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1926年，汉斯·布什开发出第一个磁电子镜头；1931年，Ernst Luca和Max Knoll开发了第一个视角电镜（EM）。1949年可投影金属箔出现后，应用材料科学可以改善EM。在20世纪60年代，EM达到了可以分辨原子的能力。在20世纪80年代，人们能够使用扫描EM观察湿样品。在20世纪90年代，计算机越来越多地用于分析EM图像，计算机也可以控制越来越复杂的镜头系统。我国自1958年试制成第一台EM以来，1965年研制成功分辨力优于7Å，放大倍数为20万倍的大型、高分辨率EM，以后又生产了放大倍数为40万倍的高分辨率EM。
经过多年的发展，EM已成为现代科学技术中不可或缺的工具。EM是材料、半导体、地质学、考古学，应用物理学和生物医学等数十个学科的研究工具，有非常高的分辨率和原子观察水平，是科学研究人员旅行微观世界最方便的工具之一。
EM由镜筒、真空装置和电源柜组成。镜筒主要由电子源、电子透镜、样品架、荧光屏和检测器等部件组成。样品可以稳定地放置在样品架上，并且通常有可用于更换样品的装置（例如移动、旋转、加热、冷却、拉伸等）。检测器用于收集电子或二次信号。真空装置用于保护显微镜内的真空，使得电子在其路径中不被吸收或偏转，它由机械真空泵，扩散泵和真空阀组成，并通过吸气管连接到镜筒。电源柜由高压发生器，励磁电流稳定器和各种调节控制单元组成。
EM是一种复杂的电光仪器，它使用电子束作为光源，使用电磁透镜进行成像，并结合特定的机械装置和高真空技术。EM技术的应用基于分辨率为0.2μm的光学显微镜。透射EM具有0.2nm的分辨率，并且透射EM是光学显微镜的1000倍。
EM是采用电子源作照明的一种显微镜，其分辨率已达到2～3Å的水平，普通的透视式EM高度自动化，1965年扫描EM成为商品，超高压EM也用于各方面的工作。
电子透镜用于聚焦电子，是EM桶中最重要的元件。通常使用磁性透镜，有时使用静电透镜。它使用与圆筒轴对称的空间电场或磁场，以使电子轨迹朝向轴弯曲以形成焦点。其功能与光学显微镜中的光学透镜（凸透镜）的功能相同，以聚焦光束。所以称为电子透镜。光学透镜的焦点是固定的，并且可以调节电子透镜的焦点，因此EM不具有像光学显微镜那样的可移动透镜系统。现代EM主要使用电磁透镜，其通过由具有极片的线圈产生的强磁场通过非常稳定的DC激励电流来聚焦电子。电子源是释放自由电子的阴极，栅格和加速电子的阳极。阴极和阳极之间的电压差必须非常高，通常在几千伏到3000千伏之间。它可以发射并形成均匀的电子束，因此加速电压的稳定性要求不小于万分之一。
分辨率是EM的重要指标，表示为可以分辨的两个相邻点的最小间距，这被称为仪器的最高分辨率：d=δ。显然，分辨率越高，即d的值越小（以长度为单位），仪器可以在观察到的物体之间区分的细节越多。分辨率与电子束入射锥角和穿过样品的波长有关。可见光的波长为300～700nm，电子束的波长与加速电压有关。EM（0.2nm）的分辨率远高于光学显微镜（200nm）的分辨率。光学显微镜的最大放大倍数约为2000倍，而现代EM的最大放大倍数超过300万倍。
就放大率而言，在物体被EM放大之后，在相同方向上的图像的长度与物体的实际长度的比率。
（1）在EM中，必须在真空中观察样品，因此不能观察到活样品。随着技术的进步，环境扫描EM将逐步实现对实时样品的直接观察。
（2）处理样品时可能产生样品不具有的结构，这加剧了之后分析图像的难度。
（3）由于强电子散射能力，可能发生二次衍射。
（4）由于图像是针对三维物体的二维平面投影的，因此有时图像不是唯一的。
（5）由于透射EM只能观察非常薄的样品，因此物质表面的结构可能与物质内部的结构不同。
（6）超薄样品（100nm以下），样品制备过程复杂困难，样品制备损坏。
（7）电子束可能会因碰撞和加热而损坏样品。
（8）EM购买和维护的价格都比较高。
EM按结构和用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等。
TEM以电子束穿透样品命名，然后通过电子透镜成像放大。通过改变物镜的透镜系统，可以直接放大物镜焦点的图像。由此人们可以获得电子衍射像，使用这个像可以分析样本的晶体结构。在该EM中，图像细节的对比度通过来自样品原子的电子散射形成。因为电子需要穿过样品，所以样品必须非常薄。构成样品的原子的原子量，加速电子的电压和希望获得的分辨率决定了样品的厚度。样品的厚度可以从几纳米到几微米变化。原子量越高，电压越低，样品必须越薄。样品的较薄或较低密度部分具有较少的电子束散射，因此更多的电子穿过物镜并参与成像，其在图像中更亮。相反，样品中较厚或较密的部分在图像中显得较暗。如果样品太厚或太稠密，图像的对比度将恶化甚至被电子束的能量损坏或破坏。TEM的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为数万至数十万倍。
TEM桶的顶部是电子枪。电子束通过样品并由中间镜上的物镜成像，然后通过中间镜和投影镜逐步放大，并在荧光屏或光学干燥板上成像。中间镜主要调节激励电流，放大倍数可以连续变化几十倍到几十万倍；通过改变中间镜的焦距，可以在同一样品的微小部分上获得电子显微照片和电子衍射图像。
SEM的电子束逐行扫描样品，主要用于观察固体表面的形态，也可以与X线衍射仪或电子光谱仪组合，构造电子微探针用于材料成分分析。入射电子使得样品表面被二次电子激发，显微镜观察从这些点中散射的电子，并且放置在样品旁边的闪烁晶体接收这些二次电子，通过放大、调制显像管的电子束强度，改变显像管荧光屏的亮度。图像是反映样本表面结构的三维图像。显像管的偏转线圈与样品表面的电子束同步扫描显像管的屏幕显示样品表面的形貌图像。由于这种显微镜中的电子不必传输样品，因此电子加速度的电压不必非常高。
SEM的分辨率主要由样品表面上电子束的直径决定。放大率是显像管的扫描幅度与样品的扫描幅度之比，其可以连续变化数十至数十万次。SEM不需要很薄的样品；图像有很强的立体感。
SEM的制造是依据电子与物质的相互作用。当高能入射电子撞击材料表面时，激发区域将产生二次电子，俄歇电子，特征X线和连续X线，反向散射电子和透射电子。并且在可见光，紫外线和红外区域产生电磁辐射。同时，还可以产生电子-空穴对，晶格振动（声子）和电子振荡（等离子体）。
由样品反射的电子束使其成像的EM，可对透明、半透明或不透明的样品进行观察。
EEM用于自发光电子表面的研究，微电子领域中微纳米结构的微观形态的观察和尺寸的测量。
在使用TEM观察金属之前，将样品切成非常薄的片（约0.1mm），然后继续电解抛光以使金属变薄，在样品的中心形成孔，电子可以通过非常薄的金属。机械研磨不能电解抛光的金属或不导电或具有差导电性的材料，例如硅，然后使用离子冲击处理。为防止非导电样品在SEM中积聚静电，其表面必须用导电层覆盖。接下来有六步：
1.固定 戊二醛用于硬化样品，单宁酸用于染色脂肪。
2.冷固定 将样品在液体乙烷中快速冷冻。
3.脱干 使用乙醇和丙酮来取代水。
4.垫入 样本被垫入后可以分割。
5.分割 使用金刚石刀片将样品切成薄片。
6.染色 诸如铅或铀的重原子比光原子具有更高的电子散射能力，因此可用于增加对比度。
EM是诊断肿瘤的新工具。例如，非色素性肿瘤、嗜酸性粒细胞瘤、肌源性肿瘤、软组织腺泡肉瘤和神经内分泌肿瘤，难以通过光学显微镜明确诊断，利用EM可以明确诊断。EM主要通过仔细观察超微结构来发现组织细胞的分化标志物，并诊断和鉴定相应的肿瘤类型。细胞凋亡与肿瘤密切相关。将为肿瘤的诊断和治疗提供科学依据。
EM观察组织细胞，生物大分子，病毒，细菌等结构，可以观察不同疾病的病理结构，也可以鉴别一些肿瘤疾病，EM技术可通过观察超微结构来区分癌症、黑色素瘤和肉瘤，以及腺癌和间皮瘤；胸腺瘤、胸腺类癌、恶性淋巴瘤和生殖细胞肿瘤；分化的神经母细胞瘤、胚胎横纹肌瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤和小细胞癌；纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤和恶性神经鞘瘤；梭形细胞癌和癌肉瘤。
细胞中的酶与底物相互作用，酶反应的产物作为反应物质，并在酶的作用位点捕获，使其在显微镜下可见。该反应在酶的作用下产生反应产物，并通过捕获反应间接证明酶的定位，称为酶的细胞化学反应。目前，EM可以找到三种主要的酶类型。通过电镜酶细胞化学技术（electron microscopy enzyme cytochemistry technology）间接证明酶的存在，可定性研究细胞的标志酶，以及正常和病理条件下酶变化与疾病之间的关系。
EM酶细胞化学技术比较复杂，影响因素较多，方法也不够稳定，近几年随着科学技术的发展逐渐引起人们的关注，开始在临床诊断和研究中使用。
酶促细胞化学反应实际上是孵育反应的过程。孵育的温度和时间可以基于不同的酶和组织通过实验确定。EM酶细胞化学样品在孵育后用柠檬酸盐孵育，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋和超薄切片，并在EM下观察。
酶的细胞化学反应涉及两个反应：第一反应是酶在底物上的反应，称为酶促反应，所得产物称为初级反应产物；第二反应是捕获剂与伯胺反应形成电子致密物质，其捕获反应并产生最终反应产物。
EM酶细胞化学有许多方法，金属盐沉淀法的原理是酶反应的主要产物与重金属结合形成不溶性电子致密物质，常用铅、锑等。嗜酸性粒细胞形成的原理是氧化酶与二氨基联苯胺（DAB）反应形成嗜酸性中间体，然后肼沉淀物与肼形成电子致密。
酶细胞化学应选择合适的固定剂类型、浓度、固定方法和时间。通常使用0.5%～2%戊二醛或4%多聚甲醛固定样品，切成5～100μm的切片用于细胞化学反应，反应后用常规柠檬酸固定、脱水、包埋、超薄切片，在EM下观察。冷冻切片可以最大限度地保持酶的活性，因此是光镜细胞化学中常用的方法。
1）光镜样品：
固定化（酶固定+结构固定）冷冻切片细胞化学（酶反应+捕获反应）。
2）EM样品：
固定化（酶固定+结构固定）切除组织细胞化学（酶反应+捕获反应），脱水包埋超薄切片，EM观察。
①取材：材料约为10mm×5mm×5mm。当摄取白细胞和愈伤组织时，使用细胞分离液分离外周血。取培养细胞时用橡皮刮。将游离细胞离心（800r/min）5分钟，凝固，用剃刀刀片切成厚片，并冲洗使用。②固定：分为血管灌注固定（10～15分钟），浸泡固定（15～30分钟），微波辐射固定（5～10秒），温度控制。③置换缓冲液：将组织板交换到缓冲液中以制备培养溶液，并将溶液更换3次，每次间隔为5～10分钟。④孵育：将组织板置于新制备的孵育溶液中，并在振动恒温水浴中温育。孵育温度和时间可以基于不同的酶和组织通过实验确定。⑤漂洗：在制备培养溶液时，首先用缓冲液冲洗平板，通常以5分钟的间隔冲洗三次，然后用0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液冲洗3次。⑥后固定：将用二甲胂酸钠制备的1%四氧化锇固定1～2小时。⑦包埋：梯度脱水，树脂浸渍和包埋根据超薄切片技术中的常规方法进行。⑧超薄切片：采用超薄切片染色，铀和铅染色。⑨对照试验：主要有去除孵育液中的底物；在孵育液中加入特定的抑制剂；高温使酶失活，通常为60℃，超过1小时可以使酶失活。
电子显微镜酶细胞化学是一种研究超微结构水平酶活性定位和变化的新技术。用此技术，有利于综合分析细胞的超微结构特征与酶活性分布之间的相互联系，研究不同生理和病理条件下酶的定位和代谢特征具有重要意义。近年来，研究者引用或改进了十八种酶（5’-核酸苷酶、核苷二磷酸酶、钠-钾-ATP酶、Mg 2+ -ATP酶、Ca 2+ -ATP酶、细胞色素氧化酶、腺苷酸环化酶、糖原合成酶、LDH、MAO、ALP、ACP、AChE、SDH、CMP酶、TPP酶、G6 P酶、NADP酶）的EM细胞化学方法，并应用于高压氧医学和脑肿瘤酶活性定位研究。
该技术结合了抗原-抗体反应的特异性和EM的高分辨率，是一种高度准确和敏感的技术，用于亚细胞和超微结构水平的抗原定位。用电子致密物质如铁蛋白标记抗体，然后使其与含有相应抗原的生物样本反应，通过EM观察可见电子致密物质的位置，识别抗原位点和抗体反应的方法称为免疫标记EM技术。酶免疫电子显微技术是利用酶的高效催化作用以响应其底物形成不同的电子密度，通过EM观察证明酶的存在以定位抗原。
该技术使用具有特异性标记的抗体与相应的抗原结合并在EM下观察。①完整保存细胞超微结构；②确保测试细胞或其亚细胞结构的抗原是原位的，并且其抗原性不会丢失；③选定的免疫试剂可以顺利地穿透组织细胞结构并与抗原结合。
根据不同的标记方法，分为免疫铁蛋白技术、免疫酶标记技术和免疫胶体金技术。例如，免疫铁蛋白技术通过低分子量双功能试剂将铁蛋白与抗体结合以形成双分子复合物。它保留了抗体的免疫活性，铁蛋白标记的抗体可通过EM免疫组织化学定位细胞中的抗原。
抗体可购买或自己制备。大分子完全抗原可以通过免疫动物如兔、山羊、豚鼠和小鼠直接获得。缀合剂用于将半抗原与大分子物质结合形成复合物，然后将其注射到免疫动物中以产生抗体。大分子物质被称为载体蛋白，最常用的是甲状球蛋白、牛血清白蛋白或血蓝蛋白。偶联剂是戊二醛或碳二亚胺。目前，通过细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体是最理想的。
1）标志物：
①电子密度致密标记，如铁蛋白、辣根过氧化物酶等。②放射性核素，如I、S、P、C、H等。③有独特形状的标记，如血蓝蛋白、噬菌体等。
2）固定剂：
①固定剂的要求：不损害细胞内抗原的活性；固定速度快、效果好；分子量小，易于渗透；固定后不会引起交联，这会导致空间阻塞并影响标记抗体进入抗原的位置。②影响固定的因素：采用固定剂的种类、固定剂的浓度、固定剂的pH、固定剂通常在2～4℃冷固定、固定时间与温度/缓冲系的离子强度/细胞类型有关。
3）非特异性吸附：
非特异性吸附与酶标记抗体，抗血清稀释，染色时间，温度和培养基有关，最重要的是抗血清和标记抗体的稀释。通常认为将高滴度抗血清或标记的抗体稀释至低蛋白质浓度用于标记染色以获得最期望的结果，因为低蛋白质浓度有利于减少非特异性吸附。实际应用的蛋白浓度大致在0.50～2mg/ml。工作滴度通常在1∶20～1∶400的范围内。必须将非特异性吸附降低到非常低的水平。通过使用标记的抗体或抗血清选择工作浓度为1∶2、1∶4、1∶8……1∶256进行稀释，对已知阳性标本进行染色观察，取正沉积物，并以非特异性吸附最小稀释度作为工作浓度。
4）标记染色法：
标记染色分为直接染色和间接染色。前者的特征在于高特异性，低敏感性，并且标记的抗体仅可用于检测抗原。后者更敏感，标记的抗体可用于检测多种抗原，缺点是特异性较差。
1）单细胞：
培养细胞或血细胞应随用随取。悬浮培养细胞可先离心，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗1次后进行固定。贴壁细胞可在载玻片上培养，然后用PBS轻轻冲洗并立即固定。
2）组织：
越快采取组织快越好。如果观察对象是软组织，如肺、脑、脊髓或内分泌器官，应通过灌注固定，然后用锋利的刀片切成约2mm×2mm×1mm的组织碎片。切割时避免切割和拉扯，然后将其放入定影液中继续固定。
3）免疫电镜固定：
为了准确定位或定量抗原，并观察活体状态下细胞的超微结构，有必要选择合适的固定剂并小心处理样品。固定剂通常对抗原的活性具有不同程度的影响，以保持细胞的超微结构和抗原的活性，固定剂的种类、浓度、温度、pH、固定时间和方式应通过初步试验确定。可以用已知效力的抗原进行测试，并且可以选择合适的固定方法。
1）灌注固定：
解决这种影响的最佳方法是保持超微结构。以大鼠为例，麻醉后，用注射针通过左心室将固定针灌注到主动脉中，静脉压为120mmHg。在5～15分钟内每200g体重灌注150ml固定液。
2）浸没固定：
将手术或灌注后切开的标本浸入固定液中，浸泡固定时间一般为2～5小时，游离细胞固定0.5～1小时。
1）包埋剂类型：
环氧树脂包埋剂和低温包埋剂。
2）包埋前免疫标记：
首先对固定的样品进行免疫标记，然后包埋，超薄切片并观察，通常使用环氧树脂包埋剂。环氧树脂具有固有的疏水性，在嵌入之前必须完全脱水，然后在培养箱中热聚合。热聚合使大多数抗原变性，因此包埋剂在嵌入后不适合免疫标记。
3）包埋后免疫标记：
固定组织标本并树脂包埋，制备超薄切片，然后进行免疫化学标记。该方法使用低温包埋剂，如Lowicryl系列包埋剂，LR White包埋剂和LRGold包埋剂。所有三种包埋剂都可以在低温（-80～-35℃）下用紫外线（波长315～360nm）聚合，避免高温对抗原性的负面影响，提高阳性标记率，并且对胶体金的非特异性吸附较少。温度敏感抗原应使用低温包埋剂。
根据免疫标记与标本包埋的不同关系，可分为预嵌入免疫标记、嵌入免疫标记和冷冻超薄切片免疫标记，无须嵌入。根据具体标本，抗原的位置和性质，以及实验室的具体情况选择合适的方法。三种免疫标记方法包括基本步骤，例如阻断非特异性位点，抗体对抗原特异性结合的免疫反应，以及反应位点的痕量显示。
为了确认免疫标记结果的特异性，必须同时进行对照试验。在抗体的特异性没有问题的前提下，对照试验具有以下类型：
1）用来自相同类型的未免疫动物的正常血清替换一抗，结果应为阴性。不加一抗，结果应为阴性。
2）用不含靶抗原的标本进行免疫标记，结果应为阴性。明确含有靶抗原的标本的免疫标记应为阳性。
观察EM下免疫标记的结果，并通过标记（胶体金，铁蛋白或酶底物）显示免疫反应位点以确定抗原的存在。应注意区分特定标记和背景的非特异性标记，以进行适当的结果分析。在已知存在阳性和阴性样品的前提下，棕色颗粒的存在表明存在抗原性抗体。同时，观察到病毒颗粒的存在并判断为阳性（+），否则为阴性（-）。
免疫电子显微镜为抗原亚细胞定位提供了强大的工具，是一种快速病毒诊断的新方法。近年来，一些科学家使用不同的标记在EM下表现出不同的形态和电子密度特征，双标或多标免疫电子显微镜技术可用于同一系统。同时，观察到不同抗原和受体在细胞表面和细胞结构上的定位。该技术主要用于病毒和细菌的抗原定位，免疫疾病的发病机制和超微结构免疫细胞化学研究。
原位杂交（in situ hybridization，ISH）是应用生物化学中核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridization）的原理，用于在组织切片、细胞涂片或印迹上原位检测DNA或RNA序列的技术；是一种将分子杂交与组织学相结合的技术，也称为杂交组织化学、细胞杂交（cytological hybridization）或原位杂交组织化学（in situ hybridization histochemistry）。
核酸分子杂交的基本原理是利用核酸分子（DNA、RNA）的碱基对形成氢键互补（A=T，A=U，C=G），使用标记的核酸探针检测与碱基互补的靶核酸，这类似于免疫学中的抗原-抗体反应。
优点：分子杂交具有很强的特异性，高敏感性和组织化学染色的可见性；新鲜组织和石蜡包埋组织均可用于回顾性研究；所需样本量小，可用于细针抽吸和细胞涂片；特定基因（例如癌基因，病毒基因）DNA、mRNA的广泛应用对杂交电子显微镜的定位，定性和定量，组织细胞分布和亚细胞定位研究进行表达。
探针是含有互补序列的外源标记的DNA或RNA片段，并且是用于在原位杂交期间检测细胞中特定DNA或RNA的特定序列的特殊试剂。探针的碱基序列是已知的，并且只能与特定的核酸分子组合。用于原位杂交的探针有不同类型，可用于检测不同的靶核酸。
原位杂交技术可根据标签分为EM放射性原位杂交技术和EM非放射性原位杂交技术。原位杂交技术使用放射性核素作为标记，敏感性高、标记不干扰杂交反应、结果适用于定量分析。常用的几种放射性核素 3 H、 35 S、 125 I和 32 P已经用于EM原位杂交，但每种都有其自身的优点和缺点。
由于没有放射性污染，原位杂交技术不需要长时间放射自显影，并且杂交信号的亚细胞定位甚至优于核素探针。因此，存在取代放射性原位杂交技术的趋势。其中，洋地黄毒苷标记的探针具有操作简单，敏感性高，背景低的特点，已成为最广泛使用的标志物。
原位杂交技术可分为预嵌入EM原位杂交，嵌入EM原位杂交和非嵌入EM原位杂交。
1）从理论上讲，预嵌入EM原位杂交的敏感性高于嵌入EM原位杂交的敏感性，因为前者可以观察整个切片厚度的信号。然而，探针不一定穿透整个切片。为了增加渗透性，经常使用冻融方法或蛋白酶和洗涤剂，可导致一些细胞内组分如核糖体的损失。在严重的情况下，它将导致超微结构的形态变化。更不利的因素是混合探针不能在没有强渗透性处理的情况下以更大的金交联（＞5nm）显示。或者，可以使用过氧化物酶交联和超微胶体交联（＜1nm）。过氧化物酶可以用二氨基联苯胺开发，但缺点是分辨率太低而且反应产物不能定量。超微交联产物太小而不能在显微镜下直接观察，并且在用银染色后几乎看不到，还可能产生一些不规则尺寸的银颗粒，这阻碍了靶的精确定位。此外，银染增强可对超微结构产生负面影响。
2）嵌入EM杂交是一种较好的方法，不仅保持了良好的超形态结构，而且具有合理的敏感性。由于仅标记了切片的表面，也可以使用较大的金交联剂来显示杂交探针。亲水树脂（如LowicrylK4M、HM20、LRWhite、LRGold及Bioacryl）明显优于传统的EM包埋剂（如Epon和Araldite），因为前者的亲水性极大地增强了探针接近靶核酸序列的能力。一些非嵌入方法，例如经常提到的冷冻切片技术，结合了预嵌入和嵌入方法的优点。也就是说，探针接近靶核酸序列的能力高，并且很好地维持了超微结构。然而，这种方法也有缺点，例如设备昂贵、要求技术人员操作熟练，以及切片对变性非常敏感，导致超微结构和靶核酸序列的部分丧失。人们已经使用这种技术来研究在软体动物神经元的轴突中编码神经肽mRNA的超微结构定位。
3）冷冻超薄切片技术是开发用于研究更接近生物体生活状态的结构和功能的EM样品制备技术。在样品冷冻和固定后，它是一个薄片，样品结构可以很好地保存，样品前后不需要强化学处理；可提取小的可溶性组分，使EM图像更接近生物的生活状态。它可用于细胞免疫化学可溶性组分的自我开发，特别是在X线微区域组分分析中。
冷冻超薄切片机操作：可以在超薄切片机中添加高压冷冻机。
该技术为基因定位和表达，基因进化，发育生物学，肿瘤学，微生物学，病毒学，医学遗传学和遗传分析等领域的研究提供了极有价值的信息，发挥了其他技术难以取代的作用。
（杜 清）