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第三节
念珠菌形态学

单细胞真菌呈圆形或卵圆形,以出芽方式繁殖,称酵母菌。念珠菌细胞膜初步组成是由碳水化合物和共价蛋白质联合而成的。细胞壁的主要物质为碳水化合物,先在质膜结构上形成,包括一些晶状物质,如α-葡聚糖、几丁质、β-1,3-葡聚糖联合的N-乙酰糖胺聚合物。晶状物可使真菌细胞壁坚固、结实,其他多糖成分包括基质,如甘露糖蛋白,可使细胞壁有通透性。

真菌的孢子发生,菌丝顶端生长,产生孢子,有各种不同形态,还有各种色素、大小、形态、分隔等,可作为真菌鉴定的参考依据。念珠菌形态学在真菌鉴定方面起主要作用,真菌孢子和菌丝经大量生长繁殖后可形成真菌集团,叫菌落(colony)。

直接镜检就是根据病变部位收集不同标本,如刮取病变处鳞屑、分泌物或伪膜,留痰、尿、便、血、脑脊液等。标本可用氢氧化钾或生理盐水制片,镜下可见圆形或卵圆形芽生孢子,大小约(2~7)µm×(3~14)µm不等。单个、成堆或呈短链排列,也可从孢子芽延长成假菌丝。也可制片染色,革兰氏染色显示菌丝、芽孢呈紫色,着色不均匀。过碘酸染色显示菌丝、芽孢染成红色;用1∶1000吖啶橙染色,在荧光显微镜下,菌体呈亮绿色。如有大量假菌丝存在,说明念珠菌处于致病状态。临床标本直接镜检看不到厚壁孢子。

念珠菌培养最常用的培养基是沙氏琼脂培养基(又称沙堡培养基)。先将标本接种于此培养基上,25~30℃培养24~48小时,通常24小时即有菌落出现,48小时菌落直径可在1mm以上。菌落白色、奶油样,软而光滑或有闪光;有的菌种菌落扁平、膜样,表面略显干涩。培养物镜检后再移种至玉米粉吐温-80琼脂(CMA)中,以便进一步鉴定菌种,还可接种在显色琼脂上,同时进行发酵或同化试验。

念珠菌为类酵母型菌落。类酵母型菌落(yeast-like type colony)的外观与酵母型菌落一样,菌落柔软,光滑,湿润,似奶样,并有假菌丝。在光镜下可见单细胞性的芽生孢子,可有假菌丝。酵母菌繁殖方式包括芽生和裂殖,酵母的芽生是从细胞壁的某一点发芽,母细胞进行核分裂,部分核进入子细胞,以后在母细胞和子细胞之间产生横隔,成熟后从母体分离,母体上遗留一鞭痕。

念珠菌的主要特征是细胞呈球形、椭圆形、圆筒形、长条形,有时为不规则形;通过发芽而繁殖,可形成假菌丝,少数形成厚膜孢子及真菌丝。

1.白念珠菌

白念珠菌细胞呈圆形或卵圆形,直径3~6µm,革兰氏阳性着色不均匀,可形成芽生孢子和假菌丝,经培养假菌丝中间或顶端可形成厚膜孢子。芽生酵母在特定条件下转为菌丝后则致病力增强。具有侵袭性的菌株在体内易形成假菌丝。

念珠菌在普通琼脂、血琼脂和沙堡培养基上均生长良好。在沙堡培养基室温或37℃培养1~3天长出菌落,呈奶油色或呈蜡状,柔软、光滑、湿润,有浓厚的酵母气味。陈旧培养基中菌落颜色变深、变硬或出现皱褶。培养稍久,有大量向下生长的营养假菌丝,无向上生长的气中菌丝,呈类酵母型菌落。白念珠菌在玉米粉吐温-80琼脂(CMA)培养基内室温培养可形成厚膜孢子。在血琼脂培养基上菌落中等大小、呈暗灰色。在动物血清中37℃2~3小时可形成芽管,是鉴定念珠菌的重要依据。电镜检查致病菌株表面粗糙,有发芽现象。

CHRO Magar念珠菌显色培养基法:对于类酵母样菌落,CHRO Magar平板37℃温箱培养48~72小时,出现翠绿色菌落考虑为白念珠菌,出现蓝灰色到铁蓝色菌落考虑为热带念珠菌,出现紫色菌落考虑为光滑念珠菌,出现粉红色菌落考虑为克柔念珠菌,出现其他各种颜色菌落者需进一步鉴定。

白念珠菌正常情况下呈卵圆形,与机体处于共生状态,不引起疾病。当某些因素破坏这种平衡状态,白念珠菌由酵母相转为菌丝相,在局部大量生长繁殖,引起皮肤、黏膜甚至全身性念珠菌病。机体正常防御功能受损可导致内源性感染,如创伤、抗生素应用及细胞毒药物使用致菌群失调或黏膜屏障功能改变、皮质激素应用、营养失调、免疫功能缺陷等。念珠菌为双相菌,正常情况下一般为酵母相,致病时转化为菌丝相。因此,在细胞涂片或组织切片中发现假菌丝是念珠菌感染的重要证据。

念珠菌对热的抵抗力不强,加热至60℃1小时后即可死亡。但对干燥、日光、紫外线及化学制剂等抵抗力较强。

菌落特征:沙氏琼脂培养基(SDA)25℃中等速度生长,形成酵母样菌落,奶油样、光滑、闪光,老后有皱褶。显色琼脂基上呈蓝绿色菌落。显微镜特征:SDA 25℃,48小时,有多数芽生孢子,有的稍长。CMA 25~30℃培养48~72小时,生长真菌丝和假菌丝,多数假菌丝,假菌丝连接处产生多数呈簇状、葡萄状小分生孢子,顶端或侧支产生厚壁孢子。血清芽管试验,在37℃2~3小时,可以产生芽管。API2OC可鉴定本菌。

新近从白念珠菌中区分出一种都柏林念珠菌,生长温度比白念珠菌低,分子生物学方法可以将两者区别开来。再有,类星形念珠菌被认为是白念珠菌的血清型B型,有的分类为白念珠菌类星型变种,现在认为它是白念珠菌的异名。

厚壁孢子试验:采用玻片小培养法。吸取200µl玉米粉吐温-80琼脂培养基于载玻片上,挑取少许菌落接种于盖玻片上,十字画线,覆于培养基上,再移种于湿盒中,置于25℃培养24~48小时后,观察见到厚壁孢子生长者为白念珠菌。

血清芽管试验:取人新鲜血清100µl置于150µl的EP管中,以无菌接种环挑取少量分离菌落混悬加入,混匀,于37℃温箱中培养6~24小时,然后混匀,吸取20µl置于载玻片上,上覆盖玻片,立即镜检,镜下见芽管者为白念珠菌。

2.热带念珠菌

菌落特征:SDA 25℃,中等速度生长,光滑、乳白色奶油样菌落,陈旧菌落后表面有皱褶。沙氏液基25℃,2天,液基表面和侧壁有幞状物。显色琼脂基产生暗蓝、蓝灰色菌落。显微镜特征:CMA 25℃,产生许多假菌丝,以及假菌丝间的芽生分生孢子,孢子稍长。API2OC可鉴定到种。

3.近平滑念珠菌

菌落特征:SDA 25℃,表面光滑、柔软,陈旧菌落奶油样、白色、闪光、有时黄色,平滑或有皱褶。显色琼脂基上呈白色、淡粉色菌落。显微镜特征:SDA 25℃,酵母细胞,卵圆形或长倒卵形。CMA 25℃,细长假菌丝和小分生孢子。CMA 25℃,假菌丝大量分支,卵形和长倒卵形分生孢子。API20C可以鉴定到种。

4.克柔念珠菌

菌落特征:SDA 25℃,扁平、柔软、光滑,老后污黄色,可有皱褶。显色琼脂基上呈淡粉色、紫色菌落。显微镜特征:SDA 25℃,镜下可见多数酵母孢子,有的呈卵圆形,有的较长。CMA 25℃,有大量假菌丝,少数分生孢子。API20C可以鉴定到种。

5.乳酒念珠菌

菌落特征:SDA 25℃,光滑、柔软、奶油样,陈旧菌落变污黄色,有时有网状纹路。显色琼脂基上呈粉色、紫色菌落。

6.光滑念珠菌

菌落特征:SDA 25℃,光滑、柔软、闪光、奶油样菌落。显色琼脂基上呈白色、粉紫色菌落。显微镜特征:SDA 25℃,有多数卵圆形母细胞,一般从细胞尖端发芽。CMA 25℃,无假菌丝,只有芽孢,有时可见酵母细胞联成串,或有分支。API2OC可鉴定到种。

7.季也蒙念珠菌

菌落特征:SDA 25℃,菌落光滑、扁平、闪光、奶油样,陈旧菌落变成黄色至粉色菌落。显色琼脂基上呈淡粉色、紫色菌落。显微镜特征:SDA 25℃,多数卵形至倒卵形酵母孢子。CMA 25℃,多数假菌丝和分生孢子,孢子较长,有时呈链状,可分支,或呈轮状。

白念珠菌的形态发生与其致病性密切相关,在生长过程中,依据极性生长程度不同,可分为3种形态——酵母态、假菌丝和真菌丝(表3-2)。此外,它还可以在正常酵母形态(白色,white)和伸长的细胞形态(不透明色,opaque)之间转换,被称为white-opaque转换。白念珠菌能以酵母态(即芽生孢子)、真菌丝与假菌丝3种细胞形态存在。酵母态的白念珠菌与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)相似,为卵圆形细胞,并且彼此之间易分离。真菌丝是完全平行延伸的管状菌丝,并且在细胞间隔处没有缢缩。假菌丝是一串伸长的酵母态细胞,各个细胞之间没有分离,其细胞间有明显分界,形成缢缩。假菌丝易形成分支,这样可能有利于其汲取营养。不同形态的白念珠菌形成的菌落也不相同,主要差别为:①真菌丝和假菌丝形成的菌落会侵入琼脂下层;②真菌丝和假菌丝的存在使得菌落呈现小圆齿状,而酵母态形成的菌落是光滑的,不同形态的白念珠菌在菌落中所占比例的不同可导致菌落形状的差异;③含有真菌丝的菌落边缘经常延伸出羽毛状突出物。研究表明,基因毒性应激即当DNA受到损伤时,DNA复制/损伤检验点被激活,也可调控白念珠菌丝状生长。如敲除DNA损伤修复的基因或加入抑制DNA复制的药物,可以诱发菌丝生长。许多环境诱因可影响白念珠菌的形态,培养基的pH在6.0~7.0,且温度高于35℃时有助于形成菌丝,血清因子能有效诱导菌丝生成,其他因素如N-乙酰葡糖胺及一些特殊营养成分都会诱导细胞以使菌丝生长。此外,细胞密度也会影响白念珠菌细胞形态,由于群体感应,高细胞密度时倾向于酵母形态的生长,低细胞密度时更倾向于菌丝生长。

表3-2 白念珠菌不同形态的转换

白念珠菌可自发地由正常的酵母形态细胞(白色,white)转变为伸长或豆子形状的细胞(不透明色,opaque)。白色状态的白念珠菌细胞呈卵圆形,在固体培养基上菌落形态呈奶油色,光亮、半圆形外观,其繁殖能力较不透明状态的白念珠菌弱。不透明细胞比白色细胞更大、更长,并且细胞壁有小突起,在固体培养基上菌落形态呈灰色扁平状;其繁殖效率大约是白色细胞的100万倍。与白色细胞相比,不透明细胞在体外多种生长条件下的存活率更低,基于此差异,这种不透明状态的白念珠菌细胞所形成的灰色菌落可被荧光桃红B特异性染成红色。这种white-opaque转换受基因和环境控制。

牛会侠等研究了黄连提取物(ECR)对固体平板上白念珠菌菌落形态的影响。①研究观察固体培养基上菌落形态,发现空白对照组菌落皱缩,边缘有褶皱,单菌落形态较大;64mg/L ECR组有部分褶皱,但程度要小于空白对照组,单个菌落形态变小;而128mg/L、256mg/L ECR组则观察不到褶皱,边缘光滑,单个菌落形态明显变小。由此可见,随着ECR浓度增大,菌落趋于缩小、变圆。②黄连提取物对半固体培养基上白念珠菌菌丝生长的影响:在半固体培养基中,空白对照组菌丝能够侵入到培养基内部,且菌丝长而浓密;而ECR组随着浓度不断增加,其菌丝长度越来越短,256mg/L组菌丝则完消失。 dwJHOBCkqys4SS4bAO7+JoSAr+wwePCrt4Bv+3n/ciTJjuRcoHk9ym7Pxss024tl

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