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CRISPR可编码CRISPR来源的RNA（CRISPR-derived RNA，precrRNA）和反式激活crRNA（trans-activating CRISPR RNA，tracrRNA），prerRNA序列的重复区域，其与tracrRNA序列互补结合，从而介导prerRNA加工和释放成熟crRNA。成熟的crRNA与tracrRNA结合形成单一的指导RNA（sgRNA），sgRNA序列中20bp序列可以在基因组中找到所需的靶序列。靶序列与sgRNA互补配对成功则可激活Cas9蛋白识别靶基因上游的PAM（protospacer-adjacent motifs），从而导致蛋白构象发生改变，发生靶DNA的双链断裂，并且通过非同源末端连接修复或同源重组来编辑基因。
CRISPR/Cas系统首先在细菌的天然免疫系统中被发现，主要用于抵抗入侵病毒或外源DNA。1987年，当日本学者研究大肠埃希菌编码的碱性磷酸酶基因的编码区时，在下游区域发现29bp重复片段和32～33bp间隔片段连接的重复序列。即所谓的“成簇的规律间隔的回文重复序列”。2002年，该序列正式被命名为CRISPR。
CRISPR/Cas系统由CRISPR（包括前导序列、重复序列、间隔序列和回文重复序列）、Cas蛋白和一些非编码RNA组成。前导序列是与转录相关的保守序列，位于CRISPR的上游。原始间隔区位于原型间隔区相邻基序的两侧，并在细菌免疫的第一阶段产生间隔序列。间隔序列由病毒或质粒的核酸衍生而来，常被作为识别元件去寻找与之相匹配的序列并摧毁它。回文重复序列对于间隔序列在基因座的位置和方向起决定性作用。tracrRNA位于CRISPR相关基因Cas和前导-重复-间隔区阵列链的相反方向，介导prerRNA的成熟以获得crRNA。
Cas蛋白质复合物是由CRISPR基因附近的基因簇编码的结构域，有核酸酶、解旋酶、整合酶、聚合酶等，以及各种RNA结合蛋白质特性的结构域。由于Cas蛋白复合物与CRISPR序列共同进化和相互作用，因此将其命名为CRISPR相关基因。在原核基因组中，目前有超过40个Cas蛋白家族，它们在外源DNA的crRNA形成、整合和切除中起重要作用。
依据CRISPR/Cas系统中Cas蛋白的种类和同源性，该系统被分为Ⅰ～Ⅴ型，后两型为新引入的类型。此外，可根据Cas编码的效应子复合物，将其分为“1”类和“2”类。1类系统具有多个crRNA复合物亚基，而2类系统效应复合物均为Cas9。根据Cas蛋白操纵子基因的组成和结构，三种类型的CRISPR系统进一步分类为Ⅰ-A、Ⅰ-B、Ⅰ-C、Ⅰ-D、Ⅰ-E、Ⅰ-F、Ⅰ-U型；Ⅱ-A、Ⅱ-B、Ⅱ-C型和Ⅲ-A、Ⅲ-B、Ⅲ-C、Ⅲ-D型。
当病毒侵入时，CRISPR/Cas系统Cas1和Cas2编码的蛋白质扫描外源DNA并识别病毒的原始间隔区（PAM，由NGG的三个碱基组成并找到原始的间隔序列），然后截取原间隔序列，并且在其他酶的帮助下，将原始间隔序列插入相邻CRISPR序列的前导区域的下游。DNA修复后，将打开的双链缺口闭合。通过这种方式，新的区间序列被添加到基因组的CRISPR序列中（图3-8-1）。
图3-8-1 外源DNA的俘获
目前的研究发现，CRISPR/Cas系统有三种方式（Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型）识别外源DNA的切除。TypeⅠ、Ⅲ由于参与的蛋白众多，需要几个复合物共同作用才能发挥作用，它们不宜操作和改造。CRISPR/Cas9系统是Ⅱ型，是最成熟和最广泛使用的类型。当病毒侵入时，CRISPR序列在引导者的控制下转录两个RNA：pre-crRNA和tracrRNA。其中，pre-crRNA是从整个CRISPR序列转录的大RNA分子，tracrRNA是从重复区域转录的发夹样RNA。随后，pre-crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白将会进行组装。它将根据病毒DNA选择相应的间隔RNA，并在RNase Ⅲ的帮助下切割，最终形成短的成熟crRNA（含有单一类型的间隔RNA和部分重复区域）；然后，crRNA、Cas9及tracrRNA组成复合物（图3-8-2）。
图3-8-2 crRNA合成
Cas9是一种核酸酶，可在组装Cas9/tracrRNA/crRNA复合物后精确切除外源DNA。该复合物将扫描整个外源DNA序列并识别与crRNA互补的原始间隔序列。此时，复合物将定位于PAM/原始间隔区序列，并且DNA双链体将被展开以形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链保持游离。随后，Cas9蛋白的HNH结构域核酸酶活性将切割与crRNA互补的DNA链，而其RuvC结构域活性位点将切割非互补链。最终，外源DNA双链断裂（DNA double strand break，DSB），病毒被排除（图3-8-3）。
图3-8-3 Cas9蛋白的HNH酶活性剪切
最新的CRISPR/Cas9系统由两部分组成，一部分是核酸酶Cas9，可以切割基因，另一部分是精确定位的sgRNA。sgRNA将CRISPR/Cas复合物引导至靶基因的位点，并且Cas9蛋白切割靶基因。当CRISPR系统引发双螺旋DNA断裂后，可通过非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）或同源定向修复（homology directed repair，HDR）两种修复方式来实现基因编辑（图3-8-4）。
图3-8-4 CRISPR/Cas的剪切与修复
Cas13（C2c2）于2016年由张峰实验室发现，该实验室不仅在单一crRNA的指导下切割ssRNA或mRNA，而且还具有非特异性的ssRNA的切割功能，使用Cas13和可猝灭的ssRNA报道基团的混合RNase活性，通过重组酶聚合酶扩增（RPA）步骤快速检测单个DNA或RNA分子。在crRNA的指导下，Cas13识别并结合靶RNA序列，刺激其对周围ssRNA分子的非特异性切割。活化的Cas13切割可猝灭的荧光RNA，产生指示靶RNA存在的可量化信号。为了提高分析的敏感性，样品的DNA或RNA首先经过RPA或RT-RPA扩增。RPA与T7转录结合并直接将扩增的DNA转化为RNA，用于随后的Cas13检测。它检测血清、尿液和唾液中的低浓度病毒，并确定病毒载量以区分不同菌株；还对人类DNA进行基因分型，并识别游离DNA中的低频癌症突变。此法被命名为SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）法（图3-8-5）。
SHERLOCK也存在一些限制。第一个限制是量化，因为系统依赖于DNA的预扩增，这导致报告基团饱和。SHERLOCK v2在预扩增步骤中使用较少的引物，以在不影响敏感性的情况下实现更好地定量。SHERLOCK的第二个限制是它依赖于荧光，这需要额外的设备来获取数据。因此，研究人员改进了SHERLOCK v2，以便切割报告组可以被测试条检测到。通过测试条上的条带数，可以确定目标DNA或RNA是否存在于特定样品中。SHERLOCK v2是一种具有高敏感性和高特异性的核酸检测方法，并且快速、便携、易于使用。未来具有广阔的应用前景，包括临床诊断（如病原体或病毒检测）、治疗和基因分型。
图3-8-5 SHERLOCK法原理
Cas12a（Cpf1）是CRISPR/Cas核酸酶的一种变体，与Cas9一样能够切割dsDNA。然而，Cas12 a识别不同的PAM位点，催化其自身指导RNA的成熟，并在dsDNA切割后产生5＇和3＇交错末端，使其特别适合于基因编辑。在crRNA靶向靶dsDNA后，Cas12a也以非特异性方式切割ssDNA。这种非特异性的转换显示了多次周转事件（每秒约1250次）。于是，Doudna实验室便利用Cas12a的DNA酶活性开发出高度灵敏的DNA检测平台DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）。
DETECTR通过crRNA靶向特定DNA序列，例如人乳头瘤病毒（HPV）基因组。同时，加入ssDNA-荧光猝灭（FQ）报告基团，其在ssDNA降解时产生信号。为了提高敏感性，首先通过RPA扩增DNA。当Cas12a-crRNA与目标dsDNA配对时，Cas12a的DNase活性启动。随后，周围的ssDNA被降解，包括ssDNA-FQ报道基团，并且荧光信号的释放表明存在或不存在感兴趣的DNA。
研究人员已利用DETECTR方法来检测HPV。DETECTR可在一小时内准确区分人类细胞中两种相似的HPV亚型，如HPV 16和HPV 18（图3-8-6）。
图3-8-6 DETECTR法原理
研究人员建立了一种鉴定CRISPR/Cas9构建的突变细胞株的方法——基于竞争的PCR（cbPCR）原理。首先设计3条引物，一对引物分别结合于突变位点的上下游，称之为“外引物”，所扩增产物称之为“外扩增子”。第三条引物覆盖了Cas9剪切位点，称之为“内引物”，与下游“外引物”共同扩增产物称之为“内扩增子”，使其能够鉴定纯合突变克隆。内引物Tm值不超过60℃，3’端自剪切位点延伸3个碱基。当3条引物共同进行PCR反应时，内外引物互相竞争底物（dNTPs），当一条模板链同时结合了上游外引物和内引物时，内引物会阻止外引物延伸，外扩增子还可以作为内扩增子的模板，反之则不可。当gDNA来自突变型时，内引物结合效率低下，竞争平衡向外引物倾斜，所得外扩增子比例远高于内扩增子。PCR产物电泳可见一条清晰的较长的外扩增子片段。而当gDNA来自野生型时，内扩增子比例增高，PCR所得产物电泳，可见一长一短两条信号都略弱的内外扩增子片段。该技术可用于鉴定基因序列中的点突变。
通过CRISPR/Cas9方法建立的模式动物的等位基因突变无法通过传统的PCR方法鉴定，为确切鉴定小的插入缺失突变，人们开发了PCR连接检测反应技术。设计用于小插入缺失的引物和由CRISPR/Cas9方法编辑的已知等位基因的单核苷酸突变序列，包括：5’端磷酸化的普通引物，结合于待测等位基因下游，5’端磷酸化为进一步的连接做准备；等位基因特异性序列探针，在25’末端具有荧光基团。
当待测位点为野生型时扩增产物可以通过LDR反应与下游普通引物的扩增产物连接，形成长片段扩增产物，而发生突变时荧光引物无法向下游扩增，其产物则无法与下游普通引物的扩增产物连接，最终产生一种带有荧光的短片段产物和不带荧光的短片段产物。野生型与纯合敲除型各自获得一长、一短的荧光扩增产物，而杂合型产生不同长短的两种荧光产物。在电泳后获得不同长度的、有荧光的条带，从而鉴定基因型。
研究人员通过这种方法成功鉴定了Asxl3敲除小鼠和斑马鱼的基因型。相较Sanger法测序、T7内源性核酸酶I（T7EI）、HRMA、等位特异性PCR（ASPCR）、限制性片段长度多态性（RFLP）和Surveyor法（Cel1）等方法，该方法允许更快和更容易地鉴定由CRISPR/Cas9方法建立的模型小动物中的插入或缺失突变。
检测突变DNA是精准医学的关键，但是低频DNA突变是很难检测到的。有学者研发的CRISPR/Cas9结合阻断PCR技术，精准度与T7EI检测类似。该方法首先以PCR扩增目的DNA，利用体外转录获取Cas9蛋白和sgRNA对PCR产物进行切割，设计阻断引物以阻断PCR，并最终计算靶片段的突变率。笔者利用此方法检测EGFR和HBB体细胞突变，基于CRISPR/Cas9断裂PCR方法的突变检测率为1%～10%，结合阻断PCR的突变检测率可达0.1%。
基于Cas9核酸酶，Cas9/sgRNA用于切割目的DNA，反向PCR用于检测靶DNA，称为CRISPR/Cas9结合反向PCR技术（CRISPR-or Cas9/sgRNAs-associated reverse PCR）。该方法利用设计特异性的sgRNAs靶向识别目的DNA，引导Cas9截取目的片段，待Cas9失活后利用T4连接酶使目的片段首尾连接，分子内或分子间连接，反向PCR引物的设计和目标片段的PCR扩增。该方法已用于宫颈癌细胞中HPV16和HPV18的DNA检测。
基于Cas9核酸酶对靶向DNA进行简单、特异、敏感的检测和分型的PCR技术，称为Cas9-sgRNA/CRISPR分型PCR（ctPCR，Cas9-sgRNA-or CRISPR-typing PCR）。该方法首先使用通用引物PCR（用于检测靶DNA的PCR1）来扩增DNA片段，然后特异性sgRNA/Cas9切割扩增的DNA片段。将切割后的DNA片段两端添加polyA尾，最后利用特异性的引物（general-specific primers，gs primer，PCR2），进行分型扩增目的片段。使用ctPCR检测和分类13种高危HPV中的HPV16和HPV18 L1基因。还检查宫颈癌细胞和组织HPV16和HPV18中的L1和E6-E7基因。
CRISPR多态性与肠出血性大肠埃希菌的血清亚型相关。因此，研究者利用rfbEO157、stx1、stx2和eae建立四联CRISPR阵列并进行实时PCR检测，该方法检测E.coli O157：H7的阳性率为97.2%，而stx和/或eae的阳性率为78.2%。
基于dCas9/sgRNA的DNA-FISH系统可快速诊断耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。首先将Ecoli BL21 Rosetta 2（DE3）转化带有Cas9基因质粒，扩增并诱导其表达Cas9蛋白，提取纯化后得到Cas9蛋白，合成靶向特异性序列，在T7启动子序列和支架模板特定序列之间整合约20bp长的sgRNA的DNA模板，通过PCR扩增sgRNA编码模板并在体外转录成RNA。切割MRSA菌株，提取基因组DNA，并将靶向Cas9-sgRNA的基因组DNA复合物与Ni-NTA磁珠一起温育。行Pull-Down实验，洗脱后加入SYBR Green I（SGI，DNA荧光染料）进行定量检测。由此方法衍生出的改良Microarray方法可以获得同样的检测结果，具体如下：His标签Cas9-sgRNA复合物被预制在Ni-NTA处理后的环氧功能化载玻片上，将MRSA基因组DNA滴在载玻片上孵育后加入SG I后检测荧光信号。该方法更简便、快速和高度敏感。
固体纳米孔是用于疾病检测的潜在生物传感器平台，通过dCas9介导的纳米电流体动力学实现靶基因的液体活检。具体原理如下：dCas9复合体中含有sgRNA可与靶基因的原间隔相邻的PAM附近DNA结合，dCas9复合体一旦结合PAM附近的DNA链，根据纳米电流体动力学则会降低其流动速度造成堆积现象。但当DNA序列与sgRNA出现不匹配时，dCas9复合体则不会结合DNA，游离的DNA泳动速度则要快于dCas9复合体结合的靶基因。将待测体液与含有dCas9复合物的纳米颗粒一起温育。将孵育好的混合液体滴加到纳米电泳装置的阳极区，电泳后经过显色装置显色1～10分钟，即可判断体液中的靶基因含量。
（郑华川）