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分子杂交是指基于结构互补性，来自不同来源的单链核酸之间或蛋白质亚基之间的非共价键的结合。根据该原理开发的各种技术统称为分子杂交技术。
分子杂交是根据碱基配对原理，在某些条件下使用DNA变性和复性，以形成两个核苷酸单链配对成双链的过程。通过分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是用核素作为探针标记核酸单链，然后与另一核酸单链分子杂交。由于仪器检测核素的高敏感性，甚至可以检测到两个不同核酸分子之间的同源碱基序列的百万分之一。
根据杂交过程中单链核酸的状态，核酸分子杂交为三类：液相，固相和原位。液相和固相分子杂交技术都需要分离和纯化核酸分子。在液相分子杂交过程中，两种不同来源的核酸分子在溶液中并且可以自由移动。液相分子杂交的主要缺点是在杂交后难以完全除去溶液中过量的未结合的探针。在固相分子杂交中，首先将单个核酸单链固定在固体支持物上，而另一个核酸单链在液体培养基中处于游离状态。固体载体主要包括硝化纤维素膜、尼龙膜、微孔板、胶乳颗粒、磁珠等。早期分子杂交方法使用琼脂作为固体支持物并用于确定各种生物（如细菌、植物和人）的遗传DNA的同源性程度。固相杂交方法可以通过漂洗更容易地去除未杂交的游离核酸片段，并且易于检测保留在膜上的杂交体。而且，固相杂交可以有效地防止靶DNA的自我重折叠。
目前常用的分子杂交技术有Southern杂交、Northern杂交、斑点杂交、原位杂交、荧光原位杂交、色素原位杂交和基因芯片等。
1975年由苏格兰爱丁堡大学的E.M.Southern开发，为研究DNA分析的基本方法。该方法首先通过适当的限制性内切酶将待测DNA样品切割成不同长度的DNA片段，并通过凝胶电泳分离，然后将DNA原位解离成单链，并通过电穿孔或毛细管虹吸将凝胶上的单链DNA片段转移到固体支持物（如硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，除去非特异性结合位点并使探针与同源DNA片段杂交后，将固相载体放入盒中放射自显影，即将靶DNA展示在某一位置。
Southern杂交具有高度的准确性和特异性，但其缺点是耗时且费力。另外，由于Southern杂交不经历靶片段的扩增，因此每个电泳通道通常需要10～30μg的DNA。在实践过程中，通常需要更大量的样品来提取DNA。
Southern杂交通常用于肿瘤基因的定性、定量和突变检测，以及肿瘤抑制基因的杂合性缺失，也可用于遗传疾病的诊断、DNA分析和PCR产物分析。早在1978年，Jane Yuewei等医学科学家就利用Southern杂交技术诊断镰状细胞性贫血，并在基因诊断方面取得了新的突破。此外，Southern杂交分析可用于检测特定基因突变，如ATP敏感性钾通道的亚基内向整流钾通道基因中的 A635 G 突变。
Northern杂交的原理与Southern杂交基本相同，不同之处在于Northern杂交是RNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素膜上。Northern杂交主要用于分析mRNA转录和mRNA分子大小。与Southern杂交相比，Northern杂交中使用的RNA不如DNA稳定，并且容易被普遍存在的RNA酶降解。所以在进行Northern杂交时应特别注意RNA酶的污染，所用的一切容器和试剂都必须经过严格的去RNA酶处理，用于该操作的设备与其他过程中使用的设备分开使用。此外，为了避免检测失败，RNA电泳必须在乙二醛或甲醛变性凝胶中进行。含有变性剂的凝胶应在印迹前用水冲洗，再进行后续的印迹和杂交。
在肿瘤标志物的检测中，Northern杂交主要用于检测癌基因或其他肿瘤相关基因的过表达，并且还用于检测肿瘤抑制基因的低表达或表达沉默。徐盛强在癌症表达谱阵列分析实验中，利用Northern杂交技术，以凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）cDNA作为探针检测19对组织中154对癌组织和邻近组织中AIF mRNA的表达水平，发现AIF mRNA在正常肾组织中表达最多，并且肾癌组织中的表达显著下调，但未发现AIF在其他类型的癌组织中显著差异表达。
斑点杂交为分子杂交，将待测样品（例如：DNA、RNA或细胞）直接点在膜上并烘烤。随后使用已标记的探针与膜上的样品进行杂交，除去膜上过量的未结合的探针（又称洗膜），最后进行放射自显影以确定核酸之间是否存在杂交并确定杂交强度。反向斑点杂交（reverse dot blot，RDB）是由Saiki等人提出的一种斑点杂交技术，它与一般斑点杂交的不同之处在于它在硝酸纤维素膜或尼龙膜上特定位置标记探针。然后将待测试的PCR扩增和生物素标记的DNA样品与膜上的探针杂交。随后，将待测样品中的DNA与具有同源序列的探针组合。经洗涤去除未结合的DNA样本。由于待测DNA样品具有生物素标记，因此与样品DNA杂交的探针点带有生物素标记。随后的颜色反应可以显示不同探针点的杂交信号。
由于不需要电泳分离样本DNA和转膜，斑点杂交整个过程简单快速。点杂交允许在单个膜上同时检测多个样品，使得探索杂交条件变得容易。然而，斑点杂交的结果不能判断核酸片段的大小，并且不能够判断样品溶液中是否存在不同的靶序列。与前向斑点杂交和凝胶电泳印迹转移杂交相比，反向斑点杂交的特征在于快速、简单、高敏感性和特异性。
斑点杂交主要用于检测基因缺失和/或拷贝数的变化，也可对核酸进行定性或半定量分析。RDB可以一次性地判断一个基因座上大部分甚至全部的等位基因，因此RDB也可用于病原体检测、基因分型和肿瘤研究等。
原位杂交（in situ hybridization，ISH）是细胞或组织切片中的核苷酸与特定标记的已知序列的核苷酸杂交作为探针。以明确目标核苷酸的含量和/或空间分布。基本上，它属于固相核酸分子的杂交类别，但它不同于任何其他类型的固相核酸分子杂交技术。由于待测试的靶核苷酸的类型不同，ISH可分为DNAISH和RNAISH。以RNAISH为例，碱基配对的原理用于细胞或组织的基本结构保持不变的情况。标记的已知序列的RNA核苷酸片段与待原位测试的细胞或组织中的相应基因片段杂交，在显色反应后，显微镜下观察细胞或组织中相应的mRNA、rRNA或tRNA分子。ISH的探针可以是单链或双链DNA或是RNA探针。2013年，研究发现寡核苷酸探针（16～30nt）可以自由进入和离开细菌和组织细胞壁，杂交效率显著高于长探针。因此，组织ISH应优选使用寡核苷酸探针，不对称PCR标记的小DNA探针或体外转录标记的RNA探针。
ISH研究可用于复杂组织中的单个细胞，并且整个过程不受组织中其他组分的影响。因此，ISH在RNA或DNA的研究中具有很大的优势，所用RNA或DNA的数量少并且散布在其他组织细胞中。由于ISH技术的操作过程不需要提取组织或细胞核苷酸，因此与其他杂交技术相比，ISH对检测组织或细胞内含量非常低的靶序列的敏感性更高。此外，该检测技术可完整保持组织及细胞的形态，能更准确地反映组织细胞之间的关系或功能状态。
1.正常或异常染色体的基因定位。
2.核酸探针与细胞内RNA的杂交，以检测组织细胞中靶基因的表达水平。
3.使用特异性病原体核酸作为探针杂交组织和细胞，以检测病原体的感染的存在。
4.RNA原位杂交不仅检测低丰度mRNA，而且在检测稀有mRNA的表达方面也具有显著的技术优势。因此，它已被广泛认为是肿瘤分子检测的有效分子病理学技术。
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是基于放射性原位杂交开发的非放射性原位杂交技术。根据碱基互补配对原理，用特异性修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将探针与待测样品杂交。荧光染料是检测信号，在荧光显微镜下识别和计数荧光信号，从而检测和诊断基因或染色体异常组织和细胞。
（1）选择合适的杂交区域，并在染色的玻片上进行标记。
（2）揭开盖玻片后，用蛋白酶使载玻片上的细胞变性（不脱色），并且应用荧光标记的DNA探针。
（3）加热编码探针和细胞的双链DNA。
（4）将载玻片孵育（通常在37℃过夜）以使探针与靶DNA序列杂交。
（5）洗涤除去多余的探针。
（6）细胞核用DAPI（一种蓝色荧光DNA染色剂）染色，并使用封固剂封片。在适当的激发和发射滤光片的荧光显微镜下和适当波长的光激发下，荧光探针的荧光信号很容易显示出来。
FISH技术结合了荧光信号的高敏感性，无辐射和直观性，为各种基因和染色体相关疾病的诊断、分类、治疗和预后提供了准确的依据。尽管FISH是一种低通量测定，但它已被用于肿瘤细胞、染色体突变和染色体重排等异常状态的检测。FISH技术有助于在组织病理学早期发现遗传物质的微小变化，当检测到大量细胞中的低频染色体异常时，其敏感性可高达1/1000。它为肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗奠定了坚实的基础。
表皮生长因子受体应用于晚期非小细胞肺癌、腺癌或其他类型的患者，但在治疗前需检测肿瘤相关基因，如 EGFR 基因突变和间变性淋巴瘤激酶融合基因。此外，天津市脑血管和神经退行性免疫荧光重点实验室使用肿瘤标志物进行原位杂交（TM-iFISH）技术评估脑脊液循环肿瘤细胞对非小细胞肺癌脑膜转移的诊断价值，TM-iFISH测试发现每7.5ml脑脊液中有18～1823个循环肿瘤细胞，而细胞学检查仅发现2个肿瘤细胞。与传统的诊断方法相比，TM-iFISH可能成为一种新的基于脑脊液的方法，用于鉴定循环肿瘤细胞和确定脑膜转移。然而，其敏感性和特异性需要通过更大规模的研究来证实。
目前，临床实践中常用的核酸分子主要包括致癌基因、肿瘤抑制基因、DNA错配修复基因等，例如检测EGFR基因外显子18、19、20和21中的突变；检测 kras 基因第二外显子密码子12和13的突变；检测染色体6q 21 ROS1 融合基因和检测 EML4 - ALK 融合基因，可以使用FISH、Sanger测序和检测第二代测序来检测这些核酸分子标记。为肺癌的诊断，分型和靶向治疗提供实验室数据。
宫颈癌和乳腺癌筛查方法包括FISH、影像学检查、细胞形态学检查和人乳头瘤病毒（HPV）检测。虽然一些学者使用全基因组芯片来研究宫颈癌的危险因素，但结果仍需要通过PCR、FISH或免疫组织化学来验证。由于各种FISH直接标记的探针已被广泛用于宫颈癌和乳腺癌的基因FISH检测上，又具有极高的敏感性，使得FISH在宫颈癌和乳腺癌临床实验室检测中的应用越发普遍。
色素原位杂交（chromogenic in situ hybridization，CISH）的原理是将DNA探针如地高辛或生物素与待测样品的DNA杂交。利用过氧化物酶或碱性磷酸酶的反应使实验者在光学显微镜下检测组织切片中染色体分裂和固定的细胞。
研究证实，20%～30%的乳腺癌患者有 HER2/neu 基因扩增或蛋白质过度表达，而 HER2 是乳腺癌患者预后不良的独立危险因素。因为CISH结合原位杂交和免疫组织化学，可以在普通光学显微镜下观察到，因此在临床广泛应用。并且它与 HER2 基因检测结果和FISH具有高度一致性。有研究发现，免疫组织化学（+++）的病例和CISH的检测结果高度一致，免疫组织化学可以作为 HER2 初筛的首选方法，但由于受到免疫组织化学本身技术原因和结果判读的主观性的影响， HER2 检测仍存在假阳性和假阴性；CISH是一种准确、简单且经济的检测方法，具有易于在临床中应用的优点。因此， HER2 免疫组织化学（+～+++）的病例应通过CISH进一步诊断。
基因芯片又称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray）。随着芯片技术在其他生命科学领域的不断发展和应用，基因芯片的概念得到了普及。基因芯片的原理是通过微印刷或光导原位合成将大量已知序列的探针分子密集而有序地固定在预先经过处理的载体上，如硝酸纤维素膜、硅片或载玻片等。然后，加入待测试的标记样品，杂交，并通过杂交信号的强度和分布分析靶分子是否存在，数量和序列，从而获得受检样品的遗传信息。通过使用已知核酸序列与互补靶序列杂交，该原理与经典核酸分子（如Southern杂交和Northern杂交）的原理相同。并基于杂交信号的强度对核酸分子进行定性和定量分析。不同之处在于，经典杂交方法固定的是目标序列，而基因芯片技术固定已知探针，因此基因芯片可以理解为一种反向杂交技术。根据所用探针的类型，基因芯片可分为cDNA（compment DNA）芯片和寡核苷酸芯片；根据检测的目的，可以进一步分为表达谱芯片和单核苷酸多态性（SNP）芯片。
蛋白质芯片是过去十年中新兴的分析技术，根据载体性质不同，可分为固相蛋白质芯片和液相蛋白质芯片，但癌症蛋白质组学中最常见的蛋白质微阵列类型是固相，包括前相阵列（FPA）和反相阵列（RPA）。在FPA中，抗体固定在芯片的表面上，而在RPA中，分析物固定在芯片的表面上。荧光标记的分析物与FPA上的抗体结合（在RPA情况下，荧光标记抗体与固定化分析物的结合）可以定量检测样品中的蛋白质。
基因芯片能够同时对数万个基因进行高通量筛选和检测分析，解决了传统的核酸杂交技术操作复杂，自动化程度低，同时检测到的分子数少的缺点。
蛋白质芯片不仅可用于研究蛋白质和蛋白质之间的相互作用，还可用于研究蛋白质和核苷酸之间的相互作用。它具有高通量，速度快和高敏感性的优点。目前蛋白质微阵列的主要限制因素不是蛋白质微阵列芯片的物理尺寸，而是可用于蛋白质检测的有效抗体。
基因芯片广泛用于检测基因表达，药物筛选，新药开发和人类疾病的诊断。
尽管核酸杂交技术的应用越来越广泛，但其仍存在许多问题。首先，有必要提高检测单拷贝基因的敏感性；其次，尽可能地使用非放射性物质代替放射性物质标记探针，简化实验步骤，缩短杂交时间，改善靶序列和探针的扩增，扩增信号，并开发简单的杂交方法。在不久的将来，分子杂交技术将更简单、更快速、更安全和更便宜。
（许泼实，李涛，乔莹利，王婷婷）