第五节
结核分枝杆菌致病机制的研究

一、表观遗传阅读器含溴域蛋白4通过共同调节宿主脂肪吞噬和血管生成来支持分枝杆菌发病机制

表观遗传阅读器含溴域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）以其在几种病毒感染和感染性休克的情况下介导核因子kappa B（NF-κB）驱动的炎症反应的能力而闻名。由于分枝杆菌能够拦截较多的宿主免疫途径，包括NF-κB介导的事件，人们认为EGFRBRD4轴可能有助于额外的免疫串扰。本研究探讨了EGFR-BRD4轴在分枝杆菌感染期间的作用和机制。

（1）目的：

阐明EGFR-BRD4轴在 M . tb 感染期间通过巨自噬/自噬调节转换的潜在机制。

（2）方法：

在 M . tb 感染治疗模型上采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、病理分析、免疫组化、免疫印迹等方法来研究EGFR-BRD4轴在小鼠结核病发病过程中的作用，采用共聚焦显微分析阐明EGFR-BRD4轴在 M . tb 诱导的脂质积累和自噬过程中的作用和机制，通过qRT-PCR和免疫印迹等方法探讨了 M . tb 依赖的KLF5协助BRD4介导的血管生成标志物调控。

（3）结果：

M . tb 利用表皮生长因子受体（EGFR）信号转导来诱导组蛋白乙酰化阅读器BRD4的表达。EGFR-BRD4轴抑制脂质特异性自噬，因此有利于细胞脂质积累。Egfr或Brd4的药理学抑制或敲低可增强自噬通量并同时降低细胞脂滴（lipid droplet，LD），EGFR或BRD4功能的丧失限制了通过外部补充油酸来挽救的分枝杆菌负荷，EGFR-BRD4轴通过调节促血管生成基因表达并因此在分枝杆菌感染期间使异常血管生成发挥额外作用。

（4）结论：

EGFR和BRD4的药理学抑制通过增强的脂肪吞噬作用损害LD的积累并使血管生成正常化，从而限制 M . tb 负载并将减少小鼠的病理损伤。

二、结核分枝杆菌的氧化还原稳态受一种新的放线菌特异性转录因子调节

宿主源的压力及宿主的酸性条件、饥饿和缺氧条件都有助于抑制细菌的增殖和生存，但 M . tb 也演化出了自己抵抗这些不利因素的一系列武器。本研究对 M . tb 氧化还原稳态进行了研究，旨在为阐释 M . tb 面对不利因素时的潜在应对机制提供新见解。

（1）目的：

探讨 M . tb 应对宿主体内免疫系统对其造成多重压力的机制。

（2）方法：

通过基因替换产生突变体并用免疫印迹法进行确认，采用菌落形成单位评估基因缺失对 M . tb 体外生长的影响。在此基础上构建巨噬细胞感染的小鼠模型，进一步筛选出phox突变小鼠并分析AosR在小鼠模型上的作用。采用转录组学技术、免疫印迹、生物信息学技术等解析AosR应对氧化应激的调控机制。

（3）结果：

发现AosR在放线菌中非常保守，具有迄今为止未表征的功能。AosR 减轻吞噬细胞衍生的氧化和亚硝化应激，从而促进分枝杆菌在鼠肺和脾脏中的生长。氧化应激诱导AosR中单个亚基内二硫键的形成，这反过来又促进了 AosR与胞质外功能sigma因子SigH的相互作用。这导致通过辅助基因内应激反应启动子特异性上调CysM依赖性非经典半胱氨酸生物合成途径，该启动子对解毒宿主衍生的氧化和亚硝化自由基至关重要。在氧化还原应激期间未能上调依赖 AosR的半胱氨酸生物合成会导致6%的 M . tb 基因的差异表达。

（4）结论：

AosR-SigH途径对于解毒宿主衍生的氧化和亚硝化自由基以提高 M . tb 在恶劣的细胞内环境中的存活率至关重要。

三、氧化损伤和延迟复制使活的结核分枝杆菌无法被发现

M . tb 潜伏感染已经成为了阻碍结核病防治的一大障碍。本研究讨论了 M . tb 潜伏感染状态下的可能机制，为结核感染的防控提供了新见解。

（1）目的：

探讨 M . tb “差异可检测”（DD）状态的生物学机制及其对结核病防治的影响。

（2）方法：

应用遗传和生化方法来定义 M . tb DD状态形成的关键过程。

（3）结果：

M . tb 可以进入与表型抗生素耐药性相关的DD状态，在这种状态下， M . tb 是有活力的，但无法用集落形成单位法检测到。 M . tb 在受到亚致死氧化应激损伤其DNA、蛋白质和脂质时进入DD状态。此外，它们的复制过程被延迟，从而有时间进行修复。牛分枝杆菌及其减毒株BCG在类似条件下无法进入DD状态。

（4）结论：

当满足两个条件时， M . tb 就会出现DD状态：① M . tb 细胞经历中等程度的氧化损伤，从而改变其生长表型；②延迟复制可以恢复复制能力。这些发现对结核潜伏期检测、复发、治疗监测以及克服表型抗生素耐药性的方案的研究具有重要意义。

［专家点评］

近期， M . tb 致病机制的研究取得一些进展。研究表明 M . tb 利用EGFR信号通路诱导组蛋白乙酰化阅读器BRD4的表达，抑制脂质特异性自噬，调节促血管生成基因表达，对于 M . tb 的系统性传播以及抗结核药物对结核肉芽肿中富含 M . tb 的核心的有效输送非常重要；研究对宿主内 M . tb 生存至关重要的转录因子，分析鉴定出一个单一的转录因子Rv1332（AosR）在放线菌中保守，减轻吞噬细胞来源的氧化和硝化应激，从而促进分枝杆菌在的生长；研究也表明 M . tb 可进入与表型抗生素耐药性相关的“差异可检测”状态，在这种状态下， M . tb 细胞可以存活，但不能作为集落形成单位被检测出来。这些发现对结核病潜伏期、检测、复发、治疗监测和克服表型抗微生物药物耐药性的方案的制订具有意义。总之，以上发现使科研人员对 M . tb 的致病机制有了进一步的理解，为结核病预防、诊断和治疗等奠定了理论基础。

点评专家：张俊仙 5sCOaNCoiso7QsSH70zxm/2yfIxyVk+HjYW7lEjLtOVXbfYs33cJNdiOquL2ECVa