第三节
结核肉芽肿形成的免疫机制研究

肉芽肿是结核病的重要病理特征，典型的结核肉芽肿由富含 M . tb 的坏死中心、包围坏死中心的上皮样巨噬细胞和其间散布的其他类型巨噬细胞，以及随着疾病进展被招募的其他类型细胞组成。由于肉芽肿是 M . tb 与人体相互作用的主要界面，探索肉芽肿形成的免疫机制对于深入了解结核病发生发展过程以及发现新的结核病预防和治疗靶点具有重要意义。

一、非经典2型免疫反应协调结核肉芽肿的形成和上皮化

巨噬细胞相互交错产生上皮样转变，形成结核肉芽肿的典型特征。传统观念认为1型IFN-γ依赖的信号通路在肉芽肿形成过程中起主导作用，但驱动的信号和机制仍不清楚。

（1）目的：

探讨结核肉芽肿巨噬细胞上皮化和肉芽肿形成的分子机制。

（2）方法：

单细胞测序分析斑马鱼海分枝杆菌感染肉芽肿；免疫染色评估2型信号标记巨噬细胞是否与肉芽肿中上皮化有关；制备2型信号分子Stat6缺乏的斑马鱼用于功能研究；肾髓移植 c - myb 缺陷动物用以研究Stat6信号与肉芽肿形成和上皮化的关系；急性抑制肉芽肿Stat6，观察巨噬细胞上皮钙黏素。

（3）结果：

①肉芽肿单细胞RNA测序分析鉴定出20个细胞离散簇，主要是上皮化巨噬细胞，还有经典的炎症巨噬细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞；②肉芽肿中存在1型和2型信号转录本；③上皮钙黏素在肉芽肿CD68 ⁺ 巨噬细胞内被诱导表达；④坏死性肉芽肿形成和巨噬细胞上皮化需Stat6信号；⑤肉芽肿形成和上皮化依赖于造血群体Stat6信号；⑥Stat6信号可自主驱动巨噬细胞向上皮细胞转化；⑦肉芽肿Stat6急性抑制使得巨噬细胞上皮钙黏素离域，细胞表型及性质变化显著；⑧IL4R抑制导致肉芽肿缺陷。

（4）结论：

Stat6介导的2型免疫信号在肉芽肿巨噬细胞上皮化和肉芽肿形成过程中绝对必要。

二、TGF-β限制结核肉芽肿内T细胞的扩张、存活和功能

CD4 ⁺ T细胞对于宿主抗结核免疫至关重要。目前认为结核肉芽肿提供了免疫抑制环境，限制抗结核免疫，但机制尚不清楚。

（1）目的：

描绘肺部 M . tb 感染CD4 ⁺ T细胞反应的空间分布，鉴定局部T细胞抑制的重要分子和途径。

（2）方法：

气溶胶感染小鼠，肺组织切片抗体染色观察T细胞活化相对于 M . tb 感染细胞的位置；肺、脾组织匀浆CFU计数；转录组分析和基因集富集分析（GSEA）鉴定影响T细胞功能的潜在抑制介质；使用dLck-cre TGF-βR2 ^{f / f} 小鼠测试TGF-β是否参与抑制T细胞和肉芽肿内免疫、如何改变效应T细胞功能；采用混合骨髓嵌合小鼠、过继转移模型研究TGFβ对CD4 ⁺ T细胞增殖、分化和存活的作用。

（3）结果：

①T细胞在肉芽肿内及其周围密度较大，空间上与感染细胞分离，肉芽肿内CD4 ⁺ T细胞IFN-γ产生减少；②肉芽肿内 M . tb 特异性T细胞与肺远端T细胞相比IFN-γ产生减少，提示受肉芽肿微环境局部限制；③肺 M . tb 特异性T细胞IL-2、缺氧和糖酵解通路上调，TGF-β信号下游靶基因富集，下游磷酸化SMAD3检测证实肉芽肿免疫细胞历经局部TGF-β信号调节；④CD4 ⁺ T细胞TGF-β信号限制终末分化，促进细胞死亡，抑制 M . tb 控制；⑤TGF-β作用于CD4 ⁺ T细胞调节Th1细胞分化和功能；⑥ M . tb 特异性TCR转基因T细胞存在内在抑制。

（4）结论：

TGF-β在限制结核肉芽肿内T细胞的增殖、存活和功能方面发挥了关键作用。

三、结节病肉芽肿发生过程中吞噬体调控的mTOR信号

结节病与结核肉芽肿病理特征不同。有研究提示mTORc1激活与结节病有关，但其调节机制及在肉芽肿形成中的功能尚不清楚。

（1）目的：

分析结节病和结核潜伏感染者体外肉芽肿模型分子特征，对相关分子和通路进行实验验证，为结节病发病机制提供新思路。

（2）方法：

分离外周血单个核细胞（PBMC），与 M . tb 抗原共培养建立体外肉芽肿模型；培养上清液进行细胞因子检测；对肉芽肿样细胞聚集体进行基因差异表达分析和通路分析；收集结节病和对照患者淋巴结样本，进行基因表达和IPA网络分析；肉芽肿形成和相关免疫介质研究采用缺乏或存在各种已知作用的预处理进行。

（3）结果：

①结节病与结核潜伏感染者体外肉芽肿差异表达基因超过5000个；②结节病吞噬溶酶体通路激活增强，相关高表达基因在结节病纵隔淋巴结组织中得到验证；③PPD处理结节病PBMC后， p -mTORc1、 p -S6、 p -STAT3表达显著升高；④抑制mTORc1、细胞内酸化或吞噬溶酶体形成显著影响结节病PBMC暴露于PPD后的肉芽肿形成，同时影响一些细胞因子释放，提示结节病肉芽肿形成和炎症介质释放依赖于吞噬溶酶体组装、酸化及mTORc1/S6/STAT3信号。

（4）结论：

结节病肉芽肿表现出增强和持续的细胞内抗原加工和提呈能力，需要吞噬溶酶体的组装和酸化支持mTORc1信号进而促进结节病肉芽肿的形成。

四、综合应激反应介导小鼠结核分枝杆菌肉芽肿的坏死

感染 M . tb 后只有部分人发展为坏死性肉芽肿并伴有进行性疾病，而其他人则形成控制性肉芽肿，其原因尚不明确。综合应激反应（integrated stress response ISR）标识在结核肉芽肿靠近坏死中心的细胞层中明显上调。

（1）目的：

探索结核肉芽肿坏死的分子机制。

（2）方法：

C3HeB/FeJ小鼠 sst1 ^s 等位基因（可控制肺结核肉芽肿坏死）转入B6（C57BL/6J）小鼠，获得B6.Sst1 ^S 小鼠；分离培养骨髓源巨噬细胞BMDM；通过小鼠 M . tb 感染、肺脾CFU计数、病理切片染色及影像学检测，测定肺部疾病负担；制备抗体确定Ipr1蛋白水平；Hoechst/PI染色测定细胞活力；siRNA敲低基因表达；用试剂盒测定转录因子、IFN-β水平。

（3）结果：

①TNF可触发B6.Sst1 ^S 巨噬细胞IFN-I的过度活跃和应激通路；②延长的TNF刺激诱导B6.Sst1 ^S 巨噬细胞ISR和蛋白组重塑双向进展；③依赖双链RNA的蛋白激酶（double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR）是触发B6.Sst1 ^S 巨噬细胞晚期ISR的必要条件；④TNF诱导的蛋白质组变化表明，野生型B6巨噬细胞中Ipr1上调在时间上与不断升级的应激反应保护相关；⑤ISR小分子抑制剂可降低小鼠对 M . tb 和体内肉芽肿坏死的易感性；⑥蛋白毒性应激（PS）以不依赖TBK1的方式驱动IFN-β的超诱导；⑦PS诱导B6.Sst1 ^S 细胞中的蛋白质聚集，其可被翻译抑制剂所补救。

（4）结论：

sst1 ^S 巨噬细胞中Ⅰ型IFN通路驱动的ISR诱导和应激升级的锁定状态在结核肉芽肿坏死进展中起因果作用。

五、人类结核肉芽肿综合转录组分析及应用仿生模型确定治疗靶点

结核病宿主导向治疗（host-directed therapy，HDT）旨在通过增强免疫反应改善结核病的临床结局。从结核肉芽肿角度出发是解析致病机制和鉴定治疗靶点的一个重要方向。

（1）目的：

通过淋巴结肉芽肿转录组学分析剖析结核病发生机制，利用仿生肉芽肿模型鉴定新的HDT靶点。

（2）方法：

收集未经治疗的淋巴结结核病和结节病样本，通过激光捕获显微解剖获取淋巴结肉芽肿，对照淋巴结取等效表面积样本，进行RNAseq分析；利用人PBMC细胞建立肉芽肿模型，将细胞培养物进行RNAseq分析；测定细胞内pH、细胞毒性、细胞因子和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）浓度等。

（3）结果：

①RNAseq分析显示，对照样本清晰聚簇，结核病和结节病样本之间存在高度重叠，相比结节病，结核病上调最显著的是细胞因子信号通路；②结核病特有簇主要与炎症和细胞外基质有关；③3D胶原肉芽肿模型最接近临床结核样本的基因表达；④筛选的12个HDT靶点中有7个仅在结核病组，5个为结核病和结节病共有靶点；⑤鞘氨醇激酶1（SphK1）抑制剂可抑制肉芽肿模型中 M . tb 生长，且无明显细胞毒性；⑥SphK1阻断可调节细胞内酸化和炎症介质分泌。

（4）结论：

本研究通过肉芽肿转录组分析获得一批结核病潜在治疗靶点，其中SphK1抑制剂能抑制肉芽肿模型中 M . tb 生长，有潜力用于改善结核病化疗。

［专家点评］

肉芽肿是结核病病原体与宿主相互作用的主要界面，探讨肉芽肿形成的机制对于理解结核病的发生发展过程以及开发新的结核病防治靶点具有重要意义。Cronan M R等发现2型免疫信号与巨噬细胞上皮化有关，其中Stat6介导的2型免疫信号在巨噬细胞上皮化和肉芽肿形成中绝对必要。其他模型（尤其是人类肺结核）不同感染阶段2型免疫信号通路对肉芽肿形成的影响如何还需后续进一步阐明。Gern B H等发现肉芽肿内 M . tb 特异性CD4 ⁺ T细胞产生IFN-γ明显降低，提示局限性免疫抑制的发生，进而发现TGF-β在限制结核肉芽肿内T细胞的增殖、存活和功能方面发挥了关键作用，是一种重要的免疫调节因子。该研究揭示了 M . tb 感染免疫抑制的新机制，为宿主导向治疗提供了潜在靶点，而TGF-β阻断的治疗作用还需进一步综合评估。Crouser E D等发现，结节病与结核潜伏感染者体外肉芽肿模型中有大量的差异表达基因，结节病肉芽肿表现出增强和持续的细胞内抗原加工和提呈能力，由吞噬溶酶体依赖的信号通路mTORc1和STAT3调控肉芽肿的形成。Bhattacharya B等发现TNF可触发巨噬细胞IFN-I过度活跃和应激通路，依赖双链RNA的蛋白激酶（PKR）是触发巨噬细胞综合应激反应（ISR）的必要条件，而小分子ISR抑制剂可阻断 M . tb 感染小鼠肺肉芽肿坏死的发展，同时降低菌负荷，提示利用ISR抑制剂阻断异常的应激反应有可能为宿主导向治疗提供新策略。Reichmann M T等通过淋巴结肉芽肿转录组分析发现结核病和结节病存在共有和差异通路，发现SphK1抑制剂能抑制 M . tb 生长，同时降低感染细胞内pH值并抑制炎症介质的分泌，提示SphK1有潜力作为改善结核病结局的治疗靶点。肺部肉芽肿是否与淋巴结肉芽肿结果一致、仿生模型结果是否能在体内得到验证、SphK1抑制对结核病免疫病理的全面影响等还需进一步评估。

总之，上述研究在结核肉芽肿巨噬细胞上皮化机制、免疫抑制调控、肉芽肿坏死机制、结核病和结节病肉芽肿基因表达和信号调控差异等方面展示了最新研究成果，相关研究拓展了我们对结核肉芽肿的认识，也为结核病致病机制及宿主导向治疗研究开启了新的视角。

点评专家：李自慧 Qx5EBdItSz/kDnwccp8La8Gg2Jxvppy8FYPtcUdi6aNUwj/KO1OkRdCDfO1zVE2n