第四节
免疫应答中的细胞死亡机制研究

结核病病变的主要特点是形成结核肉芽肿，其中心部位为干酪样坏死。在干酪样坏死最中心处为坏死巨噬细胞，外围包裹着巨噬细胞、上皮样巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞等。揭示结核感染导致巨噬细胞死亡的方式和机制，对于解析肉芽肿形成和制订治疗策略具有重要意义。

一、结核分枝杆菌通过Ⅰ型干扰素信号介导的巨噬细胞死亡的机制研究

作为最成功的胞内病原体， M . tb 在被巨噬细胞吞噬后长期在胞内存活、增殖，并诱导巨噬细胞死亡是导致胞内细菌释放，引起结核播散的重要原因。本研究在体外/体内分别探讨了 M . tb 感染诱导小鼠巨噬细胞死亡的机制，进而探讨了其对于结核病宿主导向治疗的作用。

（1）目的：

揭示 M . tb 感染诱导巨噬细胞死亡的新机制，为潜在的宿主导向治疗提供新的干预靶点。

（2）方法：

利用RAW264.7、HEK293T、HT-1080、L929和小鼠原代巨噬细胞株，通过慢病毒CRISPR gRNA库v1构建 Ifnar 2 ^-/- RAW264.7细胞系并分析了 M . tb 感染诱导细胞的死亡方式；在野生型C57BL/6，野生型C57BL/6N， Casp1 ^-/- ， Gsdmd ^-/- ， Stat2 ^-/- ， Casp1 ^-/- ， Casp11 ^-/- 等多种小鼠 M . tb 感染模型中分析了阻断Ⅰ型IFN信号通路对于不同基因敲除小鼠的抗结核治疗效果。

（3）结果：

① M . tb 感染BMDM不能显著诱导细胞凋亡、坏死性凋亡、细胞焦亡和自噬性细胞死亡等特性；提示 M . tb 感染小鼠巨噬细胞可能诱导其他的死亡方式；②全基因组CRISPR-Cas9筛选结果揭示了 M . tb 感染诱导RAW264.7细胞的死亡方式依赖于Ⅰ型IFN信号途径，并在BMDM中进一步得到验证，同时，结果显示与 M . tb 感染诱导野生型BMDM细胞死亡方式相比， M . tb 感染 Ifnar 1 ^-/- BMDM死亡显著延迟，但并未完全消除；③小鼠体内研究发现在结核病慢性或急性感染模型中，阻断Ⅰ型IFN信号转导均能够有效保护 M . tb 感染引起的小鼠结核病，并且阻断Ⅰ型IFN信号转导介导的细胞死亡方式可显著提升利福平（RIF）的抗结核效果。

（4）结论：

本项研究在系统性分析 M . tb 感染诱导细胞死亡方式的基础上，发现并揭示了Ⅰ型IFN信号在 M . tb 感染诱导巨噬细胞死亡中的核心作用，并在体内探讨了阻断Ⅰ型IFN信号通路下游特定节点对于抗结核治疗的作用，为靶向阻断Ⅰ型IFN信号关键节点的结核病宿主导向治疗策略提供了理论依据。

二、巨噬细胞和中性粒细胞死亡程序差异介导的抵抗结核病作用

细胞凋亡是宿主抵御胞内病原体的重要方式。前期体外研究发现 M . tb 感染可完全抑制细胞凋亡途径，在一定程度上证实了细胞凋亡在抵御结核感染中的作用。本研究在小鼠体内证实死亡受体诱导的和BCL-2调节的细胞凋亡途径可分别消除不同被感染的巨噬细胞和中性粒细胞群，并介导T细胞反应发挥抗结核免疫保护作用。

（1）目的：

系统阐释细胞凋亡途径在小鼠体内的抗结核作用及机制。

（2）方法：

在 M . tb 感染不同的细胞凋亡相关基因敲除小鼠模型中，通过流式细胞术和肺组织细胞因子定量等方法分析不同小鼠肺和脾组织中细胞亚群、细胞因子表达、细胞凋亡的变化；运用拮抗细胞凋亡抑制剂处理不同基因敲除小鼠并检测小鼠组织内细菌载荷变化。

（3）结果：

① M . tb 感染巨噬细胞通过TNF驱动Caspase-8介导细胞凋亡；小鼠体内试验证实巨噬细胞Caspase-8活性是重要的抗结核免疫因素。②Caspase-8介导的非细胞凋亡功能不发挥抗结核作用；Bax和Bak依赖的内在细胞凋亡则通过独立于Caspase-8的细胞凋亡途径发挥抗结核免疫保护作用。③相比未感染的巨噬细胞， M . tb 感染的巨噬细胞对凋亡刺激更敏感；使用拮抗细胞凋亡抑制剂（IAP）能显著增加 M . tb 感染的人、小鼠巨噬细胞的凋亡水平；在小鼠模型中使用靶向细胞凋亡途径的化合物可显著促进小鼠组织中 M . tb 的清除，并能显著改善抗结核药物的敏感性。

（4）结论：

本研究在体内研究证实 M . tb 感染不能完全抑制巨噬细胞凋亡，进而通过体内试验探讨了IAP的抗结核作用，为靶向凋亡途径的抗结核治疗和药物开发提供了理论依据。

［专家点评］

M . tb 感染介导细胞的死亡是胞内 M . tb 播散的重要原因之一。靶向调控免疫细胞死亡方式是潜在的有效的抗结核宿主导向治疗重要策略。巨噬细胞作为宿主抵御 M . tb 感染最重要的固有免疫细胞，是抗结核免疫的第一道防线。系统性发现并揭示 M . tb 感染介导巨噬细胞的死亡方式及机制，对于结核病宿主导向治疗新药开发和治疗策略的制订具有重要意义。

Carl F Nathan等首先在原代巨噬细胞中分析了 M . tb 感染诱导巨噬细胞死亡的方式，进而利用全基因组敲除技术，结合遗传学和免疫学的方法，阐明了自分泌或旁分泌Ⅰ型IFN信号通路在调控 M . tb 感染诱导巨噬细胞死亡中的关键作用机制，进而在小鼠结核感染模型中，针对性阻断Ⅰ型IFN信号通路下游关键节点，不仅具有特异性结核病宿主导向治疗效果，同时显著促进了利福平（RIF）的抗结核作用。Marc Pellegrini等利用不同的细胞凋亡相关基因敲除小鼠模型，在体内发现 M . tb 感染对于细胞凋亡的抑制作用并不完全，进而系统地证明了死亡受体诱导的和BCL-2调节的细胞凋亡途径能够通过清除特定的感染的巨噬细胞和中性粒细胞，以及诱导T细胞免疫反应来增强抗结核保护作用，并进一步在体内利用IAP治疗处理不同 M . tb 感染模型，证实了IAP能有效地促进小鼠组织中 M . tb 清除，以及改善对抗结核药物的耐药。

上述研究分别在体外和体内深入探讨了 M . tb 诱导巨噬细胞的不同的死亡方式和机制在宿主抵御结核感染中不可或缺的作用，提示靶向调控宿主免疫增强巨噬细胞增殖能力和清除胞内细菌能力，不仅有助于寻找到新的抗结核免疫治疗靶点和策略，而且对于有效改善耐药结核病治疗无药可用的严峻困境具有重要意义。

点评专家：朱传智 5pkXVi3aXbN3fEjdTo4CZNn7d8spa1ak61yrAS2PReCf1DXpTjvlu+I3u9wP2uxG