第六节
各类免疫细胞参与应答的机制研究

M . tb 侵入呼吸道后，首先激活固有免疫反应，肺泡中的巨噬细胞释放大量炎症因子，此外，适应性免疫主要包括体液免疫及T细胞介导的细胞免疫，在机体对抗感染过程中发挥重要作用。因此，针对 M . tb 的免疫是多细胞、多因子参与的复杂过程，深入解析不同细胞在 M . tb 感染后宿主免疫反应中的具体机制，一方面可以扩展抗 M . tb 感染免疫的相关理论，另一方面可以为药物及新治疗方案的开发提供靶标。

一、嗜酸性粒细胞参与结核分枝杆菌感染后粒细胞反应并促进小鼠防御反应

宿主抗 M . tb 感染的免疫反应需要多个白细胞亚群的活动，嗜酸性粒细胞量对于结核感染状态有提示作用，在多种物种内研究嗜酸性粒细胞与 M . tb 感染免疫反应之间的关系，以期加深对 M . tb 感染后的免疫反应的理解。

（1）目的：

阐明嗜酸性粒细胞如何参与 M . tb 感染后宿主的免疫反应，为阐明肺部感染后嗜酸性粒细胞的功能和寻找宿主导向治疗的潜在新靶点提供了新方向。

（2）方法：

在三个独立的临床队列中，探究嗜酸性粒细胞是否参与结核病免疫反应，结合影像技术明确其与代谢活跃程度之间的关系，并在肉芽肿组织中确认其具体位置。

（3）结果：

结核病患者外周血嗜酸性粒细胞的数量会随着疾病的严重程度增加而减少，在病变肺组织细胞悬液中嗜酸性粒细胞数量较多，嗜酸性粒细胞较多聚集于代谢较活跃的区域，主要存在于肉芽肿组织边缘区域，结核肉芽肿中心有嗜酸性粒细胞脱颗粒。此外，研究证实嗜酸性粒细胞以脱颗粒的形式被激活从而发挥功能，并影响病灶中的细菌生长，但其自身并不受 M . tb 侵袭。

（4）结论：

嗜酸性粒细胞是小鼠、猴和人结核肉芽肿和 M . tb 感染肺部的重要细胞成分。在多种物种中揭示了嗜酸性粒细胞和结核病之间的联系，并揭示了这些细胞在小鼠中的保护作用，为阐明嗜酸性粒细胞的功能和寻找结核宿主导向治疗的潜在新靶点开辟了新方向。

二、组织驻留记忆T细胞分泌IL-17且参与调控人肺内结核分枝杆菌

T细胞介导的适应性免疫对于结核病至关重要，其中组织驻留记忆T细胞具有重要的调控作用，本研究主要阐明了肺组织驻留记忆T细胞的具体作用，并验证IL-17在抗结核感染免疫过程中的作用。

（1）目的：

探究人体肺组织驻留记忆T细胞分泌IL-17并参与调控 M . tb 感染后宿主免疫反应的具体机制。

（2）方法：

通过流式细胞术检测肺组织单细胞悬浊液，通过金属同位素标记进行单细胞多参数分析。利用 M . tb -300分析可与 M . tb 抗原表位特异性结合的细胞群，建立肉芽肿模型，明确T细胞亚群是否可以改善结核病的发展。

（3）结果：

结核病患者肺组织含有功能性效应记忆T细胞，与 M . tb 抗原表位特异性结合的IL-17 ⁺ 细胞集中于肺组织，肺组织中表达FoxP3的结核特异性CD4 ⁺ T细胞的比例比血液中高出6倍以上，结核特异性IL-17 ⁺ CD4 ⁺ T细胞百分比与血浆IL-1β浓度呈显著负相关，肉芽肿模型结果显示，IL-17和IL-2的培养基中 M . tb 的生长明显受到抑制，发现IL-17和IL-2对CFU有抑制作用。

（4）结论：

肺组织中分泌细胞因子IL-17的结核特异性组织驻留记忆T细胞对抗结核感染免疫具有重要作用。

三、人体内记忆反应中增强的IL-17A活性能区分活动性结核、潜伏性感染和治愈性结核

（1）目的：

鉴定活动性肺结核的免疫病理反应。

（2）方法：

①提取活动性结核病患者、结核分枝杆菌潜伏感染者和治愈的结核病患者外周血，并进行结核菌素皮肤试验、硬结的大小以及转录组学分析或组织学分析。②基因表达模块的推导与分析。③分离PBMC细胞，刺激培养。流式细胞术检测IL-17A的含量。④CD14 ⁺ 单核细胞的分离与刺激培养。⑤免疫组化检测IL-17F的含量与分布情况。⑥细菌负荷的定量。

（3）结果：

①重点研究的151个基因在活动性肺结核患者中的表达是潜伏性肺结核患者的2倍以上。②Th17以及IL-17A在活动性肺结核患者的感染部位表达升高，IL-17A诱导的趋化因子CXCL1、CXCL8和S100A亦相应升高。Th17细胞和IL-17A诱导的基因主要富集在淋巴结以及肉芽肿部位。③在治愈的结核病患者中，IL-17A和IL-17F基因、IL-17F蛋白以及IL-17A诱导的基因表达降低，同样TH17和中性粒细胞相关转录组件以及MMP1的表达降低。④IL-17A的表达以及TH-17、MMP1的表达与结核病的严重程度、肺结核抑或肺外结核、种族、性别以及地理位置无关。⑤PBMC中的TH-17相关转录组件的表达在ATB和LTBI组中没有区别，同样CD4 ⁺ 或CD8 ⁺ T细胞分泌的IL-17A也没有差别。⑥ATB和LTBI的CD14 ⁺ 单核细胞基线转录组没有差别，但经过PPD刺激培养后，和LTBI相比，IL1A，IL1B和IL6基因在ATB的CD14 ⁺ 单核细胞中约有2倍升高。体外实验也表明，与LTBI和治愈的TB相比，ATB患者的结核菌素皮肤试验中IL-1β和IL-6细胞因子活性增加。

（4）结论：

ATB患者的IL-17A和TH17细胞反应增强，从而促进了中性粒细胞的聚集以及MMP-1的表达，而这些均与结核病的发病机制相关。单核细胞来源的IL-1β和IL-6细胞因子能够促进TH17细胞的分化。

四、TREM-2与CD3ζ-ZAP70复合物相互作用促进Th1类抗结核感染免疫应答

髓样细胞触发受体2（TREM-2）是免疫细胞模式识别受体的信号枢纽，Th1细胞在宿主免疫防御和炎症反应中至关重要，而TREM-2在体内感染和炎症中的作用仍不明确，故本研究探索Th1细胞参与抗 M . tb 免疫应答中的作用。

（1）目的：

阐明TREM-2参与调控Th1细胞抗感染免疫反应中的作用。

（2）方法：

收集外周血单个核细胞，建立BCG及H37Rv感染的小鼠模型，检测TREM-2的表达水平以及T细胞激活标志物的表达水平。利用FC融合蛋白染色观察TREM-2配体（TREM-2L）的表达水平。应用IP和液相色谱质谱（LC-MS）技术探索下游信号分子。构建质粒，结合免疫共沉淀探索TREM-2参与CD3ζ-ZAP70激活的关键结构域和残基。

（3）结果：

在人及小鼠中均发现TREM-2 ⁺ CD4 ⁺ T细胞中，中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和终末分化效应T细胞百分比增加，初始T细胞比例降低，提示TREM-2的表达与CD4 ⁺ T细胞的激活和记忆表型呈相关。细胞共培养结果提示WT CD4 ⁺ T细胞比TREM-2 ^-/- CD4 ⁺ T细胞产生更多的IFN-γ；说明TREM-2信号通过T细胞抗原递呈细胞间的相互作用诱导CD4 ⁺ T细胞活化，且TREM-2促进了TREM-2 ⁺ CD4 ⁺ T细胞增殖和Th1细胞分化，并通过其跨膜结构域与CD3ζ/ZAP70相互作用，激活STAT1/STAT4从而促进Th1分化。

（4）结论：

研究探讨了CD4 ⁺ T细胞中TREM-2的作用。结果显示CD4 ⁺ T细胞中TREM-2的表达与感染和炎症相关，其通过与TCR-CD3ζ-ZAP70复合物以及CD4 ⁺ T细胞中的IFN-γ相互作用，激活STAT1/STAT4信号通路来增强Th1免疫应答反应。

［专家点评］

固有免疫是由吞噬细胞主导的防御机制，也是宿主抗 M . tb 感染的第一道防线，结核领域对于单核巨噬细胞、肺巨噬细胞和中性粒细胞等已经有了一定的研究，而关于嗜酸性粒细胞的研究多以病例报告的形式出现，最近的一项相关研究在三个独立的临床队列中对嗜酸性粒细胞进行定量，并在肉芽肿组织切片中确认嗜酸性粒细胞具体位置，结合细胞数量，明确嗜酸性粒细胞在 M . tb 感染过程中的作用，并给未来研究宿主抗结核感染固有免疫的机制提供了新的方向，即嗜酸性粒细胞缺乏与神经元相关通路变化之间的关系，此外还提示未来的研究应将目光从单一独立的细胞群中转向分析各细胞间调控作用的相互联系，从整体的角度综合分析 M . tb 感染后宿主的免疫反应。

除了固有免疫这道屏障外， M . tb 入侵后，宿主导向的保护性免疫以及抑制细菌增殖与适应性免疫反应也有关。细胞因子的分泌和抗原特异性T细胞发挥的抗菌作用是宿主抵抗 M . tb 感染的适应性免疫反应的关键特征，此外也有研究称CD4 ⁺ T细胞应答水平是 M . tb 感染结局的一个关键特征，与结核病转归有关。现阶段对于T细胞不同亚群的抗感染、炎症作用均有一定的研究，如对宿主抵抗胞内寄生菌具有重要意义的Th1T细胞，既往研究证实TREM-2与TCR-CD3ζ-ZAP70复合物和CD4 ⁺ T细胞中的IFN-γ相互作用，激活STAT1/STAT4信号通路，增强Th1细胞免疫应答反应；此外，当前注册使用的唯一抗结核疫苗是由牛结核分枝杆菌减毒而来的卡介苗（BCG），但该疫苗对成年人以及免疫功能异常人群的保护效力不足，并且接种BCG可能会导致部分辅助诊断结核病的检测（如结核菌素皮肤试验）出现假阳性结果，而记忆T细胞除了参与免疫应答调控实现抗感染的作用外，抗原特异性记忆T细胞长期存在的特性也使得开发抗分枝杆菌免疫的疫苗成为可能。不同亚群的T细胞及其分泌的细胞因子在免疫反应中形成错综复杂的网络，相互影响、相互制约，共同作用调控结核病的转归。

点评专家：张宗德 8p93hNJeYl4B5l3gmTrxRQKZfof2QQNDLAWgqqQHUaS/XhtvzGJfdYWCaCDrJoNs