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突发呼吸道传染病疫情时，及时诊断相关疾病，是控制传染源，切断传播途径，控制疫情的重要手段。检验科出具的病原体检测报告是诊断呼吸道传染病的重要依据，快速病原体检测是落实传染病“早发现、早报告、早隔离、早诊断、早治疗”要求的关键措施，而其他常规检测项目在呼吸道传染病的辅助诊断及相关患者的支持治疗方面也发挥了重要作用。
本章节参考检验科在新冠肺炎疫情防控和诊疗过程中开展的各项工作，重点阐述面对急性呼吸道传染病的流行，如何确保相关病原体检测的准确性、及时性和安全性。
1.病原体检测准确、及时
目前病原体检测是诊断呼吸道传染病最重要的标准，而及时、准确发现传染源是一切防控措施的根本出发点。因此，尽可能在最短时间内准确检测是检验科管理的最基本原则。另一方面，通过周密的工作流程保证准确性的基础上，要严格执行疾控部门对相关病原体核酸检测阳性结果的报告流程；同时，客观全面地认识相关病原体核酸检测阴性结果，分析实验室出现假阴性结果的潜在可能和原因，提高诊断准确性。
2.安全
检验科需要接触包括咽拭子在内的众多标本，在呼吸道传染病流行期间，这些标本可能具有传染性，因此，检验科是需要进行严格院感防控的重点部门。
3.具备快速增加检测量的储备能力
检验科建立应急管理体系，制订工作预案，加强物资和人员储备，以便高效快速响应大规模核酸检测任务。
1.准确、及时、安全地完成疫情防控期间的相关病原体核酸标本检测。
2.实验室诊断及鉴别诊断相关的辅助检查。
3.对潜在传染性标本的处理流程及措施。
4.大规模核酸筛查标本检测的应对措施。
在新冠肺炎疫情控制措施中，核酸检测工作无疑起到重要作用。准确、及时、安全的实验室检测工作是对传染病患者进行诊断和管理以及对密切接触者展开医学处置等措施的前提。本节内容将以新型冠状病毒（简称“新冠病毒”）核酸检测为模板，从核酸检测“采、送、检、报”全流程来系统简述面对急性呼吸道传染病的流行，在保障平时日常工作的同时，如何能准确、及时、安全地出具相关病原体核酸检测报告。
1.标本采集
从事核酸检测标本采集的技术人员应当经过生物安全培训（培训合格），熟练掌握不同种类标本的采集方法、采集操作流程和注意事项，标本采集人员应结合受检者病程、临床症状，选择恰当的标本种类和采集时机，及时采集标本，确保标本质量符合要求。
2.标本送检
标本采集完成后，应尽快运送至临床实验室进行预处理和检测。如果需要长途运输标本，为避免病原体核酸降解，应采用保冷方式进行保存，严格按照相关规定包装运输，整个运输过程中应避免标本反复冻融。
3.标本接收
标本运送人员和接收人员对标本进行双签收。接收人员首先检查包装是否完整、标本是否泄漏，拒收不合格标本；核对信息和数量，及时查漏，避免标本丢失。
1.实验室检测人员培训
（1）开展核酸检测前，要求对实验室检测人员进行规范化培训。实验室检测技术人员应当具备相关专业大专以上学历或具有中级及以上专业技术职务任职资格，并有2年以上的实验室工作经历和基因检验相关培训合格证书；同时重视生物安全方面的培训，以确保实验能够顺利进行，保证检验人员和标本的安全。
（2）实验室检测人员必须熟练掌握检测流程相关内容，根据生物安全风险评估情况选择对应的防护措施。在分子诊断实验室，应严格培训防护用品的穿脱流程，以及PCR实验室清洁、消毒、相关实验用品和医疗垃圾处理等相关内容，要求每个检测人员通过培训考核后，方可上岗。
（3）实验室检测人员的专业和数量应与所开展项目及标本量相适宜，以保证及时、熟练地进行实验和报告结果，并保证结果准确性。
2.实验室质量控制
（1）实验室建设须符合行业标准规范，完全按照《生物安全实验室建筑技术规范》和《实验室生物安全通用要求》设计实施。其中，分子诊断实验室审批指导依据还有《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》等。
（2）检测试剂盒和方法学选择策略：选择经国家药品监督管理局批准带有批准文号的核酸检测试剂盒，考虑方法学的检测时间、易操作性、成本、通量、敏感性、特异性、精密度、所需仪器设备、对实验室环境条件的要求等因素。项目开展前，做好预实验和整个检测体系的性能验证，评估方法学的适用性和可行性。建议选择检测限低、灵敏度高的检测试剂盒。
（3）实验室按照国家相关文件和指南要求，建立实验室质量管理体系，规范开展室内质控（包括阴性质控、弱阳性质控及阳性质控），监控标本检测全过程，及时分析失控原因并对应执行纠正措施，定期分析和回顾室内质控情况，确保检测结果准确可靠。实验室应定期参加国家级或省级临床检验中心组织的室间质评活动。
（4）若同时使用多台仪器做同一项目时，要定期做不同仪器间的比对。所有设备应经过必要的检定/校准，按照仪器设备使用、维护、检定、校准的程序文件严格执行。
（5）分析后质量控制主要是对结果的分析，需要与临床沟通，将结果和受检者临床症状相结合进行分析，以确保检测结果正确。
1.标本采集时优先将发热门诊、急诊、黄码等急需出具核酸检测报告的标本进行分区分类，做好特殊明显的标记，与普通标本区分开，实验室收到加急标本后优先检测并及时报告。
2.医疗机构可通过增设PCR实验室、设定专岗、增设夜班和节假日值班，提高核酸检测能力，做好核酸检测服务。
3.为满足临床诊治及流行病学调查对检测结果时效性的要求，实验室可通过以下措施优化检测全流程：做好信息化样本管理工作；把控关键检测步骤，保证检测质量；做好人员和仪器的测算和配备，适当增加班次和仪器设备，统筹调配人员，优化升级仪器，缩短检测时间，提高检测能力；根据检测人员之间配合的默契度，进行专人定岗，固定搭配，最大程度提高检测效率；针对临床需要紧急报告的情况，灵活安排和选择符合环境要求的实验室地点，考虑引进快速检测技术，购买快速检测试剂及设备。在确保质量的前提下，以最快速度为临床提供诊断依据。
核酸检测结果为阳性时，应严格按照国家或当地疫情防控指挥部办公室要求，进行阳性结果的上报。
1.检测人员应按照可疑阳性/阳性标本复查及上报流程，第一时间上报科室负责人，科室负责人向医务处（科）汇报，医院启动传染病阳性结果报告流程及相关应急处置流程。同时，分子诊断实验室采用另外1～2种更为灵敏且扩增区域不同的核酸检测试剂，对原始标本进行复核检测。
2.传染病报告流程应严格遵循疫情报告属地管理原则，按国务院或国务院卫生行政部门规定内容、程序、方式和时限报告执行。对检测结果为阳性的标本，坚持逢阳必报、逢阳必处原则，严禁多次复核延误应急处置，从而造成疫情扩散蔓延或重大影响等后果。
3.严禁漏报、谎报阳性结果。未经允许，不得随意扩大或泄露报告信息。
临床实践中并非所有呼吸道传染病患者均可通过常规采样标本检测出呼吸道病原体核酸。按照《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》（第五版）的要求，每例疑似病例和聚集性病例均须采集急性期上呼吸道或下呼吸道标本；重症病例优先采集深咳痰液、肺泡或支气管灌洗液等下呼吸道标本。但由于多数患者咳痰等下呼吸道标本取样操作困难，且生物安全风险极大。因此，临床常规采集呼吸道标本仍以鼻咽拭子、咽拭子为主；而拭子样本采用现有实时荧光RT-PCR方法，在病程不同阶段阳性检出率差别很大，存在假阴性可能。甚至有的确诊阳性者先前多达9次核酸检测均呈阴性，严重影响临床诊疗。
出现假阴性的原因笔者归纳有以下几点。
1.样本自身的原因
受检者体内病原体含量低，样本中的病原体含量未达到试剂的最低检测下限，或者样本含已知抑制物如肝素、血红蛋白等，均可造成检测结果假阴性。
2.实验室检测试剂的有限性
检测试剂灵敏度不够高，当病原体含量低时极有可能漏检，容易造成假阴性。
3.临床采样方式和时机影响
为提高检出率，对于肺炎患者通常选取下呼吸道标本，从而获得更高的病原体含量。但获取肺泡灌洗液等下呼吸道样本操作要求高，且易喷溅，传播风险高，耗时。在各种核酸检测样本采样中，鼻咽、咽拭子作为最普遍的采样方式，其检出率与感染进程密切相关，因此选择正确的采样方式和时机、规范采集流程，确保采集到足量的标本，可降低假阴性发生率。
4.实验操作的因素
实验室未严格执行临床基因扩增检验质量管理，检测人员未严格按照标准操作程序文件执行，如标本灭活后未及时进行提取，操作时核酸样本中混入去垢剂等有机溶剂，导致假阴性。因此，实验室需定期对核酸检测人员进行深入培训和强化考核，规范检测流程，提高检测人员的技术水平。
5.病毒变异的可能性
如新冠病毒属于不稳定、易变异的RNA病毒，针对其变异频率及突变热点等问题暂时难以进行大规模临床样本的验证。病原体在流行过程中发生基因突变，可能导致个别样本扩增区突变而出现检测结果假阴性。
目前，病原学检查常用、快速的方法学仍是采用实时荧光RT-PCR技术的核酸检测，临床上对于核酸检测为阴性或阳性的受检者需谨慎对待，应充分考虑各个环节中可能造成结果不准确的因素，或借助实验室其他诊断项目联合诊断，如实验室血清学特异性抗体检测等。
1.血清学特异性抗体检测
人体遭遇细菌或病毒入侵时，机体细胞可针对细菌或病毒中的特异性抗原产生特异性抗体，特异性抗体随着病程进展呈动态变化，掌握特异性抗体变化规律，有助于充分发挥特异性抗体对呼吸道传染病辅助诊断效用。此外，针对病原体不同抗原表位产生的多种抗体，其产生时间、滴度水平还与患者病情的轻、重分型有关。总体而言，轻症患者特异性抗体出现时间和到达峰值时间早，但滴度水平较低。根据特异性抗体产生的特征，可以认为各类型抗体的产生情况和抗体水平均与疾病进展有关，通过检测各类型抗体存在情况及其滴度可以推测机体的感染状态。
将抗体检测与受检者流行病学史、临床资料等结合，是辅助核酸检测阴性的呼吸道传染病患者明确诊断的有效方法。
2.相关病原体抗原检测
为进一步加快发热患者分类救治，早期发现、隔离可疑呼吸道传染病病原体感染者，可增加抗原快速检测作为现有检测手段的补充，检测重点人群口咽拭子、鼻咽拭子样本中新冠病毒抗原。相比较于病毒分离和核酸检测，该方法具有无需特殊检测仪器、操作简便、测试时间短、成本低廉等优势。检测时间在20分钟以内，在急性感染期病原体含量较高时，能够快速检出阳性病例，可用于疑似人群进行早期分流和快速管理。
抗原检测的结果受到诸多因素的影响，包括检测试剂、标本质量、操作过程中反应条件等。要得到准确的结果，必须严格按照标准化步骤操作，避免不良因素对检测结果的影响。
3.常规支持性检测项目
在确诊患者以及早期未能检测出核酸结果阳性的疑似感染者的诊疗过程中，检验科日常开展的各项常规、血液、生化、免疫检测项目结果，能够帮助临床医师鉴别诊断，监测受检者的生命体征，及时采取相应治疗，掌握用药反应，以免贻误最佳治疗时期。
在新冠肺炎诊疗过程中，检验科医生出具的医学检验报告发挥了重要作用。除核酸检测以外，血细胞分析和白细胞形态、生化指标、免疫指标等均可辅助或鉴别诊断感染状态，同时也可反映疾病的严重程度、功能性失衡及器官损伤、治疗方案是否有效等。
新冠肺炎疫情流行最初阶段既已明确其传播途径主要为飞沫传播，通过呼吸道感染人体，并从患者的呼吸道样本中提取到病毒样本。而随着对新冠病毒的研究和认识不断深入，研究者在患者的粪便、尿液、腹水、血液等体液中发现并培养出新冠病毒。因此，新冠肺炎患者检查留取的相关样本，应视为潜在感染性生物因子。在实验室内，应制订严格流程管理和处理这一类标本，以消除感染性因子感染实验室工作人员和造成环境传播的可能性。
疫情防控期间设立专人专岗严格管理阳性标本，明确岗位职责，细化岗位事项，对岗位工作人员进行严格培训，制订严格的考核制度，以保障岗位职责安全有效地执行，最大限度降低传播风险。
在人员安排方面，一个核酸检测班次安排一个专项岗位班次，每个专项岗位班次相应安排两名岗位人员，保障标本管理工作的双人核对制。同时，注意人员储备，以保障该专项岗位的可持续性运行。
标本包装应符合国家卫健委《新型冠状病毒实验室生物安全指南》（第二版）分类包装要求。疑似或确诊受检者标本应标示特殊标识，并单独转运。检测完成后的剩余标本，可在结果报告发出并达到其保存时限要求后，若为检测前非灭活标本，则装入专用密封废物转运袋中进行压力灭菌处理，随后随其他医疗废物一起转运出实验室销毁处理；若为检测前已灭活标本，则无需高压灭菌，直接按医疗废物转运出实验室进行销毁处理。
1.实验室空气清洁，可采用房间固定和/或可移动紫外线灯进行紫外线照射2小时以上。
2.工作台面清洁，使用有效氯含量为2000mg/L的含氯消毒液或75%酒精进行台面、地面清洁。
3.生物安全柜消毒，使用有效氯含量为2000mg/L的含氯消毒液或75%酒精喷洒消毒其外表面。手消毒后将垃圾袋带出生物安全柜放入实验室废弃物转运袋中。试管架、实验台面、移液器等使用75%酒精进行擦拭。随后关闭生物安全柜，紫外线灯照射30分钟。
4.转运容器消毒，转运及存放标本的容器使用前后均需使用有效氯含量为2000mg/L的含氯消毒液或75%酒精进行擦拭或喷洒消毒。
5.塑料或有机玻璃材质物品清洁，使用有效氯含量为2000mg/L的含氯消毒液或过氧乙酸或过氧化氢擦拭或喷洒。
参考《新型冠状病毒实验室生物安全指南》（第二版）相关规定进行实验室消毒处理。
1.新冠病毒毒株或其他潜在感染性材料污染生物安全柜操作台造成局限污染
使用有效氯含量为5500mg/L的含氯消毒液，消毒液需要现用现配，24小时内使用。此后内容中有效氯含量参照此浓度。
2.病毒培养器皿碎裂或倾覆造成实验室污染
保持实验室空间密闭，避免污染物扩散，使用有效氯含量为5500mg/L的含氯消毒液浸泡的毛巾覆盖污染区。必要时（大量溢洒时）可用过氧乙酸2g/m 3 加热熏蒸实验室，熏蒸过夜；或使用气溶胶喷雾器喷洒20g/L过氧乙酸，用量为8ml/m 3 ，作用1～2小时；或用高锰酸钾-甲醛熏蒸，高锰酸钾8g/m 3 放入耐热耐腐蚀容器（陶罐或玻璃容器），后加入40%甲醛10ml/m 3 ，熏蒸4小时以上。熏蒸时室内湿度60%～80%。
3.清理污染物
严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。
为应对大规模核酸筛查，检验科建立实验室质量管理体系和应急管理体系，制订工作预案，加强物资储备，强化人员技术培训，提高应急反应能力，确保接到检测任务后，可立即激活应急管理体系，短时间内人员到位、设备到位、物资到位，样本送达后即刻开展检测。
依据相关法律法规要求，检验科经过自我评估，向省级卫生行政部门提出大规模核酸检测实验室审核申请，通过后在临床基因扩增检验实验室技术审核合格的证明文件中，可加注“大规模核酸检测”，即获得大规模核酸检测实验室资质。
根据实验室单人单管每天的最大检测量，计算拟承接的筛查任务量，结合检测任务时限，检验科做好人员和仪器的测算、配备，并在此基础上增加20%人员、设备配置作为检测能力储备。每日检测1万管（单管为1万人份、5混1为5万人份，10混1为10万人份）所需要准备的检测能力配置如下：核酸检测人员24～25人，相关辅助人员15人，96孔核酸提取仪器4～6台，96孔PCR扩增仪器10～12台，A2型双人生物安全柜3个。
1.检测人员储备通过检测人员培训，储备后备力量
（1）大规模核酸检测实验室检测人员按照规定接受技术培训并考核合格，持有临床基因扩增检验技术人员上岗证，签发核酸检测报告的人员还应当同时具备相应资质。同时，重视生物安全方面培训，组织开展针对标本溢洒和实验室污染等突发情况的应急演练，以确保实验顺利进行，保证检验人员和标本的安全。
（2）实验室检测人员必须熟练掌握检测流程相关内容，根据生物安全风险评估情况选择对应的防护措施，培训考核通过后方可上岗。
（3）针对核酸检测各个环节，组织在岗及储备检测人员持续学习，提高人员素养，确保检测和报告质量。
（4）保证实验室检测人员数量与目标任务量相适宜，及时地进行实验和报告结果，保证结果的准确性。
2.实验室场地及物资储备
检验科为应对大规模核酸检测，应预留相应的场地和仪器设备、检测试剂、耗材以及防护用品作为储备，以便接到检测任务可以立即投入运行，大幅提高核酸检测能力。
（1）核酸提取试剂、提取仪和扩增仪器要求：
核酸提取试剂与核酸提取仪配套使用，选用扩增检测试剂盒指定的核酸提取试剂和扩增仪。所有设备经过必要的检定/校准，建立仪器设备使用、维护、检定、校准的程序文件，并按照程序文件严格执行。其他八通道移液器、板式离心机、涡旋混匀仪等配套使用。
（2）试剂、耗材准备：
按照混采或单采准备相应数量的试剂。除常规检测试剂外，准备1～2种灵敏度更高的，且与常规检测扩增靶点不同的其他试剂用于结果复核。配备相应数量的耗材，包括PCR扩增板、加长型吸头、试管架等。
试剂与检测仪器相匹配。选用包含针对新冠病毒开放读码框1ab和核壳蛋白基因区域的试剂。扩增试剂应当选用国家药品监督管理局批准带有注册文号的试剂盒。选择检测限低、灵敏度高的检测试剂盒（检测限≤500拷贝/ml）。
（3）防护用品准备：
医用防护口罩、医用外科口罩、隔离衣、防护服、无粉乳胶手套、鞋套、防护面屏或护目镜、工作帽、洗手液等，按每人每天一套配置2～3天用量。按人员体型配置不同型号防护用品。
在大规模人群筛查时，人群流行率极低（<0.1%），当混采检测结果为阳性、临界值或单个靶标阳性时，应坚持“逢阳必报、逢阳必处”的原则，实验室发现初筛阳性人员后，第一时间上报，同时开展复核。
实验室信息系统完成与“公众检测信息系统”的直接对接，阴性检测结果直接上传至系统。从采样到报送检测结果控制在尽可能短的时间内完成。
准确、及时、安全地实验室检测可为疫情防控和临床诊疗提供关键技术支撑、发挥核心作用。检验科要勇担重任，建立完善及健全的病原体核酸检测体系，为可能出现的呼吸道传染病疫情，储备充足的检测能力。
（肖艳红 贾会真 刘焕亮）