第七节
免疫治疗相关机制研究

结核病既是一种细菌感染性疾病，也是一种免疫性疾病。结核病的发生、发展及转归与机体的免疫状态密切相关。对结核病患者应用免疫制剂进行免疫干预，可增强其免疫功能，从而提高疗效、缩短疗程、减轻组织损伤和改善预后以及减少耐药和降低复发率。因此，免疫制剂对抗结核菌的相关机制研究，将为结核菌的免疫治疗提供强有力的理论基础。

一、PD-1阻断剂加重恒河猴对结核分枝杆菌的感染

（1）目的：

aPD-1治疗 M . tb 感染的恒河猴，检测其在结核感染中的调节作用。

（2）方法：

①选取雄性恒河猴，感染H37Rv，之后静脉注射IgG4或aPD-1。②PET/CT扫描及结果分析。③细胞的分离和刺激培养：支气管肺泡灌洗液样品通过细胞过滤器过滤、沉淀，并计数进行分析。淋巴结和脾脏分离使用组织分离器。从肺中分别切除肉芽肿，并将用于流式细胞术分析的样品推入细胞过滤器。④肉芽肿匀浆和血浆样品进行无菌过滤和蛋白质浓度分析。⑤共聚焦成像与结果分析。⑥微生物群分析：粪便DNA在IlluminaMiSeq Platform平台测序。利用线性判别分析微生物群。

（3）结果：

①肺肉芽肿中的PD-1表达量在CD4和CD8 T细胞上最高且主要位于外周血淋巴细胞丰富的区域。②注射aPD-1组的肉芽肿中的细菌数量增加20倍，但在肺引流淋巴结中的细菌数量没有变化。③注射aPD-1后血液和气道中CD4 T细胞的聚集被延迟，而 M . tb 特异性CD8 T细胞无变化。肺淋巴结 M . tb 特异性CD4和CD8 T细胞的表达无明显影响。在肉芽肿中，对照组和aPD-1处理组的 M . tb 特异性CD4 T细胞无区别，而PD-1阻断显著增加了 M . tb 特异性CD4 T细胞。④PD-1阻断不改变 M . tb 特异性CD4 T细胞产生的IFN-γ，CD153或颗粒酶B，但导致IL-2轻微减少和IL-17A增加。⑤用aPD-1处理后，肉芽肿中TNF ⁺ M . tb 特异性IL-18，IFN-γ和TNF的表达显著增加。

（4）结论：

PD-1受体阻断使肺肉芽肿炎症水平升高以及细菌载量增加。共抑制受体PD-1在 M . tb 感染过程中对宿主具有保护作用，免疫负调节是宿主抗 M . tb 感染的一个重要方面。

二、白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合免疫治疗慢性结核

（1）目的：

研发一种新的治疗策略来缩短结核病疗程。

（2）方法：

①表达纯化AlbGM-CSF和albumin-Gluc（albGLuc）蛋白。②购买C57BL/6J、FcRn-KO小鼠。眼眶后注射GLuc（20μg）或albGLuc（2.8μg）。注射后72小时，取血清、腹股沟神经和肺。测定GLuc活性。③取出C57BL/6J小鼠的骨髓细胞，将骨髓细胞与GM-CSF或albGM-CSF孵育培养。收集细胞分析CD11c ⁺ 细胞和CD11c ⁺ MHCII ⁺ 细胞百分率。将骨髓细胞与GM-CSF共温育以获得骨髓来源的树突状细胞（BMDC），与巨噬细胞集落刺激因子一起孵育以获得骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）。④H37Rv气溶胶感染C57BL/6J小鼠。感染1个月后通过食管灌胃给予异烟肼。在实验组中，小鼠通过眶后或皮下注射GM-CSF或albGM-CSF。取肺匀浆，并将细胞铺板进行菌落形成单位测定。⑤统计学分析。

（3）结果：

①注射albGLuc或GLuc后，albGLuc组的血清荧光素酶活性比GLuc组高100倍，并且这种荧光素酶活性差异在注射后至少维持72小时。②albGM-CSF注射组小鼠血清GM-CSF水平、树突状细胞数量显著高于GM-CSF注射组。③albGM-CSF注射组小鼠的引流淋巴结中观察到的树突状细胞数量显著增加。但在FcRn-KO小鼠中，albGM-CSF 或GM-CSF注射组没有差异。④albGM-CSF治疗组的肺的平均细菌负荷显著低于未治疗组和GM-CSF治疗组。与未治疗相比，GM-CSF治疗并没有显著改变肺中的细菌负荷。相对于GM-CSF或未治疗组，通过静脉或皮下途径递送的albGM-CSF对慢性结核病具有更好的治疗效果。

（4）结论：

本研究结果表明albGM-CSF作为原位疫苗，显著增加了小鼠引流淋巴结和肺中的树突状细胞数量，大大降低了肺部的细菌载量，增强了其在肺中的抗结核作用。

［专家点评］

结核病的免疫治疗是指利用免疫制剂来调节机体的免疫系统，使机体对疾病产生适当的免疫应答，从而达到对机体免疫功能激活、抑制或双向调节的目的，以辅助结核病的化学治疗。结核病的免疫治疗主要包括免疫调节以及免疫重建。

用于免疫治疗的免疫制剂主要包括：生物制剂和化学药品。其他结核病免疫治疗研究热点包括细胞免疫治疗、治疗性疫苗、纳米颗粒以及程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）抑制剂等。PD-1与程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）相结合，导致免疫抑制是人体的一种自我保护措施，避免过度免疫。尽管已经有多篇文献报道了PD-1/PD-L1抑制剂引起的早期TB感染和复发，但在使用免疫检查点抑制剂进行免疫治疗期间发生TB的机制尚未明确。上述第一项研究探讨了PD-1在恒河猴 M . tb 感染中的作用。与对照组猕猴相比，接受抗PD-1单克隆抗体治疗的动物病情恶化，肉芽肿细菌负荷增加。PD-1阻断增加肉芽肿 M . tb 特异性CD8 T细胞的数量和功能。相比之下，抗PD-1处理的猕猴中的 M . tb 特异性CD4 T细胞在肉芽肿中的数量或功能没有增加，CTLA-4表达升高，活体成像显示病灶转移减少。在抗PD-1治疗的动物的肉芽肿中，多种促炎细胞因子升高，并且更多的细胞因子与细菌负荷相关，确定了胱天蛋白酶1在PD-1阻断后加重结核病的作用。最后，在个体猕猴感染前，发现PD-1阻断后增加的 M . tb 细菌负荷与肠道微生物群的组成有关。因此，PD-1介导的共抑制是控制猕猴 M . tb 感染所必需的，可能是因为其在抑制有害炎症和允许正常的CD4 T细胞应答中的作用。

细胞因子是通过影响细胞发育、转运和功能来协调固有免疫和适应性免疫反应的小分子蛋白质。第二项研究使用白蛋白融合策略来增强GM-CSF向小鼠的肺和引流淋巴结的传送，增强了药物的抗结核能力。但是，还需要进一步的研究来评估albGM-CSF作为辅助治疗与标准一线方案相结合的潜在作用，以缩短药物敏感和耐药结核病的疗程，并改善结核病诱导的肺部病理。除了对慢性肺部感染的潜在效用，这种白蛋白融合策略还可能代表了一种在癌症预防和治疗性疫苗中开发新型佐剂的方法。

点评专家：黄银霞 Qx5EBdItSz/kDnwccp8La8Gg2Jxvppy8FYPtcUdi6aNUwj/KO1OkRdCDfO1zVE2n