临床神经遗传病学最新章节_唐北沙著

第五节
基因治疗

基因治疗主要是利用DNA重组技术，以临床治疗和研究为目的，通过载体将外源性遗传物质转移到靶细胞并使其表达的治疗策略。基因治疗是将正常基因及其表达所需序列导入到病变细胞中，修复缺陷基因或抑制突变基因表达，从而治疗遗传性疾病。基因治疗通过基因修复、基因抑制、基因失活、基因修饰和基因替代等技术方法，实现基因水平调控，达到治疗或延缓疾病的目的，具有广泛的应用前景。随着细胞分子生物学技术的发展，如iPSCs技术和基因编辑技术的出现，可更好地促进基因治疗的发展。

（一）基因治疗策略

1.基因修复（gene correction）

基因修复是指对突变基因进行原位修复，纠正突变碱基序列，保留正常碱基序列。基因修复具有不破坏基因组结构、修复后基因仍受调控因子调节等优点，且所应用的小分子核苷酸能避免病毒载体所引起的免疫反应，是理想的基因治疗策略。但基因修复操作要求高，在临床实践应用中具有一定难度。

传统的基因修复通过DNA双链断裂（double strand breakage，DSB）的基因重组方式进行，包括同源重组修复（homologous recombination，HR）和非同源末端连接修复（non-homologous end joining，NHEJ）。还有一些新的基因修复方式，包括三链形成寡核苷酸（triplexforming oligonucleotide，TFO）、RNA/DNA嵌合分子（RNA/DNA oligonucleotides，RDO）和单链寡核苷酸（single stranded oligonucleotides，ssODN）等。因ssODN合成简便、费用低、修复效率较稳定，已广泛应用于基因治疗中。

2.基因失活（gene inactivation）或基因抑制（gene suppression）

基因失活或基因抑制是指应用反义技术及RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术等灭活或抑制特定基因表达，以达到治疗疾病的目的。

（1）反义技术：

反义寡核苷酸（ASOs）技术是最常见的反义技术。

1）ASOs技术：

是利用短的核酸分子（DNA或RNA）通过碱基配对与靶基因的mRNA互补结合，从而抑制靶基因的转录与翻译，达到治疗疾病的目的。目前，常用的方法是将人工合成的ASOs导入细胞，识别并结合靶基因的mRNA，激活核糖核酸酶H（ribonuclease H，RNase H），特异性地水解使其失活。由于ASOs易受核酸酶降解，许多化学修饰被引入到ASOs中增加其稳定性，包括磷酸骨架改变、戊糖修饰（如硫代寡核苷酸）和gapmer修饰等。

导入ASOs技术包括：①反义RNA表达载体导入；②反义RNA（或DNA）体外显微注射导入到靶细胞；③脂质体转染反义RNA（或DNA）导入；④其他方法，如CaCl ₂ 法、细胞电穿孔法、逆转录病毒载体等。

2）核酶（ribozyme）：

是一类具有催化功能的核酸分子，能够与双链DNA或RNA结合，切割靶基因mRNA，从而抑制基因转录或翻译；切割mRNA后可形成杂交双链高级结构，防止RNA酶对其自身的降解。其在基因治疗中具有广阔的应用前景。

3）肽核酸（peptide nucleic，PNA）：

是可作为反义药物使基因失活的一种核酸类似物，由2-氨基乙基甘氨酸蛋白取代核酸的磷酸戊糖骨架，与DNA或RNA杂交形成稳定的双螺旋或三螺旋结构，亲和性和热稳定性高。PNA可抑制聚合酶或转录因子与DNA和mRNA结合，影响基因的复制和转录。

（2）RNAi技术：

是指通过将外源或内源性的双链RNA（double strand RNA，dsRNA）导入细胞后引起与dsRNA同源的mRNA降解，进而抑制靶基因表达。RNAi技术机制包括以下阶段：①启动阶段；②效应阶段；③级联放大阶段。

诱导基因沉默的核酸分子包括反义RNA（antisense RNA）、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）等。siRNA和shRNA抑制靶基因mRNA转录，而miRNA抑制靶基因mRNA翻译。siRNA和miRNA均为非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA），由长度为21~25nt的小分子RNA组成，是目前调节生物体内基因表达的重要方式。

3.基因增强（gene augmentation）

又称为基因修饰（gene modification），是将目的基因导入病变细胞，目的基因的表达产物能修复基因缺陷，适用于治疗单基因隐性遗传病。

4.基因替代（gene replacement）

也称为基因置换（gene substitution），是采用有功能的正常基因替换突变基因的一种治疗策略，使致病基因得以永久地纠正。传统上所谓的基因治疗实际上就是基因替代治疗。

5.基因编辑（gene editing）

是目前最热门的基因治疗策略，可对基因组进行编辑（敲除、替换和纠正），实现精确修复。该策略具有操作简单、成本低、效率高等优势。在医学领域中，基因编辑技术可应用于疾病发病机制、基因功能的研究，可改造缺陷基因，实现基因治疗。

基因编辑技术包括锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、转录激活样因子核酸酶（transcription activator like effector nuclease，TALEN）和规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）等。以上技术皆是切割靶序列产生DSB，继而通过细胞内HR或NHEJ机制实现基因修复。

与ZFN、TALEN技术相比，CRISPR/Cas9技术只需设计与靶DNA互补的小向导RNA（small guide RNA，sgRNA），在sgRNA引导下，Cas9蛋白可发挥靶向切割功能，基因编辑效率高，且能够实现多个基因打靶。尽管该技术在基因编辑方面具有巨大优势，但仍存在脱靶率问题，限制了其在临床的广泛应用。

（二）基因治疗类型

根据靶细胞类型可将基因治疗分为生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗。生殖细胞基因治疗是将受精卵早期胚胎细胞作为靶细胞进行基因治疗，即在体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）的过程中，利用卵母细胞核质交流的分子机制，将正常的基因引入核DNA而达到治疗疾病的目的。体细胞基因治疗是将外源性基因导入机体特定的细胞以弥补基因的缺陷，使机体恢复健康。根据基因转移途径可将基因治疗分为体内疗法和体外疗法。

（三）基因治疗方法

1.目的基因转移

如何将外源基因安全有效地转移到靶细胞是基因治疗的关键，其中载体的选择与转染途径更是基因治疗的重点。常见基因治疗载体分为病毒载体与非病毒载体。

（1）病毒载体：

因转染率高得到了广泛应用，但存在诱导宿主免疫反应、致瘤性、包装基因容量有限及制备成本高等缺点。常用的病毒载体包括：①逆转录病毒载体（retrovirus）；②腺病毒载体（adenovirus）；③腺相关病毒载体（adeno-associated virus，AAV），又称为副腺病毒（deputy adenovirus）；④慢病毒载体（lentivirus）；⑤单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）。

（2）非病毒载体：

具有低免疫原性、不发生外源性基因随机整合、低成本及易规模化生产等优点，越来越受到重视。常用的非病毒载体包括质粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体等，在上述载体基础上又发展了人类人工染色体（human artificial chromosome，HAC）。HAC具有以下优点：①携带大片段DNA，可包含全长基因片段或多个基因；②不整合到宿主基因组中，避免插入突变和基因沉默的发生；③以单拷贝形式存在，携带人类基因组DNA所有元件，可模拟正常细胞基因的时间性和空间性表达。

此外，纳米技术与上述载体的结合推动了纳米载体的出现。常见纳米载体包括纳米胶囊、纳米球、纳米胶束和外泌体，直径为1~100nm。纳米球具有高分子基质骨架，使包装药物在其中分散分布。纳米胶囊由高聚合物的外壳和液状或固态物质的内核构成，聚合物膜封装药物在内核层。纳米胶束由亲水的极性基团内核和疏水的表面活性分子外层构成。外泌体是一类直径为30~150nm的细胞外囊泡，由不同类型的细胞释放并介导细胞间传递。近年来，纳米载体已受到越来越多的关注，而纳米载体转染干细胞的基因治疗是目前研究的热点。

2.基因转移方法

（1）病毒介导基因转移法：

是通过转换方式完成基因转移，以病毒为载体，将外源目的基因通过基因重组技术，组装为重组病毒载体，使该病毒感染宿主细胞。

（2）受体载体转移法：

将含有目的基因的重组质粒和识别特异性多肽的某些细胞表面受体形成复合物，通过细胞内吞方式来转移目的基因，此方法可使外源基因在活体内导向特定类型的细胞。

（3）物理方法：

包括显微注射目的基因到靶细胞的直接注射法、电流穿击细胞膜使目的基因到靶细胞的电穿孔法、利用微米级的金和钨吸附目的基因到靶细胞的粒子轰击法等。

（4）化学方法：

采用磷酸钙沉淀改变细胞膜通透性，以增强细胞获取目的基因的能力，但此方法转移效率低。

（5）膜融合法：

将人工脂质体或红细胞影泡、微细胞、原生质球等与靶细胞融合或直接注射到靶细胞，使外源基因表达，达到基因转移目的。

（6）同源重组法：

将外源性目的基因定位导入受体细胞的染色体，通过与靶位点的同源序列交换，使外源性DNA片段取代原位点上的缺陷基因。

3.靶细胞选择

靶细胞需要根据治疗目的来选择，包括生殖细胞和体细胞，由于受精卵或早期胚胎细胞的遗传改变将会影响后代，生殖细胞基因治疗因伦理学问题而限制了其广泛开展，目前的研究主要是体细胞基因治疗。体细胞基因治疗还需选择合适的靶细胞进行体外遗传操作，经修饰加工后的靶细胞通过输入、注射或经手术移植等方法导入患者体内以达到治疗目的。

此外，根据是否需要进行细胞移植，基因治疗方法还可分为体内疗法和体外疗法。体内疗法不需进行细胞移植，直接将外源DNA注射到体内，使其转染靶细胞进而表达来发挥治疗作用；此方法操作简便、易推广，但存在疗效短、免疫排斥及安全性等问题。体外疗法是指将目的基因通过载体导入靶细胞，对细胞进行基因修饰，筛选靶细胞，再移植到患者体内的过程。移植方式包括经静脉、动脉、鞘内、脑室移植和立体定向移植等方法。

（四）临床应用

1.SMA与基因治疗

有研究针对SMA，以AVV9为载体将野生型 SMN 基因通过静脉注射对SMA患儿开展了Ⅰ、Ⅲ期临床基因治疗（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT02122952、NCT03461289）。

2.PD与基因治疗

有研究针对PD，以AAV2为载体将芳香族氨基酸多巴脱羧酶（aromatic L-amino acid decarboxylase， AADC ）基因通过立体定向注射对PD患者开展了Ⅰ期临床基因治疗（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT01973543、NCT03065192）；以马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus，EIAV）为载体将 AADC 基因、酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH ）基因和GTP环化水解酶1（GTP-cyclohydrolase 1， GCH1 ）基因通过立体定向注射对PD患者开展了Ⅰ、Ⅱ期临床基因治疗（ClinicalTrials.gov Identifier：NTC00627588、NCT01856439）。

另一组研究，以AAV2为载体将神经营养因子Neurturin（ NTN ）及胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor， GDNF ）通过立体定向注射对PD患者开展了Ⅰ、Ⅱ期临床基因治疗（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT00985517、NCT01621581）。

3.AD与基因治疗

有研究针对AD，以AAV2为载体将神经生长因子（nerve growth factor， NGF ）基因通过立体定向注射对AD患者开展了Ⅱ期临床基因治疗（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT00876863）。另一组研究，将针对 MAPT 基因的ASOs药物通过鞘内注射对AD患者开展了Ⅰ、Ⅱ期临床基因治疗（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT03186989）；以AAV为载体将野生型 APOE2 基因通过鞘内注射对AD患者开展了Ⅰ期临床基因治疗（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT03634007）。

4.ALS与基因治疗

有研究针对ALS，以自体BMSCs将神经营养因子（neurotrophic factor， NTF ）基因通过肌内注射、鞘内注射对ALS患者开展了Ⅱ期临床基因治疗（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT01051882、NCT01777646、NCT02017912）。另一组研究，以AAV载体将针对 SOD1 基因的miRNA通过鞘内注射于ALS患者开展了临床基因治疗；将针对 SOD1 基因的ASOs药物通过鞘内注射于ALS患者开展了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床基因治疗（ClinicalTrials.gov Identifier：NCT02623699）。

（梁德生　刘雄昊）

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