第四节
基因扩增检测技术

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是20世纪80年代中期开发的用于体外扩增特定DNA片段的分子生物学技术。通过变性，退火和延伸的循环完成大量核酸分子的扩增，并且可以在短时间内将一个或几个拷贝的DNA扩增至数百万个数量级。基于PCR原理的各种基因扩增技术广泛用于肿瘤标志物领域的基因检测。然而，第一代PCR技术只能提供相对定量和/或定性的结果检测。第二代PCR或定量PCR（qPCR）技术使用荧光探针或染料在靶基因被扩增的同时实时检测荧光信号，能够进行定量检测，但由于qPCR中荧光基线估计误差和聚合酶扩增效率偏倚的产生，难以准确地量化低丰度的核酸分子。20世纪末，霍普金斯大学著名肿瘤生物学家Bert Vogelstein开始提出数字PCR（digital PCR）的概念，称之为第三代PCR技术，极大地提高了PCR检测技术的敏感性和准确性。它在肿瘤液体活检领域表现出优异的性能，尤其是ctDNA检测。随着科技的进步，更为敏感、快速、简便、高特异性的基于PCR原理发展起来的肿瘤标志物检测技术得到快速发展，在肿瘤核酸分子标志物的检测中起重要作用。本节主要对PCR相关技术的原理及其在常见肿瘤分子标志物的检测应用方面进行概述。

一、PCR相关技术的基本原理

（一）实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR（RQ-PCR）是将荧光基团或荧光基团标记的探针添加到PCR反应系统中的方法。通过荧光信号的变化，采用Ct值分析和标准曲线量化起始模板。Ct值，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定阈值的扩增循环数，并且与模板的初始拷贝数的对数具有线性关系。使用实验组和对照组之间的直接Ct值差异来计算初始模板拷贝数的相对含量。RQ-PCR技术是PCR定量检测的最基本技术，常用于一般基因表达变化、基因拷贝数变异和非低频基因突变等肿瘤分子标志物领域的检测。

（二）高分辨率溶解曲线技术

高分辨率溶解曲线技术（high resolution melting analysis，HRM）是一种通过整合饱和荧光染料，荧光探针和实时PCR技术的优势来检测基因突变位点和基因分型的技术。主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量及碱基互补性差异，HRM用于分析由PCR扩增获得的产物结合的饱和荧光染料的量。HRM具有成本低、通量高、简便、敏感性高、特异性强的特点。HRM在肿瘤标志物的检测应用方面主要有单基因核苷酸多态性（SNP）的筛查、基因突变（包括缺失、重复和点突变）筛选和甲基化筛选。

（三）低温变性共扩增PCR技术

低温变性共扩增PCR技术（co-amplification at lower denaturation temperature PCR，COLD-PCR）是一种新的PCR形式，它从野生型和突变序列的混合物中选择性扩增已知或未知的少数等位基因，而不管序列上的突变类型或位置如何。因此，基因组DNA的COLD-PCR扩增允许检测含有高比例变体基因的PCR产物。这些低丰度突变对于早期癌症检测、疗效评估、疾病分期和复发后再治疗的监测尤为重要。

COLD-PCR可分为两种形式，完全COLD-PCR（full COLD-PCR）和快速COLD-PCR（fast COLDPCR），它们的使用取决于是否需要识别所有可能的突变，或识别常见的Tm值降低的突变。完全COLD-PCR的基本原理是：DNA经过一些常规PCR周期，完成对目标扩增子的初始积累后在95℃变性，PCR扩增产物可在中间温度下杂交（如70℃，2～8分钟）。由于突变等位基因属于少数，因此大多数突变等位基因最终形成了一种不匹配结构（异源双链），其溶解温度低于完全匹配的结构（同源双链）。然后，将温度升至Tc，优先使异源双链变性，然后进行扩增富集。快速COLD-PCR消除了在高温变性和中间温度下的杂交以形成异源双链体相，直接在Tc温度下变性和扩增。

COLD-PCR不需要设计特殊的引物和探针、敏感性高、操作简单、且可以直接对扩增产物进行测序。此外，COLD-PCR可以代替传统的PCR与大多数现有的检测方法相结合，与传统PCR相比，HRM检测效率提高了6～20倍，检出限可达0.1%～1%。人们利用COLD-PCR发现了 p53 、 kras 和表皮生长因子基因在异质性癌症标本中的新突变，证实了该方法富集未知突变的可行性。需要注意的是，COLD-PCR需对变性温度精确控制在0.3℃以内，且分析限制在小于200bp的序列。COLD-PCR是检测具有高非肿瘤细胞和低肿瘤细胞含量的小样品中突变的良好方法。因此，当怀疑存在突变但使用常规PCR和测序方法无法检测时，可以使用COLD-PCR进行检测。

（四）扩增阻滞突变系统PCR

扩增阻滞突变系统PCR（amplification refractory mutation system，ARMS-PCR）又称等位基因特异性扩增（alleles specific amplification，ASA），是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。DNA聚合酶的酶延伸活性对引物模板双链体的3＇或近端碱基错配的高敏感性，使PCR扩增只能在ARMS设计的引物的3＇末端与模板完全配对时进行（引物仅识别突变序列，不识别野生序列），从而检测出突变（图3-4-1）。

ARMS-PCR是检测实验室中基因突变的常用方法，适用于检测肿瘤组织中突变率低的体细胞突变。但是，只能检测到已知的突变类型，并且无法找到一些新的和未知的突变；如果检测到更多突变位点或类型，则非特异性结合的概率随引物数量的增加而增加；当检测位点的数量大时，对DNA样品量的需求增加。现使用ARMS-PCR方法开发应用在肿瘤检测领域的试剂盒有：①人 kras 基因突变检测试剂盒（Taqman-ARMS法）能检测大肠癌患者体内 kras 外显子2中第12及13密码子的4个热点突变位点。②人 KIF5 B-RET 融合基因检测试剂盒可以对NSCLC等患者进行7种融合形式的 KIF5 B-RET 融合基因的定性检测。③ BRAF 基因突变检测试剂盒（ARMS-fluorescence PCR method）可定性检测肿瘤患者体细胞中 BRAF 基因V600 E的突变，为选择与疾病相关的靶向药物提供参考。④ ADx-ARMS PDGFRA 基因D842V突变检测试剂盒。

（五）数字PCR

数字PCR（dPCR）是核酸分子的绝对定量技术。与qPCR相比，数字PCR可以直接计算DNA分子的数量并对起始样品进行绝对定量。在数字PCR中，起始样品被分割成成千上万份，每份样品中核酸分子被随机分配到独立反应单元中，每个反应单元进行独立的PCR反应，然后基于泊松分布和荧光信号阳性的反应单元与所有反应单元的比率计算目标核酸序列的拷贝数。根据分离反应混合物的不同方式，数字PCR主要分为两种类型：微流控芯片式数字PCR（chip digital PCR，cdPCR）和微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR），其基本原理分别如图3-4-2和图3-4-3所示。

数字PCR具有以下优势特点：①高敏感性，可达0.001%～0.0001%；②高特异性，可检测复杂背景下的靶序列；③对PCR反应抑制剂具有高度耐受性，不依赖于参考物质或标准品，可直接鉴定目标拷贝数，并分析小浓度差异；④绝对定量，可直接计算目标序列的拷贝数。同时数字PCR存在一定的局限性，例如，DNA浓度大的样品处理没有优势，核酸浓度高时，每个液滴中含有的拷贝数不符合泊松分布。尽管数字PCR不依赖于标准曲线，但每个反应之间存在差异等。但是，微滴或微室的使用加速了一些技术的发展，这些技术使用的分区体积更为微小，使之不仅可以在高通量下进行高效的单分子扩增，还可以节省患者的样品和试剂体积。微型化加上使用高效率的微流控工具，使得数字PCR系统得以发展和推广，从而能够在生物样品中以高敏感性和高精度检测罕见序列。

二、数字PCR在肿瘤标志物领域的临床应用

随着基因分子水平研究不断发展，肿瘤基因发生突变等遗传学改变是致癌性发生的根本原因已被广泛接受。癌基因表达异常和突变在多种肿瘤早期和良性阶段就已出现，通过数字PCR可检测到基因突变，准确量化为早期发现、早期诊断、早期治疗，以及疗效和预后判断提供了基础。数字PCR最近成为一种极具前途的癌症患者管理的重要工具，因此，我们将特别关注这项技术在肿瘤研究中的应用。

临床上，组织活检仍然是评估肿瘤特异性变化的标准，但其侵袭性限制了其使用。因此，迫切需要使用非侵入性或微创方法，对肿瘤患者的基因组变化进行系统和实时监测。循环肿瘤DNA反映了肿瘤的遗传和表观遗传变化。使用循环肿瘤DNA进行肿瘤基因检测具有挑战性，部分原因是循环中释放的肿瘤DNA量较低及其在源自非肿瘤细胞的DNA内的稀释。基于数字PCR的新技术可以克服传统方法的局限性，大大提高检测的敏感性、特异性和准确性。

（一）数字PCR与肿瘤诊断

目前，大量的文献和实例已经报道，数字PCR技术已成功应用于检测癌基因，如 EGFR 、 BRAF 、 HER2 和 PIK3A 。有报道利用ddPCR技术，在80%以上的晚期结直肠癌、黑色素瘤和胰腺癌患者中，可以检测到ctDNA中与癌症相关的热点基因突变。通过分析47例石蜡包埋的皮肤黑色素癌的活检结果，比较数字PCR、qPCR和焦磷酸测序的敏感性，其中数字PCR是最敏感的方法，LOD最低，为0.3%。同样，另一项研究使用数字PCR和NGS检测77例胰腺癌患者和154例肺癌患者血浆ctDNA中的 EGFR 和 kras 突变。发现这两种技术都具有高度的特异性和敏感性。

（二）数字PCR与肿瘤治疗

研究人员和临床医师大量研究了液体活检检测肿瘤DNA生物标志物的潜力，用于指导肿瘤患者的治疗和预后。表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）在EGFR突变阳性NSCLC患者的治疗中具有显著的临床治疗效用。阿法替尼是第二代EGFR-TKI。用数字PCR和新一代测序技术分别检测阿法替尼治疗肺腺癌EGFR激活突变阳性患者循环游离细胞DNA（cfDNA）中的体细胞突变，数字PCR测定疾病进展（PD）时间高于NGS测定，显示数字PCR监测cfDNA对于预测阿法替尼药物效力可行性。有研究以18名EGFR-TKI治疗后产生抗性的NSCLC患者为研究对象，获得肿瘤组织和血液的配对样品，并通过数字PCR分析抗性机制，血浆中T790 M突变的数字PCR分析敏感性为81.8%、特异性为85.7%，血浆和肿瘤组织样品的总体一致性为83.3%，表明基于数字PCR的液体活检用于检测EGFR-TKI治疗具有抗性的NSCLC患者的T790 M突变是可行且准确的。

（三）数字PCR与癌症预后

有研究使用突变特异性三维数字PCR来量化58名黑色素瘤患者ctDNA中的BRAF V600 E突变，这表明ctDNA中的BRAFV600 E可作为黑色素瘤患者的非侵入性生物标志物。在一项对71名晚期乳腺癌患者的研究中，用数字PCR检测血浆中ctDNA的PIK3 CA、ESR1、ERBB2及AKT1 E17 K的热点突变，证明ctDNA具有非侵入性分析晚期肿瘤突变的潜力。此外，有研究对已发表的一些研究数据进行了系统的综述，证实通过数字PCR检测到ctDNA突变可作为结直肠癌预后的生物标志物，与患者的生存呈负相关。因此，通过数字PCR检测ctDNA突变可能为肿瘤的预后带来新的突破。

三、小结与展望

癌症治疗正逐渐转向个性化治疗，根据肿瘤的基因特征量身定做治疗需要有效的诊断工具来准确地检测临床相关的基因改变，使患者能够避免不必要的或无效的治疗。数字化PCR克服了传统PCR的局限性，具有敏感性高、特异性强、对PCR反应抑制剂耐受性高、绝对定量等优点，已成为PCR相关技术的发展趋势。数字PCR技术在临床上应用的潜力是巨大的，有望成为个性化和精准化医疗的重要工具，其衡量核酸分子检测方面的优越性能有望应用于早期发现肿瘤，更密切地监测肿瘤的演变、治疗效果或早期发现潜在的复发，并以最适宜的方案治疗患者。

（万绍贵，王凤超） N1TL8dLT5h6VoHOO5M23JGJLDyYAyt7X5SvDFPjJsXxVzq4fs/om43sQ7TKqSMph