创办了一所“唱歌学校”，在他的监督下训练教会歌曲的歌者，成为欧洲历史上最早的一所音乐学校。公元599年他下令收集东西方教会的一切圣歌，经过他的厘定，编成了一本《对唱歌集》（Antiph-onarius cento），以供一年四季的宗教仪式之用。其中包含六百多首圣歌，世称“格列高利歌曲”。相传格列高利一世把这本歌集用链条挂在罗马圣彼得教堂的圣坛上，作为教会歌曲的准则。格列高利歌曲以格列高利为名，但它的形成实非他一人之功，在他以前已经经历了长期的发展过程，在他以后又经过了多人的增补和修订。
格列高利歌曲是基督教会举行弥撒（一种纪念和表演耶稣及其十二门徒共进最后的晚餐的仪式）和每天八次日常祷告时所唱的圣歌。它的拉丁文歌词全都出于《圣经》，采用散文的形式；歌调是单声部的曲调，节奏自由，不分小节。歌词的一个音节有唱一个音的（下例1，下例2），有唱几个音的（下例3），也有唱许多音的（下例4）。
这些都是举行弥撒时所唱的圣歌，《天主啊，矜怜我们》《我信仰一个上帝》和《圣哉》分别用作常规弥撒的第一、第三和第四段音乐，而《愤怒之日》则用于为死者所唱的弥撒曲（即追思曲），后来柏辽兹的《幻想交响曲》、李斯特的《死之舞蹈》、圣-桑的《死神之舞》和拉赫玛尼诺夫的《帕格尼尼主题狂想曲》等作品，都用它来作为象征死亡的主题。由于当时的记谱法还很粗略，谱上的音符只能标明音的高低，不能标明音的长短，唱起格列高利歌曲来，节奏的缓急轻重要靠口传；到了后来，就渐渐失传了。