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微流控（microfluidics）技术是将微管道结合操纵微小流体的系统，通过微电子机械系统（micro-electro-mechanical systems，MEMS）技术在固相表面构建微生化分析单元和系统，进而实现对多种靶分子（如无机离子、有机物质、蛋白质、核酸等）的准确、快速检测，以获得大量信息。该技术的主要特点是小型化、集成化和智能化。
微流体芯片通过微制造连接微通道、微泵/阀、液体存储（功能）单元、电极、检测单元等。将各功能元件整合成如集成电路一般，从而实现在芯片上进行靶分子的处理与分析。根据实际领域和目的，微流体芯片具有不同的配置。微流控芯片中一个重要的设计就是微流控制，对微管道液体的精准控制可能通过多种方式，如微泵驱动、微阀控制、微通配置控制、芯片通道表面特性控制（聚合物涂层，分子修饰）。其中，电渗控制、微阀控制、层流和分子扩散应用是常见的。
早期主要以硅材料为主，因硅材料化学惰性好、热稳定，光洁度佳，且其加工工艺成熟适合用于制造聚合物芯片的模具。然而，其还具有不可避免的缺点，如易碎、昂贵、电绝缘性能不足及复杂的表面化学行为性，因此限制了其应用。玻璃石英材料具有电渗性好和光学性能佳特点，可通过化学方法进行表面改性，还可以通过光刻或蚀刻技术加工，亦可用于制造微流体芯片。但对其进行光刻和蚀刻技术的工艺复杂、费时、制作成本高，因此限制了玻璃微流体芯片的应用。有机聚合物材料成本低、品种多、能通过可见光与紫外线、可用化学方法进行表面改性、易于加工，并且可实现低成本大量生产，因此是目前应用于基质的主要材料。
微流体芯片的加工受制于材料的加工。由于微流体芯片的制造工艺主要是基于半导体和集成电路芯片制造所用的光刻和蚀刻技术。随着新材料的广泛应用，微流控芯片的基质也有了丰富的选择，因此加工工艺也随之发生变化，目前较为广泛应用的基质材料，如硅片、玻璃和石英等基质材料上都可以加工且工艺十分成熟，主要有成型方法、热压方法、LIGA技术、激光烧蚀技术和软光刻方法。
伴随着生物传感性技术的进步，新型的生物传感器整合于微流控芯片使得其在核酸、酶、DNA探针等都有了很大进步，特别是近年来电化学、光学和压电传感器已被广泛使用。可以快速生物传感针对不同类型癌症的分析物，如基因组水平、转录、蛋白质、细胞等均有较好的应用。近年来，由电、磁、光和声控制的数字微流体（DMF）取得了很大进展。此外，微流控芯片可以通过整合多个优势元件，实现快速、准确检测，并逐渐向低价格、床旁（point-of-care-test，POCT）不断优化（图3-7-1），从而更加方便地实现肿瘤的精准医疗。
图3-7-1 采用玻璃刻蚀技术的ELISA分析技术
外泌体作为肿瘤标志物近年来越来越受到关注，但外泌体的提取很难突破，距离临床应用也有很长的研发过程。微流控在外泌体分离方面有着显著的优势，近年来也依据多种原理，通过设计微流控装置来实现对外泌体的分离与检测。利用外泌体的大小、特征性的蛋白、密度等特性，可以设计专门的微流控芯片来实现外泌体的分离，甚至分离与检测的整合平台。依据免疫学原理，通过将特异性的抗体整合于微流控平台，从而实现外泌体的分离与检测已经有了很多的实践。将抗体与磁珠结合或是直接将抗体包被于芯片的表面，通过设计特异的结构来提高外泌体的捕获效率。依据外泌体的大小，设计特异的结构来实现筛选亦是近年来微流控对外泌体捕获的主要途径。微流控芯片在设计制造已经可以达到纳米级的尺寸，因此对于构建滤网结构来实现外泌体的分离已经取得系列进展。但设计过程还要考虑样本来源、流体控制等诸多环节，因此通过整合多个功能元件开发更加有效的芯片用于外泌体的分离是未来的方向。
微流控芯片在循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）中的应用类似于外泌体。然而，因为CTC的体积明显大于外来体，所以微流体芯片在CTC分析中更有利。CTC往往有特征性的蛋白，如EpCAM、N-Cadherin、O-Cadherin、VCAM-1、ICAM-1、CEA、hMUC1、EphB4、CD44、CD133、CD146、PSMA、HER2、EGFR、TROP-2、FAPa等，都可以作为分选的依据。另外，CTC具有一些生理特征，例如尺寸、可变形性、密度、电导率等，它们也可以作为CTC分选的基础。根据CTC的特点，微流控芯片在CTC分选方面具有明显的优势，例如CTC的分选效率高、敏感性好、纯度高、处理样本量大、获得量大。基于微流控芯片的CTC分离方法主要分为四类：①使用的抗原-抗体反应的富集；②基于大小的正浓缩；③基于大小的负浓缩；④整合浓缩方法。他们各有自己的优势，在不同的研究中可以通过选择或适当整合来达到应用的目的。
近年来生物打印、微流体技术及生物材料的应用使得肿瘤细胞的3D培养成为现实，可用于探索癌症的细胞内和细胞间信号转导，肿瘤-基质相互作用，以及肿瘤细胞与细胞外基质或细胞免疫系统的相互作用，对于更全面地了解肿瘤的生物学特性具有重要意义。基于微流体芯片的肿瘤细胞的3D培养可以集成各种传感器用于研究，如肿瘤药物的开发、肿瘤患者药物个体化选择、肿瘤的生物学行为的研究。
流式细胞术是集光学，机械，流体力学，电子计算机，细胞生物学，分子免疫学等学科的综合应用技术。该技术已经成熟用于快速定量测定和分析高速流动细胞或亚细胞。该技术具有检测速度快和统计精度高，并且可以对同一个细胞同时测量多个参数等特点，因此在多个学科领域被广泛地应用。
流式细胞术的特殊属性允许检测和计数复杂细胞混合物中的特定细胞类型。流式细胞仪是用于检测和计数悬浮液的细胞组分的仪器。流式细胞仪涵盖三个组件的协调使用：射流、光学和电子系统。
细胞仪通过加压鞘液使细胞在流经流动的细胞时形成单列聚焦。当细胞与仪器的激光束相交时，产生相应的信号。
当光子被光电倍增管（PMT）收集时，它们会产生对数级的电信号扩增后送计算机进行存储和分析。
流式细胞仪的计算机控制流式细胞仪的功能，存储数据并提供数据分析软件。PMT产生的信号被数字化，并与PMT检测到的散射激光或荧光量成正比。数字信号以通道号的形式存储在几个刻度上，由操作员指定。对于每一个被检测的细胞，都会产生和存储几个参数，包括正向散射和侧向散射，以及4或5个荧光参数。
流式细胞分析具有高速测定细胞（万个/s），大样本计数；检测稀有细胞或微粒（0.5～50μm）；多参数测量与分析；高分辨率、高敏感性；可以进行细胞分选，且分选纯度高。
1.对细胞进行鉴别和计数。
2.通过对细胞功能的检测，如细胞表面/细胞质/细胞核特异性抗原、细胞活性、细胞内因子、酶活性、激素结合位点、细胞受体等，对临床诊断和免疫状态判断进行支持。具体有利用微粒作为传统免疫分析、亲和分析或DNA杂交分析的固相载体，随后在流式细胞仪上对白细胞介素、转化生长因子、集落刺激因子等进行分析；或采用多种强荧光核酸特异性染料对不同病毒科的代表进行染色，并配合流式细胞仪进行检测，可直接检测和鉴别多种不同病毒等。
3.肿瘤的发生、发展及预后与机体的免疫功能密切相关。流式细胞术可以对细胞因子和特异性淋巴细胞亚群进行分析，还可以通过DNA倍体分析对肿瘤的性质进行判断；通过监测患者淋巴细胞亚群来监测疗效。
4.流式细胞仪可以作为细胞组学的定量工具，如细胞相对定量，细胞绝对定量，细胞膜蛋白表达定量，可溶性蛋白绝对定量等。
淋巴细胞分化抗原参与免疫反应或免疫记忆的形成，调节机体免疫反应的强度，淋巴细胞分化抗原检测可以评估免疫功能，从而在肿瘤患者上实现多种应用。
流式细胞术利用propidium（PI）与DNA结合的特性，利用其荧光强度与DNA含量成正比特点，可以用于检测细胞内DNA含量，进而来检测细胞中的DNA含量来确定细胞周期。
凋亡的早期变化发生在细胞膜的表面，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是带负电荷的磷脂，其主要存在于细胞膜的内表面上，当细胞凋亡时位于细胞膜上。该磷脂分布的不对称性被破坏，PS暴露于细胞膜。膜联蛋白V是钙依赖性磷脂结合蛋白，最初被认为是具有强抗凝血特性的血管蛋白。因此，蛋白质充当敏感探针以检测暴露在细胞膜表面上的PS。PI是一种核酸染料，不会穿透完整的细胞膜，但可以进入晚期细胞和凋亡的死细胞，细胞被染成红色。膜联蛋白V/PI双染可检测细胞凋亡，可区分早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞和死亡细胞，目前广泛应用于细胞凋亡的检测。
大量研究指出，实体瘤患者的外周血中存在肿瘤细胞，这些CTC可能是肿瘤广泛传播的重要原因。对血液循环中的肿瘤细胞进行监测，可以判断临床分期和疗效。流式细胞术可以通过多色标记白细胞共同抗原CD45，上皮细胞角蛋白（CK）和肿瘤特异性单克隆抗体来对循环肿瘤细胞进行分析。
近年来，单细胞测序技术得到了迅速发展，单细胞测序主要包括单细胞DNA测序、RNA测序和表观基因组测序。这三种测序从不同角度揭示细胞各阶段的功能和特征。表观遗传测序可以揭示DNA甲基化，组蛋白修饰和染色体空间结构的不同方面的基因调控。单细胞测序流程主要包括三个部分：单细胞分离，核酸序列扩增和基因测序数据生物信息学分析。
这是一种相对常见的直接分选单细胞方法，具有成本低的优点。
优点是可以快速获得单细胞，但成本高、通量低、染色体片段容易丢失，这常常导致RNA降解。
该方法的优点是高通量，自动分离单个细胞，这是目前最广泛使用的单细胞分离技术。该方法通过其物理性质和特定分子标记鉴定和分离靶细胞。该方法的缺点是需要大量的细胞悬液，检测到的荧光信号强度有限，因此不适合分选低丰度的细胞。
原理是在微流控芯片上使用微管进行各种单细胞分选。该方法的优点是DNA和RNA的样本量小，检测试剂的损失小，细胞污染的风险低，可以实现大规模的推广和应用。因此，微流体技术是最理想的单细胞分离方法之一，具有非常广阔的应用前景。
单个细胞中含有的DNA和RNA的量非常小，通过全基因组扩增和全转录组扩增，获得高保真，无偏移的足够DNA和RNA是单细胞测序中最重要的部分。
单细胞基因组扩增最早出现的是基于PCR方法衍生出来的一系列扩增手段，其中包括连接锚定PCR（LA-PCR）、引物延伸与扩增PCR（PEP-PCR）和简并寡核苷酸引物PCR（DOPPCR）。通过这些方法可以在全基因组范围内获得非常均匀的扩增产物。然而，其缺点是扩增产物具有低的全基因组覆盖率和高的非特异性扩增。多重置换扩增技术（MDA）是最常用的全基因组扩增技术之一。该技术采用噬菌体ψ29DNA聚合酶在恒定温度下进行DNA扩增，从而获得高保真，高覆盖，均匀，完整的全基因组序列。此外，改进的多重退火循环扩增方法（MALBAC）使用半线性循环扩增方法通过链置换反应合成全扩增子，有助于获得高覆盖度和高度均一的DNA扩增产物，以确保在全基因组范围内检测SNV、CNV和SV，显著提高了单细胞测序的准确性。
随着高通量测序技术的发展，转录组测序（RNA-Seq）逐渐成为常用的单细胞分析工具。单细胞转录组扩增方法主要包括全长扩增和链特异性方法。根据不同的扩增原理，我们可以将全长扩增分为基于PCR扩增、体外转录和滚环扩增。链特异性方法分为5＇末端选择和3＇末端选择。其中，选择5＇末端使用模板转换方法，选择3＇末端使用体外转录方法。与全长扩增方法相比，链特异性方法可以通过选择单端序列进行后续测序来显著降低测序成本；另一个主要优点是减少了在扩增，数据库构建和测序过程中可能引入的假阳性。
准确解释高通量数据是基因测序和精准医学的关键。单细胞数据分析的主要过程包括：除去连接子序列、连接序列、标签序列、低质量碱基和污染DNA。由于非均匀覆盖和高比例的嵌合序列，单细胞数据需要不同的数据预处理分析方法。通常使用实验方法或计算机算法对核酸文库进行“标准化”以减少扩增偏差；同时，混合分析可以显著提高样品的平均覆盖率。生物信息学分析软件的不断进步也在一定程度上克服了单细胞数据覆盖不均匀的问题，有效地完成了序列剪接和测序数据分析。
单细胞测序技术在肿瘤研究中的应用已逐渐成熟。普通测序结果显示细胞的整体特征和信息的平均值，或细胞信息的主要数量；事实上，肿瘤组织内存在很大的异质性，遗传信息存在显著差异。对于低丰度信息和一些细胞突变等，在信息平均过程中将被稀释或丢失。因此利用单细胞测序技术有望找到肿瘤发生和演变的各种细胞间基因突变、基因表达关联、基因功能互作及肿瘤异质性分析等，这将带我们进入肿瘤内部，以了解肿瘤的发生，发展和演变。MD安德森癌症研究中心Nicholas等人研究显示肿瘤呈现出间断性进化，此研究挑战了传统肿瘤渐进式演化学说。结肠癌外周肿瘤细胞的单细胞基因组测序分析显示，在肿瘤细胞中表达不足的基因通常在调节细胞-细胞接触和运动中起作用，而高表达的基因主要调节肿瘤细胞以逃避免疫杀伤。在肿瘤发生和进化过程中，大量遗传变异将逐渐积累，这些基因突变的遗传反应将大不相同，因为单细胞测序技术可以帮助挖掘肿瘤诊断和个性化治疗相关标志物。
在肿瘤演化研究中，单细胞测序技术的出现是一个里程碑。或对同一患者肿瘤细胞间异质性分析，揭示肿瘤细胞起源和基因变异，为肿瘤个性化治疗奠定坚实理论依据。
（何帮顺，刘继斌，印明柱）