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近几年，癌症治疗药物不断更新，尤其是以细胞程式死亡-配体1（PDL-1）免疫抑制剂为代表的多癌种抗癌药物的诞生，使得癌症患者的生存时间得到极大延长。但分析最新调查数据发现，传统治疗方案在肿瘤治疗上的用药无效率高达75%，而使用正确的肿瘤标志物来筛选特定患者可以极大地提升治疗有效率，同时，采用正确的肿瘤标志物可以对肿瘤患者进行早筛、疾病进展跟踪、预后判断、指导用药等。因此，肿瘤标志物检测类产品也成为现今肿瘤治疗中最不可或缺的角色之一。
肿瘤标志物产品的开发，主要从两个方面研制：①免疫学诊断试剂的研制；②分子生物学诊断试剂的研制。
免疫学诊断技术包含放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫、纳米颗粒标记免疫等检测方法，其原理均是使用特定示踪物标记相应的抗原或抗体，通过检测示踪物的含量或活性来测定抗原或抗体的含量。肿瘤标志物检测中常用的示踪物有放射性核素、酶、荧光物质、化学发光物质、生物素-亲和素、纳米颗粒等。现阶段应用最为广泛的就是化学发光免疫法和纳米颗粒标记免疫法，而放射免疫因放射性核素有害于患者健康，已逐渐停止使用。
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）常来源于植物的辣根，是植物中研究得最深入的一种过氧化物酶。其分子量为44kDa，由糖蛋白主酶与亚铁血红素辅基组成的复合物。辅基是酶的活性基团，主酶与酶活性无关，其最大吸收峰分别为403nm和275nm，辅酶在403nm的OD值与主酶在275nm的OD值的比值就是HRP的纯度系数（reinheit zahl，RZ），用于标记的HRP的RZ值应大于3.0。在酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）中常用过氧化氢（H 2 O 2 ）作为HRP的底物。
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）是二聚体蛋白，每个酶分子至少含有两个锌原子。根据提取ALP的来源可将其分为：菌源性和肠黏膜来源，菌源性ALP分子量为80kDa，最适活性pH为8.0，肠黏膜来源ALP分子量为100kDa，最适活性pH为9.6。在ELISA试验中，ALP常使用对-硝基苯磷酸二钠（disodium 4-nitrophenyl phosphate，PNPP）为反应底物，酶作用反应后，生成黄色4-硝基苯酚（4-nitrophenol），其最大吸收峰为405nm。要注意的是：在使用ALP为标记用酶时，不能使用磷酸盐缓冲液作为洗涤缓冲液。
过碘酸钠氧化法是过碘酸钠将酶分子的多糖羟基氧化成活泼的醛基，活泼醛基与抗原（抗体）的氨基形成席夫碱，再经硼氢化钠还原结合。
戊二醛交联法使用戊二醛作为一种同源双功能交联试剂，通过醛基分别于酶和抗原或抗体上的氨基共价结合，形成抗原（抗体）-戊二醛-酶结合物。
荧光免疫法中示踪物常用的荧光素与荧光蛋白有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate isomer I，FITC）、四乙基罗丹明（rhodamine B200，RB200）、藻红蛋白等。
异硫氰酸荧光素是一种黄色结晶粉末，有吸湿特性，易溶于水，微溶于乙醇等溶剂。最大吸收波长为490～495nm，最大发射波长为520～530nm，在碱性溶液中仍有强烈绿色荧光，加酸后析出沉淀，荧光消失。并且它能与各种抗原（抗体）结合，结合后的抗原（抗体）仍可与对应的抗体（抗原）特异性结合。异硫氰酸荧光素是目前应用最为广泛的荧光素。
四乙基罗丹明呈橘红色粉末，不溶于水，溶于乙醇等有机溶剂。最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～600nm，呈橘红色荧光。因其能与异硫氰酸荧光素的荧光形成鲜明对比，常与异硫氰酸荧光素联用，作为双重标记或对比染色。
藻红蛋白（p-phycoerythrin，PE）水溶性极佳，易与其他分子交联结合，是目前应用最为广泛的荧光蛋白。其最大吸收波长为560～570nm，最大发射波长为572～583nm，其荧光强度是荧光素的30～300倍。藻红蛋白具有较宽的吸收光谱，在不同pH条件下，吸收光谱也会发生改变。藻红蛋白激发时有特异的荧光发射峰，激发的荧光稳定，具有较小的荧光背景。也可与异硫氰酸荧光素联合使用，用于双色荧光染色。
直接法是将使用荧光素标记的特异性抗体，直接与相应的抗原混合，使其免疫结合，这一过程常用搅拌法和透析法。
第一步，将特异性抗体（也称为一抗）与相应的抗原混合，使其免疫结合，再用适当的洗涤液，洗去未游离的抗体。第二步，用荧光素标记的抗特异性抗体（间接荧光抗体，也称为二抗）与已和抗原结合的一抗特异性结合，形成抗原-一抗-二抗的复合物。这种方式能使抗原结合更多的荧光标记，因此间接荧光标记法的敏感性会高于直接荧光标记法。
补体法是将补体与抗原-抗体复合物结合，再添加抗补体的荧光抗体，与之免疫结合，形成了抗原-抗体-补体-抗补体荧光标记抗体的复合物。补体法敏感性高，且大部分抗原-抗体复合物都能与补体结合，适用于各种不同种属来源的特异性抗体的标记，因此补体荧光标记法应用非常广泛。
化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象。化学反应过程产生的化学能，反应产物分子或反应中间态分子中的电子吸收化学能后，向高能级跃迁，成为不稳定的激发态能级，在激发态电子由向低能级或者基态跃迁时，就会以发射光子的形式释放能量。
吖啶酯（acridinium ester）化学发光不需要催化剂，在有H 2 O 2 的稀碱性溶液中即能发光，发射波长为470nm。其背景发光低，信噪比高，光释放快速集中、效率高、强度大，易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少。
三联吡啶钌（［RU（bpy） 3 ］ 2+ ）是一种电化学发光剂，与三丙胺（tripropyl amine，TPA）发生氧化反应，形成三价［RU（bpy） 3 ］ 3+ 离子和TPA + 离子，TPA + 自发失去一个质子形成强氧化性的自由基，促使三联吡啶钌进入激发态，激发态的三联吡啶钌很快衰减释放一个波长为620nm的光子。这一过程可在电极表面反复进行，从而产生许多光子，形成强的发光信号。
蛋白分子中游离的羧基与发光剂分子的氨基经碳二亚胺缩合反应后形成稳定的酰胺键。结构中含有羧基或氨基的标志物都可以使用这种方法进行标记。
香胺能与NaNO 2 和HCl反应生成重氮盐，其能直接耦合蛋白分子酪氨酸残基上的邻位酚羟基、色氨酸残基上的吲哚环等，形成偶氮化合物。
N-羟基琥珀酰亚胺活化蛋白分子的羧基，使其与发光剂的氨基耦联形成酰胺键。
纳米颗粒是一种人工制造的、大小不超过100nm的微型颗粒，直径小于10nm的颗粒称之为量子点。它的形态可以是金属颗粒、聚合物、陶瓷颗粒、乳胶体等。在临床上常使用的胶体金、乳胶微球、量子点等。
胶体金法是在枸橼酸钠、鞣酸等还原剂的作用下，将氯金酸（HAuCl 4 ）还原、聚合成一定大小的金颗粒，在静电场的作用下形成带负电的疏水胶体状态。通过改变加入还原剂的用量，可以改变还原成金颗粒的大小。
乳胶微球中常用类型为：荧光微球，用乳胶微球包被荧光分子，可以物理吸附，也可以化学交联，常用于定性和定量检测；磁性微球，由高分子材料和磁性材料组成微球，可通过磁场进行分离纯化等。
量子点是指半径小于10nm的半导体纳米晶粒，常见量子点包括金簇、银簇、硅点等。其接受激光照射可激发荧光，是常见化学发光法光强的20倍，而且不同半径的量子点，激发的荧光波长也不同，因此，可应用于多色荧光标记领域。
胶体金颗粒表面携带负电荷，可与蛋白携带的阳性电荷相互吸引，蛋白质也通过疏水作用和配价结合与胶体金结合。标记操作十分简单，在适宜的pH、离子浓度等条件下，混合蛋白质和胶体金颗粒即可进行标记。
乳胶微球可通过物理吸附进行标记，或者活化微球表面的羧基等基团，使其能与当白纸进行共价耦联标记。
量子点标记方式主要通过量子点与蛋白质的静电吸附、共价结合等方式。其中共价结合的方式也需要活化量子点颗粒表面的羧基、氨基等基团，使其能与蛋白质共价结合。
分子诊断是指应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术。目前，分子诊断技术正广泛应用于临床检测中，而在肿瘤标志物检测中常用到PCR技术、DNA测序技术、生物芯片技术、荧光原位杂交技术（FISH）等技术。
引物（primer）是DNA复制的起始点，在生物体内DNA复制的引物一般是RNA，而在聚合酶链式反应（PCR）中一般是人工合成的DNA片段。在聚合酶链式反应中，需要一对DNA引物，即与DNA模板双链中无意义链结合的正向引物（forward primer）和与DNA模板双链中有意义链结合的反向引物（reverse primer）。设计PCR引物时，应注意以下问题：
一般引物设计在保守区域，分别位于扩增目的片段的上下游。对扩增产物有特异性要求时，需在保守区域设计引物的同时，还需对比网上相应的数据库，确保所设计引物扩增产物的特异性。
引物长度一般为15～30个碱基。
设计引物时GC含量应为40%～60%。
当引物长度大于20个碱基时，Tm=［4（G+C）+2（A+T）］-5；当引物长度小于20个碱基时，Tm=4（G+C）+2（A+T）。设计引物时，PCR扩增时的Tm值在60℃左右较好。
引物自身与引物之间不能有连续4个及以上碱基的互补，且在3’端不能出现连续、重复CG和AT序列。
引物3’端不能添加任何修饰，且3’末端要避开终止密码子的第3位。
探针包括DNA探针、RNA探针、肽核酸探针和锁核酸探针，其中锁核酸探针可以增加DNA芯片、FISH、定量PCR检测敏感性和特异性。在此我们主要讲述DNA类型探针的设计和标记方法。
在杂交检测中，探针决定着检测的特异性。探针与目标核酸相互作用越强，其检测特异性就越高。探针一般分为两类：长探针，其长度在500～5000个碱基之间，目标核酸上的点突变和多态性不影响其检测结果；短探针，其长度在500个碱基以内（常应用于临床检测的探针，其长度在80～200个碱基），这种探针适合检测目标核酸的点突变和多态性。
在探针的5’端添加放射性标记或者荧光基团。
实时荧光PCR检测中，扩增模板的纯度与浓度直接影响检测结果的优劣，所以样本的制备是最为关键的一步。
裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程。裂解方式包括：热裂解，直接对样本进行加热，使核酸游离在溶液中；胍盐裂解，这是目前应用最为广泛的裂解方式，常常结合磁珠提取法，用于目标核酸的提取。
现阶段核酸纯化有三种方式：离心法，对于传统的热裂解方式，往往采用离心法来纯化核酸；吸附法，这种方式采用吸附柱或者磁珠吸附目标核酸，在进行洗涤和洗脱步骤来纯化核酸；探针捕获法，利用一端固定在物体表面的单链核酸探针来特异性结合目标基因片段，对其进行精确捕获，从而达到纯化回收目标核酸的目的。
理想的PCR体系，其扩增效率应接近100%。在含有探针的PCR体系中，因探针的存在会阻碍扩增，其扩增效率会有所降低。所以对于实时荧光PCR而言，PCR扩增体系的优化尤为重要。
在使用探针的实时荧光PCR反应中，理论上越短的扩增子，其扩增效率越高。而在实际应用中，扩增子的大小应在100～150个碱基，在保证高效扩增效率的同时，又能保证探针引物与目标核酸的特异性结合。
实时荧光PCR反应体系中的各组分都会对扩增效率产生影响。例如，使用的DNA聚合酶类型、缓冲液配比、pH、Mg 2+ 浓度等都对扩增效率有着很大的影响。在配制反应体系时，应从优化缓冲液开始，再比较不同来源的DNA聚合酶，然后逐一反复优化各组分，直至扩增效率最优为止。
扩增程序的优化，首先考虑优化变性温度和时间，在逐一优化退火、延伸步骤的时间和温度。实际退火温度取决于优化中的最优温度，理论计算的Tm值仅供参考。
Sanger测序法是由英国科学家Sanger发明的双脱氧核糖核苷酸末端终止法来测定DNA序列。其原理就是，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）使其扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）使其终止。现阶段，Sanger测序法又称为一代测序，每个反应仅能检测800个碱基左右，其检测通量小、耗时长，但检测成本低、准确度高。
第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（sequencing by synthesis）。因第二代测序快速、高通量、微量样本检测的特性，已经应用在肿瘤核酸类标记的检测方向。
Illumina测序是在Sanger等测序方法的基础上，使用不同颜色的荧光分别标记四种dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每结合一种dNTP就会释放出其特定的荧光，在根据捕获的荧光信号进行处理分析，从而获得待测DNA的序列信息。
半导体测序同样基于边合成边测序的思想，在半导体为空中固定待测序的DNA链，随后依次流入四中dNTP，当dNTP与DNA链结合时就会释放H + ，传感器通过检测H + 来测定相应的DNA序列。
选择国内已上市的、市场反馈较好的同类产品作为对比试剂，且需证明参与临床试验的产品要优于市面上已有的产品。
选择至少3家有资质的临床试验机构来进行临床试验，且选择的临床机构应有能力提供试验所需的样本，试验操作人员应熟悉每个操作环节。整个临床试验的考核试剂和对比试剂都应处于有效的质量监控下，使用的仪器均处于定期校准和维护的良好状态下，尽可能保证实验数据的重复性和可靠性。
研究人员应综合统计学、临床医学、分子生物学等多方面考虑，设计合理科学的临床试验方案。一旦确立临床试验方案，不可随意改动，整个试验过程应由临床试验机构的试验人员完成，单位技术人员不得随意干涉试验，仅能进行必要的试验技术指导。
以文件形式递交申请，主要申请文件有临床试验方案、说明书、产品标准、技术要求、合同、标准操作规范流程、样本筛选表、结果登记表等书面材料。
需要记录试剂仪器的使用情况、生产批号、运输记录等，同时，做好试验操作记录、监督检查记录等。
整理与编写试剂、仪器的回收记录、检查记录和临床试验报告。
完成产品的研发，制备企业参考品，设计性能检测方案，试生产三批性能验证试剂，整理产品性能检测报告，修改完善输出资料，确认内控文件。
完成相关试剂的研发与性能测试，试生产检测通过后，进行现场注册抽检，注册抽检合格后编写注册抽检报告。
向相应的药品监督管理部门提出注册申请，在注册申请受理后的10个工作日内提交体系核查资料，资料审查合格者，予以受理，并发放受理通知书。
药品监督管理部门进行技术审评，必要时会查阅原始研发记录和资料，需要补充的材料，审查机构会一次性书面告知。
经审查符合规定批准注册的产品，有相应的药品监督管理部门在规定时间内核发医疗器械注册证书。
（蒋析文）