第六节
抗结核新药靶标的研究

一、多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏在体外和感染期间杀死结核分枝杆菌

人类病原体 M . tb 依赖宿主的脂肪酸作为碳源。然而，脂肪酸β-氧化是由冗余酶介导的，这阻碍了针对这一途径的抗结核药物的开发。

（1）目的：

阐明 M . tb rv0338c 基因的功能。

（2）方法：

构建突变株ΔetfD和ΔetfBA，用全基因组测序分析基因同源性，代谢组学分析突变株，并进行PhoA融合分析和免疫沉淀反应。在指定时间做感染雌性C57BL/6小鼠肺和脾的菌落计数。检测细胞裂解液中的酰基辅酶A氧化酶活性，并采用Eggnog62进行同源聚类组织分析。

（3）结果：

发现 rv0338c （etfD）编码了一种膜氧化还原酶，该酶对 M . tb 的β-氧化至关重要。长链脂肪酸具有杀菌作用，etfD缺失突变体不能在脂肪酸或胆固醇上生长，不能在小鼠体内生长和存活。多酰基辅酶A脱氢酶（ACAD）催化的β-氧化过程受阻，而在其他生物中，ACAD在功能上依赖于电子转移黄素蛋白（ETF）及其同源氧化还原酶。EtfD与FixA（EtfB）相互作用，FixA是一种与人ETF亚基β同源的蛋白，与fixB编码在一个操纵子中，编码了人ETF亚基α的同源物。

（4）结论：

EtfBA和EtfD（与人的EtfD不同源）在 M . tb 中分别为电子转移黄素蛋白β-氧化还原酶，是结核病药物开发的潜在靶点。

二、结核分枝杆菌Phe-tRNA合成酶——tRNA识别和氨基酰化的结构见解

耐多药菌株的全球传播是一种公共卫生威胁，需要新的治疗方法。氨酰-RNA合成酶可能是潜在的、可信的药物靶点候选者。

（1）目的：

揭示 M . tb Phe-tRNA合成酶——tRNA识别和氨基酰化的结构。

（2）方法：

克隆与表达了 M . tb FRS的两个亚基——PheS和PheT，合成了全长未修饰的 M . tb tRNAPhe转录本等。获得MtFRSt/F1、MtFRSt/F2，MtFRSt/F-AMS1和MtFRSt/F-AMS2复合物的结晶。用X射线衍射实验分析它们的结构，用配体结合实验研究它们之间的相互作用，分析MtFRS的功能。

（3）结果：

M . tb Phe-tRNA合成酶与未修饰tRNA Phe转录本以及L-苯丙氨酸或不可水解的苯丙氨酸腺苷酸类似物形成复合物结构。高分辨率模型揭示了tRNA与酶相互作用的两种模式：通过间接读出反密码子茎环的初始识别和涉及tRNA ^Phe 的3＇端与腺苷酸位点的相互作用的氨基酰化状态。

（4）结论：

在tRNA与酶结合的不同阶段，氨基酸腺苷酸结合位点和编辑位点的形貌为抗结核药物的合理设计提供了依据。

三、（2R，3S）-2-羟基-3-（硝基甲基）琥珀酸对结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶1的基于机制的灭活

该研究合成了（2R，3S）-2-羟基-3-（硝基甲基）琥珀酸［（2R，3S）-2-hydroxy-3-（nitromethyl）succinic acid，简写为5-NIC］，并探讨了其对 M . tb 异柠檬酸裂合酶1（ICL1）的基于机制的灭活。

（1）目的：

合成5-NIC并探讨其对 M . tb ICL1的灭活机制。

（2）方法：

使用酶动力学、质谱和 X 射线晶体学方法确定5-NIC衍生的3-硝基丙酸（3-NP）与ICL1的Cys191硫醇盐的反应机制及影响。

（3）结果：

5-NIC在ICL1的催化下发生明显的反醛醇裂解反应，生成乙醛酸和3-NP，后者是ICL1的共价灭活剂。发现随着反应体系中5-NIC浓度的增加，ICL1活性呈现出时间依赖性的灭活。5-NIC是一种稳健且有效的基于机制的ICL1灭活剂，5-NIC衍生的3-NP与ICL1的Cys191硫醇盐的反应可诱导ICL1-硫代异羟肟酸盐加合物的形成，最终导致了 M . tb ICL1的失活。

（4）结论：

制备了化合物5-NIC，其机制主要依赖于反醛醇裂解在其活性位点产生3-NP，随后与Cys191硫醇盐反应以共价修饰ICL1，导致ICL1失活。

［专家点评］

近年来，随着组学技术和生物信息学技术的飞速发展，诸多结核新药物靶点被人们发现。最近的研究发现etfD编码的氧化还原酶对 M . tb 的β-氧化至关重要，EtfD 对 M . tb 在宿主体内长期持留具有重要的作用，该研究为研发新一代抗结核药提供了新靶标。此外，还有研究发现aaRS在 M . tb 蛋白合成方面发挥着重要的作用，该研究提供了迄今为止FRS-tRNA ^Phe 复合物的最完整的图像，为设计基于FRS-tRNA ^Phe 复合物结构的 M . tb FRS抑制剂的药物提供了新见解。乙醛酸循环途径在人和其他高等动物中普遍缺乏，这就为通过灭活或抑制ICL来治疗结核病提供了新思路。受到这一原理的启发，M.Mellott等制备了化合物5-NIC，该化合物实际上是乙醇酸盐和3-NP的复合物。5-NIC衍生的3-NP通过Cys191硫醇盐反应以共价修饰ICL1，诱导ICL1-硫代异羟肟酸盐加合物的形成，介导了 M . tb ICL1的失活。

因此，深入研究 M . tb 细胞壁合成、蛋白质合成和能量代谢过程中关键化合物，筛选潜在的药物治疗新靶点对结核病及耐药结核病的治疗具有关键性的作用。总之，上述三项研究从 M . tb 能量代谢出发，系统地解析了EtfD、aaRS和5-NIC在 M . tb 能量代谢中的作用，为研发对抗 M . tb 的潜在新药物靶标奠定了基础。

专家点评：龚文平 Qx5EBdItSz/kDnwccp8La8Gg2Jxvppy8FYPtcUdi6aNUwj/KO1OkRdCDfO1zVE2n