第三节
结核分枝杆菌毒素的研究

一、DarT对DNA碱基进行ADP-核糖基化的分子基础

ADP-核糖基转移酶催化底物ADP-核糖基化来调节细胞通路或参与毒素介导的细菌致病性。可逆性的ADP-核糖基化被认为是一种蛋白特异性修饰，但最近的体外研究表明核酸也是其作用靶标。DarT是一种细菌DNA ADP-核糖基转移酶毒素，属于DarT-DarG毒素-抗毒素系统，催化特异性DNA序列ADP-核糖基化。

（1）目的：

解析DarT的分子结构和功能，阐明DarT促使DNA ADP-核糖基化的分子机制。

（2）方法：

首先将DarT蛋白、寡核苷酸和β-NAD ⁺ 在ADP-核糖化缓冲液中孵育，利用等温滴定量热法、薄层色谱法、磁共振等技术观察DarT与NAD ⁺ 反应前后的结构，分析DarT催化ADP-核糖与寡核苷酸结合过程。随后利用免疫沉淀、RT-PCR技术分析DarT在 M . tb 内催化gDNA发生ADP-核糖化的机制。

（3）结果

1）DNA胸苷碱基的特异性、可逆性ADP-核糖基化是通过胞内DarT-DarG系统进行的。

2）DarT与NAD ⁺ 结合催化DNA发生ADP-核糖基化，而DarG可逆转这一修饰过程。

3）当通过敲低来抑制DarG促使DarT活性处于相对激活状态时会诱发 M . tb 生长停滞，而当同时敲低DarT和DarG或通过转座子插入突变干扰DarT的活性时， M . tb 则出现增强的生长优势。

（4）结论：

DarT-DarG通过控制DNA ADP-核糖基化来调控 M . tb 生长。

二、成孔蛋白Esx介导结核分枝杆菌毒素的分泌

结核坏死毒素（TNT）是 M . tb 唯一已知的外毒素，也是外膜蛋白CpnT的C端毒素结构域。CpnT由 M . tb 在感染的巨噬细胞内产生，被分泌到巨噬细胞细胞质中诱导巨噬细胞死亡。然而TNT分泌的分子机制仍不清楚。许多小Esx蛋白与 M . tb Ⅶ型分泌系统相关，且 EsxE 和 EsxF 基因位于 CpnT 基因的操纵子上，因此推测EsxE和EsxF可能参与TNT的分泌过程。

（1）目的：

探究EsxE和EsxF在TNT分泌过程中的作用，揭示 M . tb 分泌TNT的机制。

（2）方法：

首先构建表达EsxE、EsxF的 M . tb 菌株和突变菌株，通过高速离心、免疫印迹、荧光显微镜等方法检测 M . tb 胞内TNT、EsxE、EsxF表达水平和亚细胞定位，观察EsxEEsxF复合物结构以及与 M . tb 胞膜相互作用过程，分析WXG基序在EsxE-EsxF复合物与膜相互作用和孔隙形成中的作用以及与TNT分泌之间的关系。随后，在感染 M . tb 的THP-1细胞中检测EsxE-EsxF复合物和TNT分泌水平。

（3）结果

1）EsxE和EsxF为TNT分泌所必需，二者形成异源二聚体（EsxEF），组装成长丝状低聚物，与细菌胞膜结合，形成稳定的跨膜通道。

2）WXG基序和GXW基序的突变不影响EsxEF二聚体形成，但会破坏膜孔的形成、膜的形变和TNT的分泌。

3）WXG/GXW基序是控制EsxEF与膜相互作用和孔形成的分子开关。

（4）结论：

依赖WXG 基序的EsxE-EsxF复合物组成 M . tb 毒素分泌系统的一部分，在CpnT/TNT运输和分泌中起重要作用。

三、结核分枝杆菌VapC4毒素利用小开放阅读框启动综合性的氧化和铜应激反应

M . tb 的毒素-抗毒素系统VapBC4辅助 M . tb 逃避宿主细胞的杀伤，维持 M . tb 在巨噬细胞内的潜伏感染状态。VapC毒素是结构和序列特异性核酸内切酶，在感染宿主细胞后识别并切割tRNA，但其切割tRNA诱发 M . tb 保护性的机制并不清楚。

（1）目的：

探究VapBC4系统的VapC4毒素调节 M . tb 生长代谢以及保护 M . tb 抵御巨噬细胞攻击的分子机制。

（2）方法：

应用基因组学、蛋白质组学、代谢组学方法检测VapC4毒素触发的连续分子事件以及受调控的细胞通路。

（3）结果：

VapC4通过裂解Cys反密码子序列中单个位点，使唯一的转运RNACys（tRNACys）失活。tRNACys池的耗尽导致mRNA中Cys密码子上的核糖体停滞。在Cys停滞核糖体的基因组图谱分析中发现了几个包含Cys的未注释的开放阅读框（open reading frame，ORF）。其中4个是编码少于50个氨基酸的富含Cys蛋白的小ORF，它们作为Cys响应衰减器，参与Cys密码子区域核糖体的停滞，控制下游基因的翻译。VapC4的激活模拟了Cys饥饿状态，Cys衰减激活小ORF，导致自由Cys合成增多。由此产生的Cys用于mycothiol的合成，mycothiol可抵抗氧化应激，维持细胞氧化还原稳态。新富集的Cys还会选择性地诱发相关细胞通路子集，使 M . tb 也能够抵御巨噬细胞内的铜应激。

（4）结论：

VapC4毒素介导了与 M . tb 存活相关的应激信号通路的激活。

四、结核分枝杆菌毒素的分泌和运输

先前的研究表明EsxE-EsxF复合物参与 M . tb TNT的分泌，但TNT分泌和运输的分子机制仍不完全清楚。小ESX蛋白与EsxE和EsxF有相似之处，表明小ESX蛋白作为 M . tb Ⅶ型分泌系统也可能参与TNT的分泌过程。

（1）目的：

探究ESX分泌系统（ESX 1-5）在 M . tb TNT分泌中的具体作用。

（2）方法：

首先将正常 M . tb 菌株和eccC2、eccC4基因缺失菌株分别感染THP-1细胞，运用免疫共沉淀、荧光显微镜和流式细胞术比较eccC2和eccC4缺失 M . tb 菌株和正常菌株的CpnT亚细胞定位和分泌情况，分析ESX-2和ESX-4与CpnT和 M . tb 胞膜相互作用过程。随后分析ESX-1，ESX-2和ESX-4在感染巨噬细胞内破坏吞噬体膜结构，促使TNT分泌到细胞质的机制。

（3）结果

1）CpnT/TNT的分泌需要ESX-4：ESX-4蛋白在 M . tb 内膜进行组装形成跨内膜通道，其后EsxE-EsxF复合体通过ESX-4蛋白形成的内膜通道被转运至 M . tb 外膜，继而组装形成跨外膜通道。CpnT蛋白也通过ESX-4形成的内膜通道被运输至外膜，随后CpnT/TNT被分泌至吞噬溶酶体内。

2）除ESX-1蛋白外，ESX-2和ESX-4蛋白也参与介导吞噬溶酶体膜的通透性改变。

（4）结论：

ESX-1、ESX-2和ESX-4蛋白系统联合EsxE-EsxF复合体协同作用将TNT从 M . tb 胞膜内转运到感染的巨噬细胞细胞质中。

［专家点评］

近期，几项针对 M . tb 毒素的相关研究取得了重要进展。首先，系统性揭示了小WXG100蛋白家族的EsxE和EsxF联合Ⅶ型分泌系统蛋白ESX-1、ESX-2以及ESX-4，协同促进了 M . tb 外毒素TNT从细菌内部跨细菌胞膜以及透过吞噬溶酶体膜进入巨噬细胞细胞质的完整分子路径。这一分泌机制的阐明，为抑制TNT的分泌，减轻TNT对于巨噬细胞内部NAD ⁺ 的耗竭诱发的巨噬细胞坏死性凋亡，提供了可能的干预靶点。然而，如何针对TNT分泌的这一系列分子路径设计具有可行性的干预措施来抑制TNT释放诱发的巨噬细胞凋亡和随后的 M . tb 免疫逃逸，这种干预能否有效减轻 M . tb 的体内外感染水平，当前研究尚未揭示，仍需进一步的研究和证明。另外，近期针对 M . tb 毒素-抗毒素系统的研究新发现了DarT-DarG系统以及VapBC4系统利用不同的分子机制和生物学过程来调控 M . tb 在巨噬细胞内的存活和生长，尤其是毒素蛋白DarT和VapC4的上调或者激活会保护应激压力状态下 M . tb 的活性，促进其在巨噬细胞内的持留和存活。因此，进一步阐明DarT和VapC4的分子结构及功能，发现可能的干预靶点，针对性地设计干预或者抑制这些蛋白活性的小分子化合物或特异性抗体来抑制毒素的活性，并从多个水平评估这些措施对于 M . tb 在体内的持留、抗生素抗性的产生、 M . tb 潜伏感染的影响等研究工作需要继续深入进行。总之，这些最新研究揭示的 M . tb 毒素的完整分泌机制，分子结构以及调控的宿主细胞生物学过程，为深入理解 M . tb 的致病机制以及研发相应抗 M . tb 药物或治疗方法提供了全新的理论基础。

点评专家：王术勇 8p93hNJeYl4B5l3gmTrxRQKZfof2QQNDLAWgqqQHUaS/XhtvzGJfdYWCaCDrJoNs