第一节
免疫分析技术

利用抗原与抗体特异性结合特性，结合各种标志物追踪技术来进行免疫学分析的方法称为测定，主要用于各种抗原或是抗体的检测，具有高敏感性和高特异性。常用的免疫分析技术包括放射免疫分析、酶联免疫分析、荧光免疫分析、免疫胶体金技术、化学发光免疫分析等。自这些分析技术问世以来，它为临床疾病的诊断和治疗提供了重要依据，并在生物学和医学领域发挥了重要作用。

一、放射免疫分析

放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）技术是1959年创立，其将放射性核素的高敏感性特性与抗原抗体反应的高特异性结合起来。放射免疫分析具有敏感性高、特异性强、操作简便、重复性好、准确性高等优点。因而很快就得到了广泛应用。经过半个多世纪的发展，RIA可以分析数百种物质，包括激素、维生素、肿瘤相关抗原、抗体、药物、病毒等。准确量化曾被认为无法检测的痕量生物活性物质。

（一）基本原理

放射免疫分析基于抗原与抗体特异性的结合，采用核素标记的抗原和未标记的抗原（受试者）竞争结合一定量的特异性抗体。通过辐射测量法获得待测样品中抗原浓度作为定量方法的技术。

在免疫反应体系中加入特异性抗原Ag和抗体Ab，在合适的反应条件（温度、pH、合适的反应介质）下，在一定的反应时间后，形成一定量的抗原-抗体复合物（Ag·Ab），并将放射性核素标记的抗原 ^* Ag加入反应体系中。因为Ag和 ^* Ag具有相同的免疫活性，它们对Ab具有相同的亲和力。当Ag和 ^* Ag的总量大于Ab上的有效结合位点时，Ag和 ^* Ag竞争结合Ab并相互抑制以形成一定量的抗原-抗体复合物。以上反应均是可逆的。这种竞争性结合反应关系可用下式表示：

在反应达到平衡后，根据可逆反应的质量作用定律，分离并分别测定结合的抗原-抗体复合物的放射性和游离抗原的放射性，结合抗原-抗体复合物 ^* Ag·Ab（B）放射性或 ^* Ag·Ab与 ^* Ag（F）的比例与被测样品中抗原Ag的浓度成反比。

（二）抗原与抗体

进行放射免疫分析的前提是获得对应于测试物质的抗体或抗原类似物。Ag是一类刺激机体免疫系统产生适应性免疫反应的物质，亦称为免疫原（immunogen）。抗原在体外和体内特异性结合相应的免疫效应物质的性质称为抗原性。具有免疫原性和抗原性的物质称为完全抗原，仅具有抗原性且无免疫原性的物质称为半抗原或不完全抗原。大多数蛋白质、细菌、病毒等属于完整抗原。大多数多糖，脂质和某些药物（分子量小于4kD）是半抗原。半抗原单独使用时不具有免疫原性，但当与蛋白质载体结合时可能具有免疫原性。

特异性是免疫应答的最重要特征，也是免疫学诊断和预防的理论基础。确定抗原特异性的物质的基础是抗原分子中的抗原表位，也称为抗原决定簇（antigenic determinant，AD）。表位的性质、数量和空间构型决定了抗原的特异性。抗原通过抗原表位与相应淋巴细胞表面的抗原受体结合，从而激活淋巴细胞并引起免疫应答；抗原还通过表位与相应抗体或致敏淋巴细胞的特异性结合发挥免疫作用。表位既是免疫细胞识别的靶结构，又是免疫应答的物质基础。

放射性核素衰变释放出三种类型的辐射：α、β和γ，常用于放射免疫标记技术，其中常用的标记核素有释放γ射线的 ¹²⁵ I、 ¹³¹ I、 ⁵⁷ Co和 ⁵¹ Cr，以 ¹²⁵ I最为常用，用γ计数器进行测定；β射线通常用于 ³ H、 ¹⁴ C和 ³² P等，最常用的是 ³ H，使用液体闪烁计数器测量。

以被测物质为抗原注入动物体内，在一段时间后，可以在动物的血清中发现特异性结合抗原的抗体。而含有该抗体的血清称为抗血清。其质量直接影响分析的敏感性和准确性。通过免疫动物产生的抗血清需要经过抗血清的滴度、亲和力和特异性测试符合要求方才可以用于检测。滴定度测定是评价抗血清质量的重要指标，通常滴度高于1∶1000，血清中干扰物质影响很小。亲和力是指抗原与抗体的结合能力和结合的坚固性。常用亲和常数（Ka）表示，Ka值一般要求在10 ¹⁰ ～10 ¹² L/mol。特异性是指抗体分别与相应抗原和抗原结构类似物结合的能力的比较。具体检测步骤：在反应体系中加入被检测的抗血清和标记抗原，然后分别用被测物和结构类似物作为竞争物，获得各自的剂量响应曲线，并计算对应于50%结合率的剂量。A ₅₀ 表示分析物的结合率为50%时的浓度值，B ₅₀ 表示结构类似物结合率为50%时的浓度值。交叉反应率=A ₅₀ /B ₅₀ ×100%。在制备抗体后，必须检查交叉反应的大小以确定其临床应用价值。

（三）分离技术

放射免疫分析在实验反应达到平衡后，必须将抗原-抗体复合物（B）与游离物质（F）分离，以测量缀合物或游离物质的放射性计数。计算出相应的结合率。理想的分离技术应当具备：B与F分离安全又迅速，分离后便于放射性测量，非特异性结合低，不受其他因素干扰，分离试剂应具有来源广，价格低，操作简单，重复性好的优点。目前常用的分离方法有以下几种。

1.二抗分离法

在反应体系中加入第二抗体，增大第一抗体与抗原形成的免疫复合物的分子量，然后经离心法将抗原抗体结合形成的复合物进行分离。该方法的优点是分离容易、特异性强、使用方便；缺点是成本高、操作流程长、易受其他因素干扰。

2.化学分离法

该方法在一定条件下使用中性盐和有机溶剂使蛋白质胶乳脱水并中和其电荷以沉淀蛋白质。待分离的反应溶液中必须含有足量的载体蛋白，否则没有沉淀产生，所以该方法不适用于分离大分子蛋白质抗原。常用的沉淀剂有聚乙二醇（PEG）、硫酸钠、丙酮等。其中PEG是最常用的，故又称PEG法。该方法的优点是分离快速，价格低廉，易得，适用范围广；缺点是分离效果易受温度、pH、蛋白质含量和试剂浓度等因素的影响。

3.二抗+沉淀法

结合了免疫分离法和化学分离法的优点，不易受抗原分子大小的影响，非特异性结合率低，简单快速，分离完全。因此目前应用最为广泛。

4.生物分离法

该方法利用免疫球蛋白（IgG）的Fc段与葡萄球菌A蛋白（SPA）有较好的亲和力，故可利用SPA代替二抗作为结合部分的沉淀剂。该方法的优点是SPA与复合物反应达到平衡的时间比二抗快且适用性强。

5.物理分离法

通过电泳、层析、药用炭、离子交换或者树脂吸附等方法将抗原抗体结合部分与游离部分相分离。本法的优点是简单快速，经济易得；缺点是缺乏特异性和易受干扰因素的影响。

6.固相分离法

固相分离法（solid phase separation method）又称免疫吸附法。它通过物理吸附或化学键合将抗体或抗原结合到固体支持物上。免疫反应在固相支持物上进行，反应达到平衡，形成固相抗原-抗体复合物（B），与F分离。固相材料品种很多，如聚苯乙烯、凝胶颗粒、纤维素、多孔玻璃微球，可以做成试管、颗粒等不同形状。优点：操作简单快速，不需要离心，非特异性结合率低，分离效果好。缺点：抗体活性的回收率低，制备过程复杂，成本高。

（四）质量控制

最大化接近目标值的放射免疫分析结果的理想测量应重复几次，或者将样品放在同一测量中的任何位置，测量值应该是样品的精确值。但这种理想的测量在现实中根本不可能实现。体外放射免疫分析是一种高敏感性的超微分析方法，具有少量样品和许多反应步骤。有许多干扰因素，这也会导致太多因素影响分析结果。质量控制（QC）的目的是定期检查整个分析过程中由任何链接引起的错误，以确保分析错误在可接受的范围内。体外放射免疫分析的质量控制可分为内部质量控制（IQC，简称室内质量控制）和实验室间质量评价（EQA，简称室间质评）。前者是通过整个检测系统的性能评估实验室的专业技术人员。评估测试结果的准确性，以便在一个人的同一批次或不同批次的实验、不同的操作员和不同的方法之间进行比较。IQC是EQA的基础。后者由区域或国家机构组织和实施，每个实验室通过发布一定数量的样本进行测试。收集每个实验室的结果，根据统一的评估计划和方法比较结果，并反馈给参与室内质量评估活动的实验室，以促进各实验室持续性改进。EQA是实现实验室之间相互认可结果的必要指标。

体外分析中常用的质量控制指标有：

1.反映测定精度的质量指标

（1）反应误差关系（RER）：

是衡量一批测定中双管平行性误差的指标，通常界定0.04为上限值，小于0.04视为合格。

（2）变异系数（CV）：

平均测定内变异系数应小于10%，批次之间的变异系数应小于15%。

（3）精密度图：

精度是评估随机误差的指标，即使用相同方法在相同条件下测量样品的多次重复的一致性。常用变异系数表示，结合测量的时间可绘制成精密度图，以判断不同批次分析结果的重复性。

（4）质量控制图：

实验室技术人员根据测试结果的水平和测试项目的质量控制的难度将质量控制插入患者的样本中。使用低、中、高质量控制产品获得的测量值，同时测量患者样本，并按照一定的规则每天收集测量的质量控制结果，形成质控图，观察其稳定性。Levey-Jennings质量控制图通常用于室内质量控制的定量分析项目。使用的对照可以是已知值或未知值的对照。对于未知的对照产品，通常使用超过20批的实验数据来计算平均值（ ）和标准差（SD）。人为定义的 ±2SD为质量控制警告限值， ±3SD是失控线。无论是已知质量控制还是未知质量控制，每个月都会进行一次校正，即重新计算x和SD。

2.反映测定稳定性的质量指标

（1）非特异性结合率（NSB%）是指未添加特异性抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率。非特异性结合率增加，并且测量结果的假阳性率增加。

（2）零标准管结合率（B ₀ %）表示当没有待测抗原或标准抗原存在时，标记抗原与抗体的结合率是标记抗原和抗体之间可产生的最大结合率。通常需要30%～60%，50%是最佳的中等结合率。该指标反映了特异性抗体的质量和标志物的稳定性。B ₀ %降低会导致变异度加大，检测值的可靠性降低。

（3）标准曲线参数截距（ a ）、斜率（ b ）、相关系数（ r ）及有效剂量ED ₂₅ 、ED ₅₀ 、ED ₇₅ （抗原浓度值对应于剂量反应曲线在25%、50%、75%的结合率）， a 、 b 稳定， 。标准曲线可用部分的斜率越大，敏感性越高，但可测量的范围相对较小。ED ₂₅ 、ED ₅₀ 和ED ₇₅ 反映了剂量响应曲线的稳定性，有助于批次间结果的比较。

3.反映测定准确性的质量指标

（1）回收率的测定反映了测定偏差的质量指标。是指在样品管中加入已知量的分析物，经过测定的全过程，比较加入量与测得量之间的一致程度。理论上应该为100%，但是由于实验误差的影响，一般介于90%～110%之间。

（2）二样本Youden图是分别将高、中、低浓度的质控样品放在全部试管的首位及末位进行检测，结果绘制在坐标系上，第一个位置是纵坐标，最后一个位置是横坐标。如果测得精密度和准确性好，散点应分布在靶值附近，若实验点分散，表示误差大。首位值大于末位值，实验点位于等分线左上方；末位值大于首位值，实验点位于等分线的右下方；测得值大于靶值，实验点位于靶值的右上象限；测得值小于靶值，实验点位于靶值的左下象限，偏差越大，则偏离靶值越远。

（3）方法特异性常用交叉反应率来表示，在RIA中应小于5%。

4.反映测定方法敏感性的质量指标

敏感性是指用不含标准抗原的零标准管的测定结果在统计和SD。2SD减去结合率后，从标准曲线中找到相应的浓度，该标准曲线是可测量的最低浓度。

认识到错误的性质，找出控制错误的方法，并提高释放质量，这对实验室尤为重要。以下是RIA误差的主要影响因素及其控制方法。学上区分开来的最低浓度。在测定多批标准结果后，计算B ₀ %的

（1）样品的预处理。标本采集方法，储存时间和凝固状态会影响放射免疫分析结果。如果样品严重溶血，则样品储存时间过长。样品未完全凝固，即通过离心分离血清，并将样品反复冷冻和解冻。严格按试剂说明书收集标本，混合后的血样不应长时间置于高温环境中，特别是当待测物体具有生物活性时，如激素、酶等，应立即彻底离心。如果无法及时取样，应将血液样本置于4℃冰箱中。需要储存超过1周或具有特殊生物活性的样品应储存在-20℃冰箱中，避免反复冻融。

（2）试剂误差。试剂错误源于不纯的试剂或试剂储存不当，这两者都可能导致更高或更低的分析结果。试剂的质量和稳定性直接影响放射免疫分析的结果。放射免疫分析是目前测定物质最敏感的方法之一，但由于制备方法不同，试剂的制造商有不同的质量方法。试剂的质量和试剂的不当保存都是误差的来源，例如浓度、冷冻，标准品的劣化和降低抗血清的滴度。标记抗原或抗体脱碘，缓冲液转化等。因此，有必要仔细选择质量可接受的试剂，并且必须严格按照手册的要求进行试剂的储存。试剂盒在室温操作过程中不宜过长，应在有效期内使用；需要冷冻的成分应避免反复冻融，最好一次性使用。

（3）加样误差。放射免疫分析的手动操作主要是移液和样品加载，产生的错误是最常见的。加载误差主要是由于技术不成熟，第二个采样器的不准确测量也是误差的来源。样本加载的一致性是控制误差的重要度量。因此，确保了足够的精度，并且当施加样品并放置样品时，样品的重量和速度是不同的。熟悉操作过程，加强操作培训是减少加载误差和移液误差的唯一方法。

（4）分离步骤包括添加分离剂、混合、离心和倾析上清液的步骤。在操作过程中仔细选择合适的分离剂和作用时间，以及离心速度、时间、温度和离心浓度。当从沉淀物中倾出上清液时，无论是吸吮还是倾倒，动作都必须很轻，只要操作方法合适，两种结果之间没有差别。

（5）漂移：产生漂移的原因很多，当大量样品用于快速分离时，确定第一批和最后一批管的作用时间的差异。操作员疲劳和采样器的“疲劳”。长期计数期间的电压变化也可能导致计数漂移。这种与时间相关的误差即所谓的漂移。可以通过检测放置在不同位置的相同样品的多个结果来评估漂移监测。当检测样品过大时要增加检测次数，以此减少大样本量所造成的加样漂移。

（6）计数误差：离心后的沉淀部分需要通过γ免疫计数器计数。γ免疫计数器是计数误差的主要来源，只有当γ免疫计数器性能稳定时，计数结果才是准确的。γ免疫计数器应每年测量一次仪器的效率（ ¹²⁹ I参考源效率应≥55%），并且每个探头的测量效率的一致性应每月校正（CV≤5%）。每天要测量仪器本底（应≤80cpm）。每次仪器开关打开后，等待仪器电压稳定后再进行测量。

（7）标准曲线的绘制：标准曲线是样品浓度的客观测量和测量质量的客观反映。由于标准曲线的数学性质和在检测过程中难以避免的误差，标准曲线的拟合是合理的并且将直接影响测试结果。标准曲线的误差主要来自标准产品的配置，标准曲线的生产过程和标准曲线的拟合方法。在标准配置过程中应严格操作，定量要求应准确，并根据试剂要求选择合适的配合方法。当待测物质的浓度超过标准曲线的可测量范围时，建议在测量前用缓冲液稀释样品，并将结果乘以稀释倍数。

（五）应用与展望

经过半个多世纪的发展，RIA检测品种已多达近千种，而且其检测领域及品种仍在不断扩大。由于RIA具有价格低廉、准确性高、稳定性好等优点，适用于临床、科研教学、标准品对照、新药筛选等，在基层医院也可得到推广普及。肿瘤标志物可以由肿瘤细胞分泌到血液，其他体液和组织中，或由身体产生的对肿瘤的免疫应答并进入体液或组织。肿瘤标志物是不可或缺的临床指标。RIA检测范围涵盖目前临床使用的所有肿瘤标志物。

目前，在实际应用中，各种免疫分析方法共存，相互竞争并相互补充。然而，RIA仍然是建立新免疫测定的金标准。随着单克隆抗体技术的发展，RIA将继续发展：免疫放射分析（IRMA）由单克隆抗体建立。随着分子生物学技术的不断应用和发展，如基因工程，基因重组和单克隆抗体，RIA试剂盒可以快速从研究阶段转移到临床阶段，大大缩短了开发时间。由于RIA技术的成熟，简单，准确和经济的特点，RIA产品的应用已经超过了基础医院和医学独立实验室。放射免疫分析作为核医学科的重要组成部分，对提高核医学的诊断和治疗水平具有重要意义。然而，近年来，放射免疫分析在广泛使用非放射免疫分析如化学发光方面遇到了重大挑战。例如RIA产品寿命短（约30天），具有放射性，自动化程度低，操作烦琐，报告速度慢。然而，放射免疫分析在方法学，产品类型和价格方面仍具有一定的比较优势。

二、酶联免疫分析

酶联免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）主要包括固相酶联免疫分析。固相酶联免疫吸附试验首次于1971年建立，作为酶联免疫吸附分析。该方法使用酶作为标记指示剂和基于抗原-抗体免疫应答的固相吸附测定。保持与固体支持物表面结合的抗原或抗体保持免疫活性，而酶标记的抗原或抗体保留其免疫活性和酶的活性。

（一）ELISA的基本原理

根据一定程序将含有待测抗原或抗体的样品和酶标记的抗原或抗体加入反应体系中，与已涂覆在固体支持物上的抗原或抗体反应形成固相抗原-抗体-酶复合物；通过洗涤将固定的抗原-抗体-酶复合物与其他组分分离，与固体载体结合的酶量与样品中待测物质的量成正比；在加入酶促反应的底物后，酶催化底物成为有色产物，产物的量与样品中测试物质的量直接相关，从而进行定性或定量分析。

（二）ELISA的分类

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。该测定中有三种必需的试剂：固相抗原或抗体，称为“免疫吸附剂”；酶标记的抗原或抗体，称为“缀合物”；酶反应的底物。可以设计出各种不同类型的检测方法。

1.夹心法

（1）双抗体夹心法测抗原：

该方法基于将固相载体上的包被抗体和液相中的酶标记抗体与样品中待测抗原分子上的两个不同抗原表位组合，形成固相抗体-测试抗原-酶标记的抗体复合物，洗去游离的酶标抗体和其他成分，并加入底物，该酶催化底物的显色，并在加入终止溶液后测定溶液的吸光度值，从而确定待检测抗原的含量。该方法适用于测定两种或多种化合价的较大分子抗原，如乙型肝炎表面抗原、TPS、AFP、CA242等。该法容易受到待测抗原浓度的影响，如果样品中待测抗原的浓度太高，则过量的抗原可分别与固相抗体和酶标抗体结合，以抑制夹心抗体复合物的形成，发生“钩状效应”，导致假阴性结果。因此，如有必要，应稀释并重新测量样品。

（2）双抗原夹心法测抗体：

该方法包覆并制备用于特定抗原的酶缀合物。在该方法中，待检样品不需要稀释，可直接用于测量，因此其敏感性相对高于间接法。酶标抗原的制备是关键，应当根据抗原结构选择合适的标记方法。

2.间接法

间接法是最常用的检测抗体的方法。形成固相抗原测试抗体复合物，并添加酶标记的抗人Ig抗体（即酶标记的二抗或酶标抗体）形成固相抗原-待测抗体-酶标记的二抗复合物；加入底物后，酶催化底物显色，测定加入终止液后溶液的吸光度值，从而确定待检测抗体的含量。间接方法的优点是只要转化被抗原包被，就可以通过使用相同的酶标抗体建立检测相应抗体的方法。

3.竞争法

（1）竞争法测抗原：

该方法的反应原理是待测抗原和一定量的酶标抗原与标本中的固相抗体竞争，标本中的抗原含量越多，与固相结合的酶标抗原越少，最终的显色越浅；在加入底物后，酶催化底物显色，测量溶液的吸光度值以确定待检测抗原的含量。分子抗原或半抗原缺乏可以在夹心法中用于两个或更多个位点，并且不能通过双抗体夹心法测量。它可以通过竞争方法检测，如小分子激素、药物等。

（2）竞争法测抗体：

该方法的原理是基于待检测抗体与标本中的酶标抗体和固相抗原之间的竞争，并且底物颜色的深度与抗体的含量成反比。该方法的优点是当抗原材料中的干扰物质不易被除去时，或当难以获得足够的纯化抗原时，可以通过该方法检测特异性抗体。缺点是某些抗原本质上是不稳定的并且在涂覆过程中易于移位导致测量误差。

（3）捕获法：

用抗人IgM抗体包被固相以捕获血清样品中的IgM（包括针对抗原和非特异性IgM的特异性IgM抗体）。该方法通常用于病毒感染的早期诊断。

（三）ELISA检测的操作流程

该部分以临床最常用的双抗体夹心法检测组织多肽特异抗原（TPS）步骤为例，以点带面，供读者参阅。①实验前将待测样品恢复至室温，使用前摇匀；②采用商品化的96孔板为反应载体，于微孔中加入标准液、质控、患者血清标本50μl，同时预留2个空白孔作为背景对照；③每孔即刻加入100μl HRP标记的抗体，空白孔除外；④于振荡器中450转/min振荡孵育（120±10）分钟；⑤用配制的清洗液洗板3次；⑥每孔加入200μl TMB底物溶液，包括空白孔，在黑暗中孵育（20±1）分钟；⑦每孔加50μl终止液，振荡1分钟；⑧读取酶标仪在30分钟内的吸光度值，波长为450nm；⑨计算样本TPS的浓度值。

（四）酶联免疫斑点试验

酶联免疫斑点测定是用于检测分泌抗体细胞或从单细胞水平分泌细胞因子细胞的检测技术，将细胞培养技术与ELISA技术相结合。其原理是通过使用抗体捕获培养细胞分泌的细胞因子，并通过酶联免疫斑点来显示表达量。其是定量ELISA技术的延伸和发展，主要用于细胞因子分泌细胞的定量测定。酶联免疫斑点试验可在96孔微孔板上进行，板孔底部覆盖膜载体，膜上包被特异性单克隆抗体。将待测细胞和抗原刺激剂加入微孔中进行培养，细胞产生的分泌因子被单克隆抗体捕获。捕获的细胞因子可以进一步与生物素标记的抗体结合，并在酶标记的链霉抗生物素蛋白与生物素结合后，产生膜特异性抗体-细胞因子-生物素标记的抗体-酶标记的链霉抗生物素蛋白复合物；加入底物使其显色，酶催化底物产生不溶性色素，该色素沉淀在局部薄膜上形成斑点，斑点的颜色程度与细胞因子的含量有关。

（五）发光酶免疫试验

发光酶免疫分析是一种新型标记免疫测定技术，它结合了高敏感性发光测定技术和高度特异性的酶免疫测定技术，用于检测痕量物质。基本原理是使用参与催化某种发光反应的酶来标记抗体或抗原，并且在抗体-抗原反应后，添加发光底物。该酶催化并分解基质的发光，并且通过光学仪器检测发光强度，最后通过标准曲线计算分析物的含量。常用的方法类型是用于检测大分子抗原的双抗体夹心法，用于抗体检测的双抗原夹心法和用于测定多肽小分子抗原的竞争法。

1.化学发光酶免疫试验

（1）HRP标记的酶促发光反应：

通常用于该方法的反应系统是鲁米诺/H ₂ O ₂ /HRP/增强系统，抗原或抗体用HRP标记。使用鲁米诺或异鲁米诺或其衍生物作为发光底物，3-氯-4-羟基乙酰苯胺作为发光增强剂，NaOH+H ₂ O ₂ 作为发光起动剂。常采用双抗体夹心法。

（2）ALP标记的酶促发光反应：

该方法通常使用ALP标记的抗原或抗体与待测样品上的抗体或抗原和反应系统中的固相载体发生免疫反应。抗原-抗体复合物ALP中的固相催化发光底物AMPPD，使其除去磷酸基团形成AMPD，AMPD随后自行分解发出的光可在470nm下被检测。常采用双抗体夹心法。

2.荧光酶免疫试验

在该方法中，ALP最常作为标记酶，并且4-甲基伞形酮磷酸盐作为荧光底物。用ALP标记抗原或抗体，并与反应系统中的固体支持物上的测试样品和抗体或抗原发生免疫反应。抗原-抗体复合物ALP中的固相催化4-甲基伞形酮磷酸酯分解成4-甲基伞形酮。经激发光照射，发出450nm荧光。常采用双抗体夹心法。

3.电化学发光ECL法

该方法是电化学分析的重要分支，其原理与双抗体夹心法相同，检测平台基于全自动电化学发光免疫分析仪。已被广泛用于CEA、AFP、PSA、HER2、SCC、CA125、CA19-9等肿瘤标志物的检测。

（六）酶联免疫吸附试验在肿瘤诊断中的临床应用及展望

酶联免疫分析已广泛应用于临床肿瘤标志物的检测，包括TPS、AFP、CA242、GP73、PG Ⅰ、PG Ⅱ、G-17、CEA，PSA、HER2、SCC、CA125、CA19-9等，尤其是电化学酶联免疫分析检测平台的发展和应用，显著提高了肿瘤标志物的检测敏感性，保证了检测的标准化和自动化，大大降低了批次与批次之间的误差。得出的检测结果更为准确和稳定。

三、荧光免疫分析

荧光免疫分析（fluorescence immunoassay，FIA）是结合抗原-抗体反应和荧光发光分析的免疫测定技术。异种荧光免疫分析主要包括时间分辨荧光免疫分析，均相荧光免疫分析主要包括荧光偏振免疫分析和底物标记荧光免疫分析。

（一）时间分辨荧光免疫分析

时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）利用具有双功能基因结构的螯合剂，通过免疫反应将镧系元素标记为抗体（或抗原）并形成复合物，镧系元素可发荧光，故分离除去未结合成分后，并采用解离-增强技术（DELFIA）放大有效荧光。可以通过时间分辨荧光计测量荧光强度，以估计待测物质的含量。该技术中常用的镧系元素是铕（Eu ³⁺ ）、钐（Sm ³⁺ ）、铽（Tb ³⁺ ）等，尤其Eu ³⁺ 是最常用的。TRFIA技术具有很长的荧光衰减时间（镧系元素60～900μs，普通荧光1～100ns）；Stokes位移大（大约290nm，Eu ³⁺ 发射光613nm、激发光340nm）；发射峰窄，并且解离增强技术可以将荧光强度增加100万倍。TRFIA主要技术路线为竞争法、夹心法、间接法等。以双抗体夹心法为例：

1.抗原抗体结合

将待测试的标准品和样品加入涂有抗体的微孔反应板中，并充分反应形成固相抗原-抗体复合物，洗去待测游离抗原。

2.加入Eu ³⁺ 标记抗体

形成并洗涤固相抗体-抗原-Eu ³⁺ 标记的抗体复合物。

3.加入酸性增强液

复合物上的Eu ³⁺ 离解成溶液并形成具有强荧光强度的新螯合物，其中活性成分在增强物中。

4.信号检测

时间分辨荧光读数器记录荧光强度。记录平均荧光强度1000次。

（二）荧光偏振免疫分析

荧光偏振免疫分析（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）是一种均相竞争荧光免疫分析，通常用于确定半抗原的浓度。基本原理是在荧光物质被单个蓝色偏振光（485nm）平面照射后，吸收的光能跃入激发态。然后它返回基态并发射单个偏振荧光平面（525nm）。

待测试的抗原与荧光标记的小分子抗原竞争结合有限量的特异性大分子抗体。反应平衡后抗体结合的荧光标记的量与样品中待测抗原的量成反比。如果待测抗原的浓度高，大多数抗体都被它结合，由于其分子小，液相中的旋转速度更快。如果待测抗原的浓度低，大多数荧光素标记的抗原与抗体结合形成大分子抗原-抗体复合物。此时，检测到的荧光偏振度高，并且荧光偏振度与待测抗原的浓度成反比。

1.抗原与抗体结合

使用竞争方法，将待测上清液、荧光素标记的抗原和抗体一起加入反应体系中，待测抗原与荧光素标记的抗原竞争结合有限量的抗体。

2.信号检测

用485nm偏振光照射反应体系，激发出525～550nm的偏振荧光，仪器自动测量偏振荧光强度，根据标准曲线，自动计算标本中待测抗原量。

（三）应用和展望

临床上可通过TRFIA检测的肿瘤指标包括血清甲胎蛋白，前列腺特异性抗原，神经元烯醇化酶，癌胚抗原等。FPIA是临床药物浓度监测的首选方法，可用于监测急性淋巴白血病患者甲氨蝶呤血药浓度，在对患者进行个体化给药中发挥重要作用。

四、免疫胶体金技术

免疫胶体金技术（immune colloidal gold technique，ICGT）是指使用胶体金作为免疫组织化学和免疫测定的标志物。免疫学分析技术，用于定位和定性检测细胞或某些样品中的多糖、糖蛋白、蛋白质、肽、激素和核酸等生物大分子。1971年胶体金首次作为免疫组织化学研究的标志物。从那时起，免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法已广泛应用于生物医学的各个领域。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法（ICA）和快速免疫金渗滤法（IGFA）检测HBsAg、HCG和抗双链DNA抗体，简便、快速、准确、无污染。

（一）免疫胶体金的制备原理

胶体金是在白磷、维生素C、柠檬酸钠、柠檬酸等还原剂作用下由氯金酸（HAuCl ₄ ）聚合而成的一定大小的金颗粒。它由一个基本核（由11个金原子形成的二十面体）和一个被外层包围的双离子层组成（内层是负离子层AuCl ₂ ^- ，外层是带正电荷的H ⁺ ）。

（二）免疫胶体金技术的分类

1.快速免疫金渗滤法（immuogold filtration assay，IGFA）

快速免疫金渗滤是通过固相膜免疫测定的流程。主要由膜渗滤装置和标记结合物两部分组成。前者是填充有吸水物质的塑料小盒子，并且在表面上放置吸附有抗体的硝酸纤维素膜（如双抗体夹心法）；后者为免疫金。

2.免疫层析分析法

免疫色谱（ICA）是IGFA后开发的另一种固相膜免疫测定法。将样品溶液进行毛细管作用（基于色谱法的交叉流动）至另一端。在移动期间，通过结合固定在膜的某个区域上的受体（抗原或抗体）来固定分析物。通过交叉区域分离无关物质，然后通过标记判断颜色以确定测试结果。使用胶体金作为标志物的实验称为胶体金免疫层析测定法。

免疫层析实验采用微孔膜作为固相载体，色谱免疫胶体金分析根据抗原-抗体反应原理分为以下几类：

（1）双抗体夹心法：

已知一定量的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）作为检测区包被在膜上，并且能够结合金标准的二抗作为对照条带。将与包被的抗体配对的另一种单克隆抗体金标记的缀合物吸附在金垫上并干燥。干燥的金垫一端连接到膜上，一端连接到样品垫上。膜的另一侧粘贴吸水垫。在测试期间，将一定量的液体样品添加到样品垫中，并且样品通过毛细管作用沿着样品垫移动到吸收垫。首先将样品通过干燥的金垫以重建金标准组合。如果在样本中存在待测抗原，则发生抗原-抗体反应以形成复合物A（金颗粒-抗体-抗原）；当样品继续移动到检测区的位置时，抗原-抗体反应再次与包被的抗体发生以形成复合物B（金颗粒-抗体-抗原-包被的抗体），聚集并达到肉眼可见的程度，如样品中没有待测抗原则不能形成肉眼可见的红色条带。游离金标记缀合物或复合物A穿过检测区并到达质量控制区，与二抗反应，形成复合物C（金颗粒-抗体-第二抗体），聚集并产生肉眼可见的红色条带。该方法主要用于检测相对较大的生物分子和颗粒抗原（细菌、病毒、蛋白质、LPS等）。

（2）双抗原夹心法：

双抗原夹心法的特征在于包衣和标记都是抗原。在检测时，样品中待检测的抗体首先与标记的抗原结合，然后与包被的抗原结合。双抗原夹心检测抗体的优点在于它检测总抗体，即样品中的特异性抗体如IgG、IgM和IgA可以产生作为桥接抗体的阳性结果。此外，双抗原夹心法的特异性和敏感性易于控制并且可以达到高水平。

（3）捕获法检测特异性的IgG、IgM：

通过用抗人IgG或抗人IgM单克隆抗体或多克隆抗体包被胶体金颗粒来制备捕获胶体金检测试剂，并且在硝酸纤维素膜上的检测线包覆特异性抗原。在检测时，血清中的抗体首先被金标记的抗人IgG或IgM捕获，直至检测线，然后与相应的特异性抗原组合以形成肉眼可见的红色条带。蛋白A也可以作为标准缀合物。

（4）竞争抑制法：

胶体金颗粒用单克隆抗体标记，检测线用小分子抗原包被，质控对照用抗小鼠IgG包被。在检测时，首先将样品中待测抗原与金标记抗体组合，当它到达检测区时，如果待检测的抗原完全饱和一定量的抗体，金标记的抗体不会与测试条的抗原结合，并且肉眼看不到红色条带，这是阳性结果。如果样本中没有检测到抗原，则金标记的抗体与测试条的抗原结合形成红色条带，这是阴性结果。该方法应特别注意抗体吸附量和胶体金颗粒包被抗原的量。

（三）免疫胶体金技术的操作程序

本部分以幽门螺杆菌尿素酶抗体的临床检测方法为例，供读者参考。①试剂盒和待检血样本恢复至室温；②从铝箔纸中取出试剂盒置于干净水平台上；③将100μl（4滴）血清或血浆加入试验板的样品孔中；④于15～20分钟内观察结果，超过20分钟判定无效。

（四）肿瘤门诊免疫胶体金技术的应用、问题与展望

近年来，免疫胶体金技术已被广泛用于隐血的临床诊断，其高敏感性和特异性对于早期发现胃肠道出血和消化道恶性肿瘤具有重要价值。

目前，一些免疫胶体金快速检测技术可达到1ng/ml或更低，这与ELISA相似，但有些检测仍具有低敏感性。另外，免疫胶体金的应用是单剂试剂，难以控制质量。因此，免疫胶体金测定只能用于定性测试，其定量检测和敏感性的提高取决于新原料和新材料的开发和应用。进一步提高免疫胶体金检测的敏感性和特异性，拓宽临床检测范围，实现多变量检测，定量或半定量检测将是未来的发展方向。

五、化学发光免疫分析

化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是发光分析系统和免疫测定的组合。它已成为临床肿瘤标志物的常规检测方法之一。根据化学发光免疫分析中发光标记的不同，可分为直接化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。

（一）直接化学发光免疫分析

直接化学发光免疫分析是直接标记化学发光剂（吖啶酯）的抗体或抗原。通过与待测样品中的抗原或抗体反应，涂有顺磁颗粒的抗体或抗原反应形成磁性颗粒抗体（抗原）-待测抗原（抗体）-标记抗体（抗原）复合物。在洗涤过程中，结合的和游离的化学发光标记通过磁场的作用分离。结合部分通过发光促进剂发光，并且分析物的含量可以根据其发光强度计算。反应类型包括双抗体夹心法，双抗原夹心法和竞争性结合法。

1.抗原抗体结合

将顺磁性微粒包被的单克隆抗体与待测标本混合，利用磁场分离洗去未参与反应的物质，留下待测抗原与顺磁性微粒上的抗体的结合产物，加入另外的吖啶酯标记的多克隆抗体以形成反应复合物。

2.洗涤与分离

柔顺的磁性粒子置于磁场中，具有顺磁性；在除去磁场后，磁力消失并且颗粒重新分散。在液相中包被抗体的磁性微粒与抗原反应形成复合物后，被外加电磁场吸引而沉淀，经2～3次洗涤，洗去未结合的过量抗原和标记的抗体，以便容易地分离抗原和抗体结合和未结合的复合物。

3.化学发光反应

在洗涤磁性颗粒后，通过预激发液体（H ₂ O ₂ ）从反应复合物中除去吖啶酯，然后加入激发液体（NaOH）。吖啶酯在过氧化物和碱性溶液中被氧化，引起化学发光反应。

4.信号检测

照明信号由聚光器收集并由光电倍增管放大，并记录每单位时间产生的光子能量。可以从标准曲线计算待测抗原的量。

（二）化学发光酶免疫分析

发光酶免疫分析（luminescent enzyme immunoassay，LEIA）是用于免疫反应的酶标记的生物活性物质，免疫反应复合物上的酶作用于发光底物。光由信号试剂发射，并且发光测量由发光信号计执行。根据不同的酶反应物，可分为荧光素酶免疫测定和化学发光酶免疫测定。最常用的辣根过氧化物酶（HRP）发光底物是鲁米诺及其衍生物，采用双抗体夹心法，双抗原夹心法和固相抗原竞争法。

1.抗原抗体结合

待在样品中测试的抗原与固相抗体结合以形成固相抗体-抗原复合物。进一步加入酶标抗体以产生固相抗体-抗原-抗体标记的抗体复合物。

2.洗涤与分离

常见的分离技术包括磁性颗粒分离，微粒捕获和涂覆珠分离。磁性颗粒分离方法通过磁场洗涤并分离结合酶标记复合物和游离酶标记；微粒捕获方法使用非磁性微粒作为涂层载体，通过纤维膜柱分离结合的和游离的酶标志物；珠粒分离方法由诸如聚苯乙烯之类的材料作为涂层载体制成，并且在抗原-抗体反应之后，将结合的和游离的酶标志物分开。

3.酶促发光反应

通常使用三种类型，HRP标记的化学发光免疫分析、ALP标记的化学发光免疫分析和ALP标记的荧光素酶免疫分析。

（1）HRP标记的化学发光免疫分析：

HRP标记的抗体用于与待测抗原和反应系统中的固相抗体反应，形成固相抗体-抗原-抗原标记的抗体复合物。

（2）ALP标记的化学发光免疫分析：

分析系统采用新型发光剂AMPPD。因中间体缺乏稳定性，能从高能量激发态回到低能量稳定态，从而释放出光子。

（3）ALP标记的荧光酶免疫分析：

该分析系统中，结合在固相载体上的ALP能将加入的荧光基质4-MUP（底物）分解，去磷酰基形成4-甲基伞形酮，经360nm激发光照射，发出450nm的荧光。

4.信号检测

通过光量子阅读器连续监测光子发射量或荧光读数仪记录荧光强度，根据标准品制作标准曲线，仪器自动计算待测抗原量。

（三）电化学发光免疫分析

电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）是一种以顺磁性微粒为固相载体，用电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），并用三丙胺（TPA）作为电子供体，通过电化学在电极表面上引发的特定电化学发光反应。该分析方法根据电极上的三联吡啶钌的发光强度，通过抗原-抗体反应和磁性颗粒分离技术检测样品中分析物的含量。电化学发光免疫分析的技术类型包括夹心法，竞争法和桥接法。

1.抗原抗体结合

生物素标记的抗体和吡啶钌标记的抗体与待在反应系统中测试的样品抗原发生免疫反应。添加链霉抗生物素蛋白包被的顺磁颗粒以在顺磁颗粒的表面上形成链霉菌抗生物素蛋白-生物素-抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记的抗体复合物。

2.分离未结合标志物

将上述复合物送入流动测量室，磁性微粒经过电极表面被工作电极下面的电磁铁吸引，将未结合的三联吡啶钌标记的抗体泵出测量室。

3.电化学发光反应

当复合物被送入流量测量室时，加入三丙胺缓冲液，同时加压电极以启动ECL启动过程。使三丙胺和三联吡啶钌在电极表面进行电子转移，产生光学信号，发射出来的光短时间内（0.20～0.60秒）达到峰值。

4.信号检测

通过三联吡啶钌和三丙胺在电极表面上的重复电子转移产生许多光子。光电倍增管检测ECL信号并将其转换为电信号。根据标准制定的标准曲线，仪器自动计算待测抗原的量。

（四）应用和展望

近年来，自动化学发光免疫分析系统敏感性高、特异性好、分析速度快、操作简便等特点，已广泛应用于临床，在癌症筛查和辅助诊断中发挥着非常重要的作用。临床上用于常规化学发光免疫分析的肿瘤标志物，包括甲胎蛋白、癌胚抗原、总前列腺特异性抗原、游离前列腺特异性抗原、β2-微球蛋白、鳞状细胞癌相关抗原、CA19-9、CA125、CA15-3等。

（陈志军，周琳，崔兆磊，王峰） V1NqArw44VtyTl/5waqOJiNFct/A62nU2su8XuKOB1YW61eMTuM1j0zfpkma54sU