第一节
结核分枝杆菌感染合并其他感染的免疫学机制研究

M . tb 感染合并其他感染在临床上有一定占比，以TB/HIV共感染最为常见。解析 M . tb 和其他病毒、细菌共感染的发生发展机制，能够为研发新的治疗方案、解决共感染人群的治疗困境，提供理论依据。

一、HIV感染者肺泡巨噬细胞中对抗结核分枝杆菌感染的表观遗传调控受损

M . tb 感染是HIV感染者最常见的机会性感染之一，HIV感染者感染 M . tb 及发展为活动性结核病的风险更高，HIV/TB患者的病死率较普通TB患者高2倍，因此重视HIV感染者结核感染和结核病发病的机制，对于控制HIV感染者结核感染和结核病发病具有重要意义。

（1）目的：

解析接受抗逆转录病毒治疗（antiretroviral therapy，ART）的HIV/TB患者（PLWH）和预防性抗病毒治疗患者（PrEP）以及健康人肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage，AM）与 M . tb 互作过程中的转录组和表观遗传图谱。

（2）方法：

M . tb 体外刺激分离获得的PLWH、PrEP和健康人支气管灌洗液中的AM，完成转录组测序、染色质开放测序和染色质免疫共沉淀测序，并进行生物信息学分析。

（3）结果：

PLWH和PrEP来源的AM应对 M . tb 感染的转录图谱明显减弱，表现为差异基因数量减少，基因差异倍数降低，表明PLWH和PrEP存在普遍的转录受损；而且 M . tb 感染无法诱导PLWH和PrEP来源的AM发生染色质重塑。但PLWH和PrEP与健康人之间的转录和表观遗传差异并非由患者生理或病理因素造成。 M . tb 刺激健康人AM能够导致多个IFN类转录因子聚集于染色质开放区域，且多聚集在IFN和TNF信号通路基因的转录起始点，但PLWH和PrEP中该类转录因子在 M . tb 刺激前后的表达差异较小。进一步分析了健康人AM内受IRF9转录因子调控的135个基因，其中65个基因在 M . tb 刺激后表现差异表达。但PLWH和PrEP来源的AM内这65个基因的表达差异下降。

（4）结论：

M . tb 刺激健康人AM可引发表观遗传变化，促进重要转录因子在IFN和TNF信号通路基因的结合并促进基因转录；而PLWH和PrEP来源的AM中染色质关闭在一定程度上导致 M . tb 刺激后的整体转录水平下降。

二、早期固有免疫和适应性免疫受限导致病毒与结核分枝杆菌共感染的严重后果

现有研究提示病毒感染可引发宿主体内各类促炎因子和抑炎因子的表达异常以及细胞免疫应答改变等，导致 M . tb 感染或加剧结核病严重程度。但其中的机制如何，尚需要深入研究。

（1）目的：

解析慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）感染后发生 M . tb 共感染和发病的免疫机制。

（2）方法：

在感染LCMV-C113病毒后21天，给予 M . tb 感染，同时设立单独 M . tb 感染对照组。通过分析小鼠表征、肺/脾菌载量、免疫细胞亚群变化、细胞因子释放、生存情况等，解析共感染状态下加剧感染结局的机制。

（3）结果：

通过建立共感染小鼠模型，发现慢性LCMV感染削弱了宿主对 M . tb 的控制并导致小鼠死亡率升高。进一步采用cyTOF技术分析肺组织细胞亚群，发现LCMV感染重塑了小鼠肺部免疫微环境，影响了细胞活化和抗原提呈细胞状态，主要表现为慢性LCMV感染导致CD11b ⁺ DC细胞和 M . tb 向淋巴结转运被延误（非抑制）、 M . tb 特异的CD4 ⁺ T细胞增殖受限。此外，作者发现LCMV感染状态下， M . tb 特异的CD4 ⁺ T细胞倾向于Th17分化，进而诱导中性粒细胞募集，加剧小鼠死亡。并且，LCMV诱导产生的TNF-α能够抑制 M . tb 感染早期DC介导的 M . tb 内吞和向淋巴结的转移，以及CD4 ⁺ T细胞功能。短暂纠正 M . tb 特异的T细胞免疫应答会抑制Th17应答并增强宿主对 M . tb 感染的控制。

（4）结论：

本研究建立了LCMV和 M . tb 共感染小鼠模型，并证明LCMV感染导致宿主免疫状态改变能够延误 M . tb 特异的CD4 ⁺ T细胞增殖和活化，导致T细胞功能障碍并加重共感染结局。

三、CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞：TB/HIV合并感染中鉴定获得的一组新型细胞亚群

TB/HIV共感染是严重威胁人类健康的重要公共卫生问题，两种病原相互配合加速对宿主免疫系统的攻击，但参与其中的免疫细胞亚群类别和具体作用机制并不明确。

（1）目的：

解析TB/HIV患者的免疫细胞亚群和免疫功能变化。

（2）方法：

应用CyTOF技术深入分析TB/HIV患者、TB患者、HIV患者、健康人外周血单个核细胞（PBMC）中免疫细胞亚群种类和比例，寻找TB/HIV患者特有的免疫细胞亚群。

（3）结果：

CyTOF技术分析4类人群PBMC中的细胞亚群，发现CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞在各类患者中的比例显著低于健康人，但在TB/HIV共感染患者中的比例高于TB患者和HIV患者。对CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞功能相关的基因进行聚类，发现4类相关基因：细胞分化抗原、共刺激因子、抑制因子、转录因子。进一步分析了不同人群中各类细胞占比，发现CD45RA、CXCR5、CCR6、CD54、MHC-Ⅱ、HLA-DR、BTLA在CD19 ⁺ 细胞表面高表达。但是，CXCR5、BTLA、CD45RA、CCR6和CD54在HIV患者CD19 ⁺ 细胞表面表达量较低；CCR6、CD45RA、CD54在TB/HIV患者CD19 ⁺ 细胞表面的表达量较高；HLA-DR、CD45RA、CCR6和CD54在TB患者CD19 ⁺ 细胞表面表达量略有增高，CXCR5、BTLA在TB患者CD19 ⁺ 细胞表面表达量显著升高。CCR7、CD62L、CD27、CD28、IL7R、ICOS、Tim3在CD3 ⁺ 细胞表面表达量较高，其中CCR7、CD62L、CD27、CD28和Tim3在TB患者组表达量较高。与健康人相比，CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞在TB患者、TB/HIV患者中的比例都较低，但在不同患者组间的差异较小。CCR5和CXCR3在健康人的CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞表面高表达，但在HIV患者的CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞表面低表达。CCR5和CXCR3在TB/HIV患者CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞表面的表达量高于其他两组患者，但低于健康人。抑制性因子PD1和TIGIT在TB/HIV患者CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞表面高表达，提示对适应性免疫的抑制作用。转录因子T-bet在TB/HIV患者组中高表达，验证了 M . tb 抗原刺激后T-bet高表达的既往研究结果。

（4）结论：

本研究发现TB/HIV患者中表达CCR5和CXCR3的CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞数量明显减少，但表达抑制性受体PD1、TIGIT的CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞数量相对增多。提示深入研究CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞功能可能解析TB/HIV发生发展的机制。

四、海藻糖通过逆转HIV对细胞自噬的封闭来限制宿主体内分枝杆菌生存

HIV对宿主天然应答中的细胞自噬具有抑制作用，但是病毒感染导致的自噬改变对于其他细菌感染是否有不良影响，目前尚未阐明。海藻糖被证明具有诱导自噬的作用，但是否以及如何诱导自噬的机制目前也不清楚。

（1）目的：

本研究以HIV合并分枝杆菌感染模型来探讨海藻糖对HIV介导的细胞自噬改变的影响和具体机制。

（2）方法：

本研究以单核巨噬细胞U937和U1.1（整合HIV-1）作为研究对象，分别给予HIV-1和分枝杆菌感染，建立共感染模型，并分析基因功能和细胞表型，以确定HIV导致的细胞自噬改变对分枝杆菌感染的影响，同时分析海藻糖对这一影响的逆转作用。

（3）结果：

研究发现HIV复制可以损伤细胞自噬，促进 M . tb 和非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）在巨噬细胞内的存活，而且HIV对细菌胞内存活的作用主要由 Nef 基因介导。进一步研究发现HIV感染能够抑制细胞异源吞噬。另一方面，研究发现海藻糖可以通过PIKFYVE-MCOLN1通路调控诱导细胞自噬和异源吞噬，抑制胞内细菌增殖，这一作用在原代细胞中也得到证实。但是，不同于巨噬细胞中的结果，活化的PBMC或者CD4 ⁺ T细胞中并未检测HIV对细胞自噬流的影响。海藻糖可以诱导感染或未感染HIV的CD4 ⁺ T细胞中的自噬，而在PBMC中，海藻糖只能在HIV-1感染细胞中诱导自噬。而且在从HIV感染者中分离的PBMC中，也能够观察到海藻糖诱导自噬的现象。最后，在小鼠感染模型中确认了海藻糖限制 M . tb 增殖的作用。

（4）结论：

本研究确认了HIV可以抑制细胞自噬导致其他机会性感染，而海藻糖能够逆转HIV引发的细胞自噬封闭，实现对分枝杆菌共感染的控制。

［专家点评］

慢性病毒感染后的 M . tb 合并感染是传染病领域常见且需要关注的重要问题之一。解析共感染状态下 M . tb 感染结局加重的机制，是开发新的治疗方案以解决这类共感染人群治疗困境的基础。

对这一特殊人群进行免疫状态分析，可能发现参与TB/HIV共感染及发病的重要免疫细胞亚群。国内卢洪洲教授团队率先应用CyTOF技术在外周血PBMC中发现了一组新的细胞亚群，即CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞，在TB患者、HIV患者以及共感染患者中的比例显著低于健康人，但在共感染患者中的占比高于TB患者和HIV患者，提示这群细胞可能在TB/HIV共感染及发病中发挥重要作用。虽然并未对CD3 ⁺ CD19 ⁺ 细胞功能进行深入研究，但基本揭示了各类淋巴细胞亚群在TB、HIV、TB/HIV人群中的分布情况和重要的蛋白表达情况，未来针对这一亚群进行功能和机制的深入探讨，可能有助于寻找新靶点用于改善这类人群的治疗方案。

HIV/TB共感染的机制并不完全清楚，特别是HIV是否以及如何影响其他感染的发生发展并未阐明。Sharma等从细胞自噬入手，发现HIV感染能够抑制细胞自噬以帮助 M . tb 和NTM实现免疫逃逸。同时，发现海藻糖能够抑制HIV复制，进而深入发现海藻糖能够逆转HIV感染带来的自噬封闭，以控制细胞内或小鼠体内的 M . tb 或NTM增殖，而且进一步机制研究发现这一逆转过程主要是通过PIKFYVE-MCOLN1通路介导的。海藻糖抑制HIV复制、逆转细胞自噬、控制 M . tb 和NTM增殖的研究结果，为临床以海藻糖作为治疗手段提供了理论依据，同时也给临床提供一种潜在的治疗HIV、HIV/TB、HIV/NTM合并感染状态的治疗选择，有可能与现有的抗逆转录病毒配合使用，提升共感染的有效治愈率。当然，由于本研究主要在体外细胞水平完成，仅在小鼠体内进行了菌载量控制的验证，因此对于海藻糖在HIV/TB患者中的治疗效果、使用剂量及不良反应等都缺乏相应的数据，尚需要进一步的动物实验和设计严谨的临床试验来验证真正的临床应用效果。

过去对于HIV/TB共感染和加重的机制研究，大多关注HIV对宿主免疫系统的破坏，而很少关注抗逆转录病毒治疗在共感染中的作用。既往研究已经提示在病毒感染后进行免疫重建的HIV感染者中，处于 M . tb 高暴露风险的患者通常表现出免疫应答受阻，但具体机制如何，尚不清楚。Barreiro和Schurr团队从HIV/TB共感染人群出发，阐明了HIV感染或者ART对 M . tb 的吞噬并无显著影响。ART，而非HIV感染，是PLWH和PrEP AM内抗结核感染相关的基因表观遗传程度下降和转录水平下降的主要原因。在这项研究中纳入了一组PrEP，来排除HIV感染对AM内基因转录水平的影响。如果能够加入一组HIV感染但未接受ART的患者，可能能够更好地阐明HIV和ART在宿主对抗 M . tb 感染中的作用。

除了合并HIV感染之外，合并其他病毒感染也会引起更高比例的 M . tb 共感染及感染结局加重。Brooks团队以小鼠作为模型，模拟LCMV合并 M . tb 共感染，并深入分析了LCMV感染导致的宿主免疫状态改变给后续 M . tb 共感染带来的影响和其中的机制。主要发现LCMV感染能够引发TNF-α高表达，限制了宿主DC对 M . tb 的内吞，阻止了 M . tb 由肺部向纵隔淋巴结转移，因此有效抑制了免疫浸润，限制了CD4 ⁺ T细胞增殖和活化，为 M . tb 增殖提供了良好的免疫微环境；同时，LCMV感染促使T细胞向Th17亚群分化，释放更多的IL-17，造成Th1/Th17比例失调和细胞因子平衡失调，造成更严重的炎症浸润，加重感染结局。过去对于共感染状态下CD4 ⁺ T细胞功能的机制解析并不清楚，本研究结果提示慢性病毒感染造成的CD4 ⁺ T细胞功能障碍是造成 M . tb 共感染结局加重的重要原因，短暂给予CD4 ⁺ T细胞功能纠正，能够逆转感染结局，提示在病毒感染早期人为诱导CD4 ⁺ T细胞免疫应答或抑制TNF-α表达量可能能够有效控制 M . tb 感染。本研究以传统的C57BL/6小鼠作为模型，由于无法形成潜伏感染或肉芽肿，因此与人类结核病发生发展还是有所不同，应该在其他特征的小鼠模型中广泛验证，方能确定慢性病毒感染对 M . tb 共感染结局的影响。

点评专家：潘丽萍 QaIQCRmOEh15Rag85I75X3HJJ7w+7z13KinozUzZp/YJZzu47c2JEmhd2uaeA4UG