结直肠肿瘤学最新章节_王锡山著

第四章
结直肠癌肿瘤微环境

第一节　免疫微环境

肿瘤细胞的生长和转移很大程度上依赖于其存在的肿瘤微环境。肿瘤微环境由细胞外基质、丰富的细胞因子、趋化因子及免疫细胞、间质细胞等构成。在结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发生和演进过程中，尤为重要的是长期与肿瘤细胞共存和互作的宿主免疫。肿瘤细胞能够通过释放一些细胞因子或蛋白，改变其赖以生存的肿瘤免疫微环境。而免疫微环境的重塑反作用于肿瘤细胞，决定其生存、进展或死亡。越来越多的证据表明固有免疫细胞［巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞（dendritic cell，DC）、自然杀伤（natural killer，NK）细胞］和适应性免疫细胞（T细胞和B细胞）及肿瘤细胞间的互作，在肿瘤生长和转移中发挥着重要作用。在认识肿瘤免疫微环境的构成及其功能的基础上，肿瘤免疫分型和免疫治疗得以发展和应用。

一、免疫细胞在CRC中的作用

（一）巨噬细胞极化和肿瘤相关巨噬细胞

巨噬细胞是单核-巨噬系统主要的细胞成分，在固有免疫应答、组织稳态维持及炎症等多种条件下发挥重要的作用。骨髓来源的前体细胞受环境因素刺激，分化成熟具有特殊的表型，称为“巨噬细胞的极化”，包括M1（经典型）巨噬细胞极化和M2（替代型）巨噬细胞极化。其中，M1巨噬细胞是由干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等刺激活化，发挥重要的促炎作用，在炎性肠病患者组织中显著升高。而M2巨噬细胞由白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-10、IL-13或糖皮质激素刺激而分化，具有免疫抑制作用。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）是在肿瘤微环境中形成的巨噬细胞亚型。TAM主要起源于循环中的单核细胞，受到CC亚族趋化因子配体和集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）刺激而活化，通过分泌细胞因子和趋化因子以协调免疫细胞功能，影响肿瘤的生长、扩散、血管新生及肿瘤细胞对药物治疗的耐受。

肿瘤微环境中的巨噬细胞发挥着不同的功能，其中M1型巨噬细胞促进Ⅰ型辅助性T细胞（helper T cell 1，Th1）的激活，发挥对肿瘤细胞的吞噬和杀伤作用。通过分泌IL-6、IL-23和活性氧（reactive oxygen species，ROS），参与和调节肿瘤免疫应答，发挥抗肿瘤作用。相较于M1型细胞，肿瘤组织中的TAM主要为M2样巨噬细胞，又可分为四种亚型，即M2a（IL-4和IL-23诱导）、M2b（IL-1β或LPS诱导）、M2c（IL-10、TGF-β和糖皮质激素诱导）和M2d（IL-6诱导）。M2型巨噬细胞通过分泌IL-10和IL-1β等抗炎细胞因子，促进血管生成和组织修复；通过调节肿瘤微环境中免疫细胞间相互作用，构建免疫抑制型微环境，促进肿瘤的发生和发展。值得注意的是，M1型和M2型极化状态并不是孤立存在的，在特定的环境中可以彼此转化。因此，诱导M2型巨噬细胞转分化是目前肿瘤免疫治疗的重要策略。

TAM是CRC免疫微环境中最为丰富的细胞，通过多种途径促进CRC的发生和发展。TAM通过分泌TGF-β1上调补体应答基因-32的表达，从而促进巨噬细胞向肿瘤周围迁移，进而加速肿瘤生长。此外，TAM还可调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶活性以维持肿瘤组织中ROS水平，改变肿瘤微环境的氧化还原状态，从而促进肿瘤细胞增殖。在CRC侵袭和转移方面，TAM也显示出一定的调节作用。M2巨噬细胞能够分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、丝氨酸蛋白酶、组织蛋白酶等成分，破坏基底膜和降解肿瘤细胞外基质，促进肿瘤细胞脱离原发灶和入侵血管。

TAM还可释放大量细胞因子、趋化因子发挥对肿瘤微环境的重塑作用。在CRC肿瘤免疫和血管新生的互作调控中，TAM扮演着重要的角色。TAM释放的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、IL-1、IL-8、TNF-α细胞因子和MMP，通过调节内皮细胞增殖和促进细胞外基质重塑，促进肿瘤血管新生。免疫调节方面，TAM可介导趋化因子［趋化因子配体2（chemokine C-C motif ligand 2，CCL2）、CCL3、CCL4、CCL5和CCL20］的释放，促进Treg细胞在肿瘤组织中的募集和浸润。在对T细胞和NK细胞调控方面，TAM能够通过精氨酸酶1和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）调节精氨酸代谢，从而抑制T细胞增殖。此外，TAM还高表达程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）和CTLA-4，以及程序性死亡受体配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）、B7-H1和其他配体，抑制T细胞、NK细胞和NKT细胞的细胞毒功能和肿瘤杀伤作用，从而抑制CRC患者的肿瘤免疫。值得注意的是，正是针对TAM促进肿瘤免疫逃逸的方式，将免疫检查点抑制剂（抗PD-1、PD-L1和CTLA-4抗体）应用于TAM高浸润的CRC患者，可有效改善和重塑细胞免疫功能，使患者得益于免疫治疗。

（二）DC

DC是具有树突样突起的抗原提呈细胞（antigenpresenting cell，APC），在固有免疫和适应性免疫间起桥梁作用。DC经过识别、捕获、提呈抗原，上调共刺激因子和产生炎性介质，迁移至次级淋巴器官将抗原提呈给T细胞。DC主要分化为4个亚群：浆细胞样DC（plasmacytoid DC，pDC），单核细胞样炎症DC（monocytederived inflammatory DC，moDC），常规DC1（conventional DC1，cDC1）和常规DC2（conventional DC2，cDC2）。pDC具有偏位的细胞核、突出的内质网和高尔基体，形态类似于浆细胞，在应对病毒感染时产生大量Ⅰ型和Ⅲ型干扰素。cDC1表达Toll样受体（TLR1、TLR3、TLR6、TLR8和TLR10），激活后产生TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12等炎性细胞因子，肿瘤中的cDC1也是CXCL9和CXCL10的主要来源，招募效应T细胞进入肿瘤微环境并参与诱导Th1细胞的免疫应答。cDC2与单核细胞衍生moDC具有相似的表型，产生IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23等介质，在激活CD4 ⁺ T细胞和促进Th1、Th2和Th17的免疫反应中发挥重要的作用。

DC在肿瘤微环境中激活、成熟和极化状态有明显的差异，其功能受环境影响，具有较大的可塑性。成熟DC可以刺激免疫应答，而未成熟DC则可诱导免疫抑制或耐受。大多数肿瘤微环境中仅包含少数成熟DC，通过刺激其他免疫细胞和与间质细胞的互作，产生抗肿瘤作用。反之，肿瘤微环境中的免疫抑制因子也可影响DC聚集和抑制其活化。研究表明，肿瘤微环境中的PGE2可抑制cDC1产生IL-12，下调共刺激因子，从而减弱其抗肿瘤作用。此外，TGF-β不仅能抑制DC的分化成熟，还可调节T细胞、巨噬细胞、B细胞等免疫细胞的功能，促进Treg细胞的分化和支持肿瘤生长。

在CRC患者中，DC浸润的程度和功能直接影响患者免疫状态，呈现出与肿瘤分期和转移的相关性。成熟DC在肿瘤组织中从癌巢中央向周围淋巴结迁移，并介导肿瘤抗原的提呈，激活T细胞的抗肿瘤和免疫应答作用。CRC患者肿瘤组织中浸润型树突状细胞（tumor infiltration dendritic cell，tiDC）的数量与肿瘤大小、淋巴转移成负相关，并且依赖于DC的成熟程度。研究证实，CRC原发组织中成熟tiDC的密度较正常肠黏膜降低3倍，而转移灶中的tiDC密度更比原发组织低6倍。反之，tiDC的功能也受肿瘤微环境中环境因子的影响。在DC中加入CRC患者肿瘤组织的条件培养基，可以很大程度抑制DC的成熟和活化。由此可见，成熟和活化的DC发挥着重要的促进肿瘤免疫的作用，而肿瘤微环境中的炎性介质通过抑制DC成熟，减弱其功能，促使肿瘤细胞逃避DC的免疫识别作用。

（三）髓源性抑制细胞

髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）是由一群高异质性、未成熟的髓系细胞组成；生理条件下在骨髓中形成，随即分化为成熟的单核细胞、DC和粒细胞。在肿瘤发生发展中，MDSC的分化和成熟被阻断，从而导致MDSC在肿瘤患者体内增加，发挥抑制肿瘤免疫的作用。MDSC在细胞表型和分化中显示出与中性粒细胞的相似性，需要借助特异性的表面抗原加以区分。例如，MDSC的CD16和CD62L表达下降，而Arg1、CD66B和CD11b表达增高。MDSC根据表面抗原可进一步分型，第一类为粒细胞或多形核（polymorphonuclear，PMN）-MDSC，表现为CD11b高表达、LY6C低表达和LY6G高表达；另一类为单核细胞（monocytic，M）-MDSC，表现为CD11b高表达、LY6C高表达和LY6G低表达。此外，少于3%的MDSC由骨髓祖细胞和前体细胞组成，称为“早期MDSC”，表现为CD13阴性、CD14阴性和CD33阳性。其中，PMN-MDSC和M-MDSC在肿瘤微环境中均显示出明显的免疫抑制作用。

肿瘤患者的组织和循环中，PMN-MDSC占所有MDSC比例高达80%以上，具有显著的抑制T细胞、B细胞和NK细胞免疫功能的作用。M-MDSC和PMNMDSC在抑制免疫应答方面，可以上调STAT3的表达，促进内质网应激和上调精氨酸酶1的表达而发挥作用。在细胞特异性方面，PMN-MDSC优先利用ROS、过氧亚硝酸盐、精氨酸酶1和PGE2介导免疫抑制。而M-MDSC则通过一氧化氮、IL-10和TGF-β，以及免疫调节分子PD-L1来介导免疫抑制。MDSC的产生受炎症环境和肿瘤微环境中的炎性介质所调节和招募，如CCL2可以通过招募MDSC促进多种肿瘤的发生、发展和转移。此外，组胺和前列腺素也在MDSC的调节中发挥重要作用。组胺可诱导MDSC增殖，促进M-MDSC中参与脂肪酸氧化的Arg1和iNOS的产生，促进PMN-MDSC中IL-13和IL-4的释放，发挥重要的免疫抑制作用。PGE2则通过促进STAT3磷酸化和信号通路活化，激活MDSC功能和加速肿瘤的生长。在对肿瘤微环境调控方面，MDSC通过促进肿瘤细胞干性，参与原发灶结构的破坏和增加血管新生，促进上皮-间充质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等多方面促进CRC的进展。

（四）淋巴细胞

淋巴细胞主要包含T细胞、B细胞和NK细胞。其中，T细胞根据表面分子的不同可以分为CD4 ⁺ T细胞和CD8 ⁺ T细胞。CD4 ⁺ T细胞又可分为辅助性T细胞（Th1、Th2、Th17）和Treg细胞。其中，Th1细胞被认为是肿瘤免疫中最重要的辅助型细胞，可以通过分泌肿瘤细胞表面死亡受体的细胞因子、诱导表位扩散等方式而杀伤肿瘤细胞。Th1细胞还能激活DC的功能，以依赖于IFN-γ的方式清除肿瘤细胞；Th2则通过分泌IL-4、IL-5介导抗肿瘤免疫反应。与Th1、Th2不同，Th17细胞的活化与恶性肿瘤的发生和发展有关。CRC肿瘤组织中发现了大量分化成熟的Th17细胞，通过产生IL-17调节肿瘤微环境，促进CRC进展。另外，CD25高表达的Treg细胞可以通过产生免疫抑制细胞因子和代谢物，发挥重要的抑制肿瘤免疫作用。在CRC患者中，Treg细胞的浸润与肿瘤细胞的生长和耐药密切相关，靶向Treg细胞是提高CRC化疗敏感性的有效策略。

CD8 ⁺ T细胞又称细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），特异性识别内源性抗原肽-主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类分子，在不影响正常细胞的情况下，通过与肿瘤细胞结合直接杀伤肿瘤细胞。CD8 ⁺ T细胞还可通过分泌细胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-12等，促进抗肿瘤免疫而间接诱导肿瘤细胞死亡。CD8 ⁺ T细胞在多种肿瘤中发挥强大的细胞毒和抗肿瘤作用。在CRC中，CD8 ⁺ T细胞浸润比例与患者的良性预后密切相关。因此，在CRC的免疫分型中，CD8 ⁺ T细胞是目前应用最为广泛的免疫标志物。

B细胞是参与体液免疫的主要细胞，它在肿瘤免疫中发挥的作用近期才得以揭示。一方面，B细胞可以通过增加对T细胞的抗原提呈，增强T细胞的肿瘤免疫，发挥抗癌作用。活化的B细胞还可通过分泌颗粒酶B直接杀伤肿瘤细胞，产生肿瘤相关抗原的抗体间接破坏肿瘤细胞。研究表明，B细胞可以产生功能性IgG抗体，识别并结合CRC中的肿瘤抗原，发挥重要的抑制肿瘤作用。另一方面，B细胞可以通过上调STAT3促进肿瘤细胞生长和血管的生成；通过抑制效应T细胞和NK细胞的免疫反应，从而促进肿瘤的生长和转移。

NK细胞是固有免疫系统的重要效应细胞，在肿瘤的先天防御中发挥着核心作用。根据NK细胞的表面抗原，可将其分为CD56高表达CD16（±）型和CD56低表达CD16高表达型。NK细胞可以非特异性杀伤肿瘤细胞，这种杀伤作用既无须抗原致敏，也无MHC限制。研究表明，NK细胞的活性降低与肿瘤易感性和高侵袭性显著相关，进一步证明了NK细胞在抑制肿瘤发生发展中的作用。NK细胞通过多种机制对肿瘤细胞产生杀伤作用：①释放含有颗粒酶和穿孔素的细胞毒性颗粒，诱导靶细胞凋亡；②产生IFN-γ和TNF-α等细胞因子直接作用于靶细胞，进一步激活其他免疫细胞攻击肿瘤细胞；③通过死亡受体介导途径（如FASL/FAS，TRAIL/TRAILR）触发肿瘤细胞的死亡。鉴于NK细胞强大的肿瘤杀伤作用，NK细胞免疫疗法成为CRC研究的热点，初步研究结果证实了其疗法的安全性与有效性。

固有淋巴样细胞（innate lymphoid cell，ILC）与NK细胞表型相似，同样起源于淋巴样前体细胞，缺乏成熟B细胞和T细胞的受体。ILC在促进T细胞极化、抗原提呈及细胞因子释放方面发挥重要的功能。ILC可分为ILC1、ILC2和ILC3，分别对应产生Th1、Th2和Th17相关细胞因子和转录因子。ILC1通过释放IFN-γ发挥抗肿瘤作用，又可以根据NK细胞特异性转录因子脱中胚蛋白的表达，分为NK-ILC1和非NK-ILC1。ILC2在不同肿瘤中的效应是多样的，既可表现为抗肿瘤作用，又可表现为促肿瘤作用。而ILC3在CRC肿瘤组织中广泛浸润，发挥重要的促进肿瘤发生的作用。值得注意的是，ILC3在IL-12刺激下可转分化为ILC1，而ILC1在维A酸和IL-23作用下转变为ILC3。由此，ILC的不同功能和可塑性也成为免疫治疗的切入点。

（五）中性粒细胞

中性粒细胞是机体抵御感染与损伤的第一道防线，在组织损伤和感染条件下，上皮细胞释放的中性粒细胞趋化因子，可促进其到达损伤部位，中性粒细胞进一步释放炎性介质，形成中性粒细胞胞外陷阱，吞噬病原微生物。近年来，研究发现中性粒细胞在肿瘤早期参与炎症反应和抑制肿瘤生长，随着肿瘤演进，中性粒细胞产生免疫抑制功能和促进肿瘤发展的作用。与TAM相类似，肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophil，TAN）可根据其功能的不同分为N1型（抗肿瘤）和N2型（促肿瘤）。抗肿瘤方面，中性粒细胞通过产生多种细胞毒性介质来破坏肿瘤细胞。此外，中性粒细胞还可促进过氧化氢介导的肿瘤细胞Ca ²⁺ 流入和释放TNF-α、TRAIL等介质，诱导肿瘤细胞的凋亡。促肿瘤方面，中性粒细胞通过产生ROS，干扰DNA修复和促进DNA损伤。通过释放弹性蛋白酶和TGF-β诱导肿瘤细胞的EMT过程，并且通过分泌多种蛋白酶，如MMP8、MMP9和组织蛋白酶G等促进肿瘤血管新生，从而促进肿瘤细胞的侵袭与迁移。免疫调节方面，中性粒细胞可以上调精氨酸酶，抑制T细胞受体的表达和抗原特异性反应，协助肿瘤细胞产生免疫逃逸。

中性粒细胞在CRC肿瘤组织中的浸润较正常肠黏膜显著增加，且浸润的程度与腺瘤大小及患者预后密切相关，从而揭示中性粒细胞在CRC进程中的重要作用。与外周组织相比，循环中的中性粒细胞也同样反映了患者的免疫状态，可分为高密度中性粒细胞和低密度中性粒细胞，分别对应N1型和N2型。随着中性粒细胞免疫抑制功能的逐步揭示，中性粒细胞可能成为肿瘤免疫治疗的新靶点。

综上，肿瘤微环境中的免疫细胞，产生的趋化因子、细胞因子和蛋白酶等相互作用，形成复杂的网络，共同参与对免疫微环境的精细调节，从而影响肿瘤细胞的生长及扩散（图4-1-1）。

图4-1-1　肿瘤微环境中细胞的相互作用
A.炎症或抗肿瘤环境中细胞释放的细胞因子对肿瘤细胞的影响；B.免疫抑制状态时，肿瘤细胞和免疫细胞释放的细胞因子和相互作用。

二、CRC免疫分型

目前CRC的临床分期采用的是美国癌症联合委员会、国际抗癌联盟制定的TNM分期，结合肿瘤原发灶（T）、淋巴结浸润（N）、远处转移（M）三个方面，对相同组织学背景的CRC患者进行预后评估。然而，TNM分期关注肿瘤细胞本身的特征，未考虑到肿瘤细胞赖以生存的肿瘤微环境以及两者之间的相互作用。越来越多的研究证实，肿瘤进展很大程度上依赖于成纤维细胞、血管、淋巴管和免疫细胞等所构成的肿瘤微环境。尤其是适应性免疫细胞浸润对于肿瘤的分级、分期、转移具有重要的意义。因此，CRC免疫微环境的状态，包括免疫细胞的类型、功能、密度，以及在肿瘤组织中的分布，成为CRC患者预后评估的重要参数。

（一）CRC免疫分型标准

免疫微环境研究的重要临床转化价值在于制订肿瘤免疫评分，但尚未在临床广泛展开，目前比较推荐的评估方案基于肿瘤组织中淋巴细胞的浸润情况，尤其是CD3 ⁺ 和CD8 ⁺ T细胞的浸润。考虑到肿瘤组织的异质性，将CRC组织划分为肿瘤中心区和侵袭边缘区。评估时分别检测淋巴细胞浸润的密度，以此进行免疫细胞计数和免疫分级（0～4级）。患者边缘和中心免疫分级最高到达4级，淋巴细胞浸润逐渐增加，预后更好。操作过程中，将CRC组织标本进行福尔马林固定和石蜡包埋（formalin fixed paraffin embedding，FFPE），对表面抗原CD3和CD8进行免疫组化染色。在显微镜下或者通过数字扫描切片下参照HE染色结果界定肿瘤组织（腺癌）和正常组织（黏膜和黏膜下层），避免坏死组织、脓肿等假阳性区域，进行免疫评分。对于侵袭边缘区，分别选取向正常组织和肿瘤组织延伸360mm的范围进行细胞计数。对于含有多个FFPE蜡块的标本，至少需进行一个侵袭边缘区的免疫评分；含有多个侵袭边缘区的标本，需在低倍镜下选择淋巴细胞高浸润区进行评分。

（二）CRC免疫分型的特点及应用

与传统的TNM分期相比，免疫分型和评分在对于CRC患者预后的评估方面，包括无病生存和总生存，更显示出优势。对于不同临床分期（Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期）患者的肿瘤进展和侵袭方面的预测，免疫分型也同样显示出一定的优越性。需要注意的是，CRC免疫分型主要依赖于T细胞浸润的密度，而T细胞的浸润取决于肿瘤组织的“免疫原性”。在一些肿瘤特异性抗原高表达的疾病，例如，微卫星不稳定、错配修复缺陷及林奇综合征的患者中常可见到更多免疫细胞的浸润。此外，免疫细胞浸润也受肿瘤驱动基因突变的影响，例如，Wnt/β联蛋白信号通路抑制肿瘤组织募集DC，从而抑制CXCL9和CXCL10的释放和T细胞的浸润。另外，正常肠道菌群的改变和肠道屏障的消失，可促进T细胞的浸润，从而导致免疫评分较高。除了预后评估，免疫分型和评分对于免疫治疗（PD-1/PD-L1疗法）的应用也具有同样重要的意义。

通过免疫分型可以把CRC分为“热”肿瘤和“冷”肿瘤，分别对应淋巴细胞高浸润和低浸润的状态（图4-1-2）。但是，目前国际上还缺乏一致性的评估标准，尤其缺少对于过渡状态的界定。例如，“Altered-excluded”和“Altered-immunosuppressed”，分别指边缘区含有大量CD3 ⁺ 和CD8 ⁺ T细胞，但肿瘤中心缺少淋巴细胞浸润的情况，以及肿瘤中心和边缘区均存在淋巴细胞，但淋巴细胞密度较低的情况，这些情况在评估过程中具有一定挑战性。值得注意的是，肿瘤组织中T细胞浸润的数量通常是可观的，平均每张CRC切片有高达88 000个CD3 ⁺ T细胞，计数过程中常出现误差大或重复性差。因此，免疫评分的实施依赖于先进的全自动化诊断设备和切片扫描技术，如“HalioDx”开发的临床评分软件可提高计数的准确性。另外，临床标本中有一部分是转移性肿瘤的活组织标本。此时，需要注意活组织标本评分与术后病理组织评分的一致性。在考虑到这些实际因素的基础上，将免疫评分和分型的标准进行优化，从而帮助其更好地应用于临床。

图4-1-2　结直肠癌免疫评分
根据CD8 ⁺ 及CD3 ⁺ 淋巴细胞比例将肿瘤分为低评分和中高评分（IS 2组），或者低评分、中等评分和高评分（IS 3组）。
IS. immunoscore，免疫评分；CT. tumor center，肿瘤中心；IM. invasive margin，侵袭边缘。

三、单细胞测序描绘免疫微环境图谱

肿瘤异质性是决定肿瘤生物学特性和患者预后的一个关键性因素，探寻肿瘤微环境的细胞构成和彼此间的相互作用依赖于先进技术的发展。传统的肿瘤组织测序方法将患者肿瘤细胞和微环境中细胞的基因表达进行平均化，未能显示肿瘤细胞本身及其肿瘤微环境中免疫细胞分型和所处状态。单细胞测序技术是结合第二代测序技术和单细胞分离技术，从基因组、转录组和表观调控等层面，揭示肿瘤细胞及肿瘤微环境中不同免疫细胞、间质细胞的遗传特征和基因表达。单细胞测序技术充分考虑实体肿瘤内在的异质性，从而在揭示免疫微环境的状态及肿瘤与免疫细胞的互作方式中显示出优势。在一项CRC肝转移病例的单细胞测序研究中，通过细胞表面分子标志物的检测，在肿瘤组织中鉴定出肿瘤细胞（26.57%）、T细胞（26.86%）和粒细胞（20.72%），相较于正常组织中的T细胞（57.30%）、内皮细胞（16.90%）和巨噬细胞（11.21%），肿瘤组织的粒细胞比例升高最明显。对粒细胞进一步分型时，TAN表达的CD16在肿瘤和正常组织显示出差异性，从而证实TAN在调控CRC肿瘤进展中的重要性。在原发性CRC单细胞测序分组研究中，“杯状细胞和肠上皮细胞”特征的CRC分组预后明显优于“成纤维细胞”特征的CRC分组，说明肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast，CAF）在CRC进展中的重要作用。由此，可根据患者的单细胞测序图谱，结合治疗效果和患者预后将CRC进一步分型。

单细胞测序不仅在揭示肿瘤微环境和预后方面具备优势，还对肿瘤细胞发生和耐药机制的探索有重要意义。在一项11例原发性CRC肿瘤和配对组织的单细胞测序研究中，对鉴定的上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞进行IPA通路分析发现，抑制氨肽酶的拟肽类抗生素actinonin极有可能通过拮抗CRC组织中髓系细胞的基因表达，在调节肿瘤微环境和CRC进展方面发挥重要的作用。由此，单细胞测序技术也将促进免疫微环境靶向药物的开发。

（吴华　万珊）

第二节　肿瘤相关成纤维细胞

CRC的发生发展与肿瘤微环境密切相关。在肿瘤微环境中，肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）作为一种持续活化的成纤维细胞，显示出强大的肿瘤调节功能。研究表明，CAF可通过与肿瘤实质成分的相互作用，分泌多种细胞因子，参与肿瘤微环境的细胞外间质结构、免疫及代谢重编程的构建，从而促进CRC的增殖、侵袭、转移及化疗的耐药性，在CRC的演进中发挥重要作用。CAF与肿瘤细胞的多重相互作用反映出CAF是一个异质性、可塑性的群体，对CRC的影响也具有相互依赖性。因此，对于CAF的深入研究，有助于揭示CRC发生发展的具体机制，并有望作为CRC干预和治疗的潜在靶点。

一、CAF概述

（一）CAF的起源

CAF是指位于肿瘤内部或邻近的成纤维细胞。CAF的起源是多样的，目前研究表明CAF可以通过增殖、激活、分化和募集四种非相互排斥的机制产生。CAF主要来源于肿瘤局部成纤维细胞、从骨髓中募集的纤维细胞、间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）、肿瘤细胞相邻的上皮细胞或内皮细胞等。其中，成纤维细胞是CAF的主要来源；在肿瘤中，骨髓来源的MSC可以通过分化转变为相当比例的CAF；肿瘤细胞相邻的上皮细胞或内皮细胞，分别可以通过EMT或内皮-间充质转换（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）成为另一类异质CAF群体（图4-2-1）。其余如间质细胞也具有分化为CAF的能力。因此，这些繁多的前体细胞类型也使CAF群体具有明显的原始异质性。

图4-2-1　CAF的起源
MSC.间充质干细胞；EMT.上皮-间充质转换；EndMT.内皮-间充质转换；rCAF.抗肿瘤CAF；pCAF.促肿瘤CAF。

在肿瘤进展过程中，CAF通过分泌趋化因子、细胞因子和生长因子如TGF-β、血小板源生长因子（plateletderived growth factor，PDGF）、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等维持自身活化状态并进一步增殖，从而与肿瘤细胞及其他基质细胞（如内皮细胞、免疫细胞）建立联系。

最近研究发现CAF在CRC的发生发展中同样扮演重要角色。尽管CRC中CAF的起源尚未明确阐明，但越来越多的证据表明成纤维细胞是CRC中CAF的主要来源。实验表明，在CRC细胞分泌的可溶性因子诱导下，TGF-β信号在CAF中被激活，而后可刺激肿瘤细胞进一步分泌TGF-β细胞因子，这表明在肿瘤微环境中TGF-β的产生激活了成纤维细胞向CAF的分化。肿瘤细胞来源的另一个TGF-β超家族成员Nodal通过激活TGF-β/Smad/Snail途径可促进正常成纤维细胞向CAF的转化，从而在体内、外促进CRC的进展。此外，由CRC细胞合成和分泌的细胞因子IL-34也可以刺激正常成纤维细胞呈现类似于CAF的细胞表型。Gong等的研究也显示组织抑制因子MMP1的增加可激活成纤维细胞转化成CAF，因此肿瘤基质在CRC CAF的产生过程中也发挥了重要作用。由此可见，在肿瘤微环境中CRC细胞或基质均可促进成纤维细胞转化为CAF。然而，考虑到CAF的原始异质性，CRC中CAF的来源可能不仅限于上述前体细胞。

（二）CAF的异质性

研究显示，CAF是一种异质性的细胞群，其异质性主要表现在两个方面：标志物异质性和功能异质性。从根本上说，CAF根据生物学功能不同可分为促肿瘤CAF（cancer-promoting CAF，pCAF）、抗肿瘤CAF（cancerretarding CAF，rCAF）、分泌型CAF、炎症CAF和肌成纤维细胞CAF等几种亚型。此外，由单一标志物确定的CAF也可能由几种不同的CAF亚型组成，而这些CAF亚型在肿瘤进展中甚至可能具有功能上相反的作用。CAF由不同的细胞群体组成，因此，CAF的标志物在不同的CAF亚型中也是不同的。最常见的CAF标志物有α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、成纤维细胞特异性蛋白1（fibroblast specific protein 1，FSP1）、成纤维细胞激活蛋白-α（fibroblast activating protein-α，FAP-α）、结蛋白和盘状蛋白结构域受体2、血小板源生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）-α/β，但这些CAF标志物的特异度仍然不够高，它们的表达水平在不同的肿瘤类型中还是有较大差异。

研究报道，基于TGF-β途径的表达，CRC组织中的CAF可被分为CAF-A和CAF-B两种亚型。CAF-A表达与细胞外间质重塑相关的蛋白，如MMP2和成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein，FAP）等；CAF-B表达细胞骨架基因和其他已知的肌成纤维细胞活化标志物，如α-SMA和血小板源生长因子A亚单位（platelet derived growth factor subunit A，PDGF-A）等肌成纤维细胞标志物。此外，来自CRC患者结肠组织的CAF也表达几种去整合蛋白和金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM），如ADAM9、ADAM10、ADAM12和ADAM17等。随着CAF潜在标志物的逐渐发现，越来越多证据表明其中的一些标志物与CRC的发生发展有关。有研究显示，胶原蛋白I、PDGFR-β和α-SMA是CAF的分子标志物并与CRC的血管侵袭有关；而CAF标志物α-SMA、CD10和FSP1的表达与CRC的淋巴转移相关。

CAF在其标志物表达方面具有极大的变异性，其各新亚型的特征、标志物表达及功能还有待发掘，对于深入探索明确鉴定这些CAF以及它们在肿瘤中的作用至关重要。

二、CAF对CRC发生发展的作用

（一）CAF对CRC的免疫调节功能

近年来，肿瘤微环境对免疫反应的调节成为研究热点之一。以CAF为代表的基质细胞，在肿瘤免疫调节中的作用呈现出两方面：一方面，CAF可通过诱导肿瘤细胞的慢性炎症来促进肿瘤的发生；另一方面，CAF又通过减轻针对肿瘤的免疫应答使肿瘤细胞得以存活（图4-2-2）。CAF释放的促炎性细胞因子可以协助巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞向肿瘤基质的募集并分化成TAM和肿瘤相关嗜中性粒细胞TAN，并进一步释放几种重要的内皮因子和生长因子，如VEGF、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、MMP和各种白介素。此外，CAF可以驱动EMT并与M2型巨噬细胞相互作用从而促进恶性肿瘤的进展。

图4-2-2　CAF的功能
Periostin.骨膜素；IL-6.白介素-6；PDGF.血小板源生长因子；SDF-1.基质细胞衍生因子-1；MMP.基质金属蛋白酶；HGF.肝细胞生长因子；Fibronectin.纤维连接蛋白；PD-L1.程序性死亡受体配体1；IL-17A.白介素-17A；STC-1.斯钙素-1；CCL2.C-C基序趋化因子配体-2；CXCL12.C-X-C基序趋化因子配体-12；Exosomal lncRNA H19.外泌体lncRNA H19。

CAF和肿瘤相关的MSC产生趋化因子，如CXCL1、CCL2、CCL5和CXCL12，并诱导多形核骨髓来源的抑制细胞，M-MDSC和Treg细胞的募集，共同抑制肿瘤免疫从而促进肿瘤的进展。除了募集免疫细胞，CAF还可调节这些细胞的免疫抑制特性。CAF是免疫抑制性肿瘤微环境的主要贡献者。CAF通过重塑细胞外基质间接阻止T细胞的运输，从而抑制其抗肿瘤免疫作用。最近有研究显示，CAF可以负向调节抗肿瘤T细胞反应，抗Wnt2单克隆抗体可直接影响CAF分泌的Wnt2，从而恢复CRC中活性树突状细胞T分化及其介导的抗肿瘤T细胞反应。

CAF和结肠肌成纤维细胞都表达PD-L1，PD-L1通过与T细胞上的PD-1结合，使得CAF在抑制T细胞的活化和增殖中起重要作用。CAF如何参与肿瘤免疫监视的研究尚处于起步阶段，需要进一步对其潜在靶分子或CAF亚型进行深入探讨，进而期待改善目前免疫疗法的临床疗效。

（二）CAF对CRC的代谢适应调控

近年来研究表明，肿瘤细胞和CAF之间的相互作用与细胞代谢重编程有关。肿瘤微环境中的成纤维细胞能发挥特有的代谢调节功能，CAF通过改变代谢微环境以满足肿瘤细胞旺盛的营养需求，以利其快速增殖。研究显示，CAF可以通过调节葡萄糖代谢、氨基酸代谢和脂质代谢来促进肿瘤细胞的生长和演进。这些代谢调节作用被认为是CAF影响肿瘤细胞生物学行为的重要表现。

实验证明，即使在有氧条件下，肿瘤细胞也会快速进行糖酵解，从而增加葡萄糖摄取和乳酸分泌，这种现象称为瓦尔堡效应（有氧糖酵解）。CAF在肿瘤细胞的影响下表现出类似的有氧糖酵解，如葡萄糖摄取增加和乳酸分泌增加，相应减少氧消耗，其产生的乳酸被肿瘤吸收利用。在CRC肿瘤组织中分离的CAF也显示出瓦尔堡效应。氨基酸对肿瘤细胞的生长和增殖至关重要，CAF可通过三羧酸循环合成肿瘤细胞生长和进行生物合成所需的氨基酸。谷氨酰胺是碳和氮的重要来源，在CAF与肿瘤细胞相互作用中发挥关键作用。因此，降低肿瘤微环境中的谷氨酰胺水平会影响肿瘤细胞的活力。有研究显示CAF中脂质代谢失调可以影响肿瘤的进展，CAF通过增加脂肪酸合酶的表达进行脂质代谢的重编程，从而产生更多的脂肪酸被CRC细胞吸收。

CAF调节肿瘤代谢的途径有多种，其中，CAF可通过影响肿瘤细胞中与代谢相关的信号通路来调节肿瘤代谢。在CRC中，CAF通过分泌胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）与肿瘤细胞上的IGF1受体结合来激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路，从而引起葡萄糖摄取和乳酸释放，同时也增加了CRC细胞通道蛋白溶质载体家族7成员11的表达，并促进CRC细胞摄取谷氨酰胺，从而增强CRC对术前放疗的抵抗力。

上述研究表明，CAF的存在可诱导肿瘤的代谢重编程，从而促进肿瘤细胞对营养剥夺的适应，维持肿瘤的发生和进展。

（三）CAF对CRC增殖的作用

与正常的成纤维细胞不同，CAF作为肿瘤微环境基质的一部分，通过分泌生长因子、细胞因子和趋化因子，并通过细胞外基质的重塑共同促进肿瘤细胞的生长，例如，CAF通过分泌HGF、TGF-β、基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor，SDF1）、IL-1、PDGF等多种因子促进肿瘤的生长增殖（见图4-2-2）。

除了能够促进肿瘤细胞增殖，CAF也可以通过分泌生长因子如HGF等从而增加和维持肿瘤细胞的干细胞样特性。最近已有研究表明干细胞样特性的维持是肿瘤形成的一个重要影响因素。体内外实验证明CAF促进了CRC的肿瘤增殖，其作用可能是CAF分泌骨膜素、调节肿瘤代谢和CAF衍生的IL-6诱导EMT。此外，miRNA-31、lncRNA UCA1，以及包括PI3K-AKT、FGF-1/-3/FGFR4、HGF-c-Met、ERK5/PD-L1在内的一些信号轴也作为重要的调节剂介导CAF对CRC的促增殖作用，从而形成有利肿瘤发生发展的肿瘤微环境。

（四）CAF对CRC迁移、侵袭及远处转移的作用

许多研究表明，CAF通过重塑细胞外基质、调节EMT、分泌生长因子等途径影响肿瘤的侵袭和转移。据报道，包括CAF在内的基质细胞可以为肿瘤侵袭建立桥梁并促进肿瘤细胞迁移到其他部位。CAF可以通过重塑ECM（见图4-2-2）影响肿瘤的生长、侵袭和转移。此外，肿瘤血管生成不仅是原发性肿瘤生长所必需，而且是肿瘤侵袭和转移的关键因素，CAF还可以通过水解激活血管生长因子蛋白以促进肿瘤血管形成。

在CRC中的研究发现，PDGF激活的CAF可通过分泌斯钙素-1来促进肿瘤细胞的血管内扩张和远处转移。除释放可溶性因子外，CAF介导的肿瘤微环境重构也可促进肿瘤的侵袭和转移。据报道，CRC中抑癌基因 SMAD4 的丢失会增加TGF-β信号转导的水平，后者可以激活PI3K-AKT通路下游的mTORC2来调节与EMT相关的基因表达水平，TGF-β还可以通过旁分泌途径诱导EMT进一步促进CRC的转移。

肿瘤细胞和成纤维细胞通过促炎性细胞因子的介导在EMT中发挥关键作用。CAF衍生的IL-6可诱导多种肿瘤的EMT，从而促进肿瘤细胞迁移和侵袭能力的增强。另外，研究发现在肿瘤微环境中，CAF是分泌CXCL12的最主要来源，而后者是EMT强烈的激活剂，通过CXCR4/CXCL12轴激活Wnt/β联蛋白途径是导致CRC侵袭和转移的重要机制。

（五）CAF对CRC耐药性的作用

化疗耐药是导致肿瘤进展的常见原因之一。近年来研究表明，CAF可以维持某些肿瘤类型的肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）特性，由于CSC细胞周期循环缓慢或表现为静止休眠状态，导致该亚型本质上即对细胞毒性药物产生抵抗作用，在功能上，CSC被认为是肿瘤发生的驱动因素，也在肿瘤复发和治疗耐药中发挥重要作用。

据报道，在CRC患者中，细胞毒性治疗后观察到CAF数量显著增加，并且CAF可通过增加包括IL-17A在内的特定细胞因子的分泌而促进CSC的形成，从而增加对化疗的抵抗作用。也有文献报道，CAF通过转移像miR-141海绵一样的外泌体lncRNA H19来促进CRC干细胞的形成（见图4-2-2）。

有研究显示，CAF可以分泌HGF并通过C-Met受体激活肿瘤细胞中的MAPK和PI3K-AKT信号，从而在 BRAF 突变的CRC中对BRAF抑制剂产生耐药。同样，由CAF衍生的HGF触发的平行c-Met信号级联在 KRAS 野生型直肠CSC中出现，从而也对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制产生耐药性。因此，与体内西妥昔单抗单药治疗相比，西妥昔单抗和c-Met抑制剂（如JNJ-38877605）同时给药可产生更明显的肿瘤消退。此外，CAF及其衍生的外泌体miR-24-3p可加速CRC细胞产生对奥沙利铂、5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤等常规化疗药物的耐药性。

三、CAF在CRC中的临床应用

（一）CAF与CRC诊断和预后的相关性

除上述CAF与肿瘤发生发展的作用及其相关机制外，CAF在临床中同样具有其诊断和预后价值。近年来，对常用CAF生物标志物在不同肿瘤类型中的预后相关性研究越来越多。有研究报道，与CRC预后不良相关的基因组的表达水平在CAF中显著升高，同时实验表明在转移性CRC患者外周血中存在FAP阳性的CAF，因此CAF的激活与完全缓解（complete response，CR）患者预后有关。已有研究表明，CRC中TGF-β相关基因在肿瘤基质中的表达升高与不良预后相关。α-SMA除了作为CAF的标志物，组织学观察显示其高表达或高基质比例可预测CRC患者的不良预后，因此α-SMA被确定为CRC患者的重要预后因素之一。除α-SMA外，小窝蛋白1（caveolin 1，CAV1）、CD90蛋白和FAP也是与CRC预后相关的CAF标志物。研究发现，表达CAV1的成纤维细胞在CRC肿瘤基质中非常丰富，CAV1通过调节Rho GTP酶活性来参与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的重塑，因此基质CAV1的表达与CRC的不良预后有关。CD90 ⁺ CAF可直接促进CRC中CSC群体的生长，也参与调控促进CRC进展的肿瘤免疫反应。此外，FAP水平的升高与MDSC水平的升高有关，后者在免疫抑制中起重要作用。FAP水平升高也可以导致CD3 ⁺ 细胞、Th1和NKT的水平降低，以及巨噬细胞、单核细胞和免疫抑制相关的CD11b ⁺ 细胞的增加。上述研究表明FAP的高表达水平与CRC患者的预后密切相关。

鉴于CAF在肿瘤发生早期即呈现出在肿瘤中的表达增多，未来的研究将致力于发掘有诊断价值的CAF标志物。由于CAF来源的不确定性及同种来源功能的差异性，不同肿瘤表达功能的差异导致需要进一步研究具有特定生物标志物的CAF不同亚型，从而确定其临床预后价值。

（二）CAF与CRC的靶向治疗

近年来，多项CAF与胃肠道肿瘤治疗相关的临床试验正在进行。据文献报道，临床前研究主要通过靶向CAF的激活信号和效应因子、CAF衍生的ECM蛋白以及相关信号转导等来评估CAF对肿瘤治疗的疗效。其中，通过靶向ECM蛋白的产生或降解ECM有利于药物的输送。此外，通过细胞特异性受体将药物靶向递送到CAF可以提高疗效并减少治疗的副作用。

据研究报道，通过间质表皮转换因子（c-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met）阻断HGF信号转导的药物处于临床前试验阶段，并有望开展对于肿瘤生长和存活依赖于持续的c-Met激活的患者使用c-Met抑制剂来抑制肿瘤的进展。此外，MMP抑制剂可以通过改变CAF调节ECM重塑的能力来抑制肿瘤的发生发展，尽管大多数MMP抑制剂仍处于早期临床试验。研究人员还使用TGF-β抑制剂或Hedgehog抑制剂联合常规化学疗法或免疫疗法，试图阻断胃肠道肿瘤中与CAF相关的促肿瘤发生信号转导。

事实上，靶向CAF的治疗方法应该区分CAF的不同亚型和功能。在CRC小鼠模型中，FAP+pCAF可被靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）消除。此外，针对FAP的DNA疫苗也能诱导CD8 ⁺ T细胞介导的pCAF杀伤，使得多药耐药CRC模型中化疗药物的肿瘤内摄取显著增加。也有报道称FAP抑制剂或许能消除CRC中的CAF。此外，通过维生素D和维生素A将pCAF还原为rCAF的CAF重编程也引起了广泛关注。目前，不同的靶向药物正在进行临床试验，尽管早期结果尚未表明其确切的疗效。

尽管CAF在CRC的发生发展中发挥重要作用，但针对CAF的肿瘤靶向治疗相关方面的研究仍然处于初期阶段，由于CAF的异质性和多种不同信号通路的同时激活，即使在同一肿瘤内也很难确定治疗靶点。因此，在临床前和临床试验中对CAF亚型进行全面的标志物分析和功能的验证将有助于开发以CAF为基础的新型诊疗方法。

（何宋兵）

第三节　肿瘤新生血管形成

CRC的生长和转移依赖于肿瘤间质持续而充足的血液供应。为了维持肿瘤组织快速生长和播散的肿瘤生物学特性，VEGF和Notch信号通路的激活启动肿瘤血管出芽；促进和抑制血管新生因子平衡的打破，加速肿瘤血管的形成。区别于正常组织的血管，肿瘤组织的血管表现出结构紊乱、通透性强和灌注异常的特征。此外，伴随而来的肿瘤组织缺氧和骨髓源性细胞的浸润，分别通过不同机制进一步加重肿瘤血管的新生。在CRC发生和转移过程中，如何干预肿瘤血管新生，促使肿瘤血管退缩和有序化是治疗CRC的重要策略。

一、血管新生的调控机制

（一）血管内皮出芽

成人的血管在生理情况下处于增殖的静止期，很少产生新的分支，在特定的情况下（修复、肿瘤等）从已有的血管基础上产生新的血管的过程，称为血管新生。对血管新生的观察发现，这个动态过程经历了血管出芽、内皮细胞延伸、新生血管对合、管腔形成和成熟几个环节。其中，血管出芽是血管新生首先出现和最为关键的环节。

如同植物出芽一样，血管内皮细胞在特定条件下，由原本血管基础上产生突起形成“尖端细胞”，随之发生增殖形成管腔形态的细胞称为“茎细胞”。在尖端和茎细胞形成、分化和转换的过程中，促血管生成的VEGF信号通路和Notch信号通路分别发挥着重要的作用。在VEGF释放和刺激下，VEGF作用于尖端细胞特异性表达的血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR 2），激活下游信号通路和促进Notch信号通路δ样配体4（notch ligand δ-like 4，Dll4）的表达。Dll4则与邻近的茎细胞表面Notch1结合，引起Notch1胞内结构域（notch 1 intracellular domain，NICD）的切割和释放，NICD入核、从转录水平限制VEGF信号通路的靶基因，如下调VEGFR 2、VEGFR 3和Nrp1表达，上调VEGFR 1的表达。相较于VEGFR 2，茎细胞表面的VEGFR 1的激酶活性较弱，与VEGF的结合能力强，功能类似于“诱饵”受体，限制内皮细胞VEGF信号通路的活性。另一方面，JAG1是茎细胞特异性表达的Notch受体配体，JAG1可以通过拮抗Dll4和Notch1的相互作用，阻止尖端细胞Notch1信号通路的激活。JAG1在抑制尖端细胞功能和促进内皮细胞分化方面起重要的作用。由此可见，VEGF信号和Notch1的相互作用和动态平衡是促进和维持血管出芽的重要前提（图4-3-1）。

图4-3-1　肿瘤血管新生“出芽”调控机制
当在VEGF释放或缺氧环境中，Dll4表达促进尖端细胞出芽，同时促进周围细胞（茎细胞）Notch信号通路的激活，抑制其向尖端细胞分化。

（二）管腔形成

在血管出芽完成后，新生的血管需要具备一定直径的管腔以保持血流通畅。新生血管的内皮细胞可以通过胞饮作用，摄取细胞膜将其包裹；形成的胞饮泡中的细胞膜又重新整合，促使新的细胞内管腔的出现。在这个环节中，内皮细胞、细胞外基质和相邻细胞间的互作维持是管腔形成的关键，受到整合素信号通路，尤其是胶原纤维依赖的α2β1型整合素和纤维素依赖的αVβ3和α5β1型整合素的调控。在一项小鼠胸主动脉管腔形成的研究当中，内皮细胞可以改变自身和邻近细胞的形状及连接方式，从而促进管腔的形成。在小鼠模型中，内皮细胞通过改变位于细胞顶端的糖蛋白的电荷，使得排斥信号产生，伴随着细胞间连接的重排，最终打开新生血管的管腔。

（三）新生血管成熟

随着管腔形成，新生的血管还需建立足够稳定的结构、发挥血管生理功能以达到“成熟”的标准。与出芽环节类似的是，新生血管成熟的环节也受特定血管新生信号通路的精细调控。例如，血管周细胞（足细胞）的募集和内皮细胞间细胞连接的建立是血管成熟的关键。稳定的血管结构和屏障功能的构建还依赖于内皮细胞外围完整基底膜的形成。而这个过程则是受到组织金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP）和MMP的相互对抗所调节。上调的TIMP能对新生血管周围的MMP进行降解，从而保障足够胶原的产生和聚集以形成一定厚度的基底膜。

在新生血管成熟的过程中，足细胞的募集是其中最为关键的步骤，受尖端细胞所释放的血小板源生长因子B亚单位（platelet-derived growth factor subunit B，PDGF-B）精细调控。新生血管生长过程中所产生的硫酸肝素聚醣使得PDGF-B在局部聚集，进一步引诱表达对应β型受体（PDGFRβ）的足细胞随之迁移而来。募集而来的足细胞发挥着重要的稳定新生血管的作用。足细胞产生和释放血管生成素，Ang通过与新生血管内皮细胞上的Tie2受体结合使其发生磷酸化，进而激活内皮细胞的AKT信号通路，从而促进内皮细胞的生存；并且通过介导转录因子FOXO1的失活而抑制内皮细胞的凋亡信号。由此可见，在血管足细胞的支持下，Ang1依赖性的Tie2磷酸化使新生血管内皮细胞不断增殖。此外，足细胞-内皮细胞、内皮-内皮细胞间的相互作用是新生血管稳定和成熟的前提。鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）可以与细胞膜表面G蛋白耦联受体S1PR结合，促进N-钙黏着蛋白的囊泡运输和表达，从而加强内皮细胞间、内皮细胞-足细胞间的黏着连接而维持新生血管的稳定性。综上，在血管成熟和功能形成的过程中足细胞发挥着重要的作用，通过Ang、S1P等蛋白的释放和调控作用，维持内皮细胞的增殖和促进血管内皮的完整性。

二、肿瘤异常血管新生

与正常组织的血管相比，肿瘤血管显现出异常的形态特点，出现扩张、扭曲和无序化的血管结构。相较正常肠黏膜环状和规律性的排布特点，结肠癌周围的血管显现出明显的扩张、多级分支和紊乱的特征性结构（图4-3-2）。另外，肿瘤组织的血管与正常组织相比更加不成熟，缺乏血管周细胞的覆盖，导致血管通透性高、血流灌注差和缺氧的特点。值得注意的是，肿瘤血管的无序化受肿瘤组织异常激活的促血管新生信号调控，也是抗血管新生治疗重要的切入点。

图4-3-2　正常肠黏膜和癌旁组织血管模式图
A.正常肠黏膜血管密度均一，呈环状、有规律；B.结直肠癌周围血管结构紊乱，分支增多，粗细不一致。

（一）肿瘤血管新生的激活

肿瘤组织与正常组织相比需要更多的血管以维持养分和养料的供应，以及排出代谢产物和二氧化碳。为了支撑肿瘤组织快速的生长，血管从静止状态转变为持续出芽的新生状态，这样的过程被形象描述为“肿瘤血管新生的开启”。这个开启的过程受到肿瘤微环境中促进或抑制血管新生的因子的调控。这些血管新生调控因子通过与血管内皮细胞表面的不同受体结合，激活下游信号通路，产生促进血管新生或抑制血管新生的不同效应。例如，最常见的促血管新生因子VEGF-A和血管新生抑制因子血小板应答蛋白1（thrombospondin 1，TSP1），在肿瘤血管新生中产生相反的拮抗作用。

VEGF-A是胚胎发育过程中促进血管生成的重要配体蛋白。VEGF-A通过与其对应的三种酪氨酸激酶受体蛋白（VEGFR 1～3）结合，在缺氧和肿瘤的不同病理条件下激活下游VEGF信号通路。VEGF配体的功能也同样受到肿瘤微环境中分泌性因子的影响，例如，MMP9能促进细胞外基质的降解，使得封闭当中的VEGF配体得以释放，结合和激活相应的受体蛋白。此外，成纤维细胞生长因子的升高也能够促进肿瘤血管的持续新生。相反的，TSP1通过与其跨膜受体蛋白结合，从而上调血管新生的抑制信号，以对抗VEGF信号的促血管作用。

在促血管新生和抑制血管新生信号被打破，血管新生通路持续激活的情况下，肿瘤血管出现区别于正常血管的变异形态，包括：未成熟毛细血管出芽，过度和大量分支，扩张的血管管腔，异常的血流、渗漏与出血等。意外的是，异常的血管新生出现在肿瘤早期（非浸润阶段），甚至是更早的癌前病变期，而并非肿瘤进展期。综上，肿瘤微环境中促血管新生和抗血管新生因子的失平衡是肿瘤血管新生开启的关键，导致肿瘤血管特殊结构和功能的产生。

（二）足细胞与血管通透性

生理条件下，足细胞起重要的促进血管成熟和维持屏障功能的作用。在肿瘤组织中，足细胞与基底膜，足细胞与内皮细胞间的相互作用减弱，导致血管形态和通透性的变化。研究发现，在PDGF-B的作用下，足细胞在肿瘤血管内皮细胞的被覆减少，而且与内皮细胞间的连接减弱。缺乏足细胞的支持作用下，内皮细胞虽继续增殖，但形成的血管稳定性下降，通透性高，容易出血。此外，内皮细胞间所表达的VE-钙黏着蛋白是维持血管完整性和屏障功能的重要蛋白。当肿瘤细胞释放大量蛋白酶（如MMP、胰酶和弹性蛋白酶），VE-钙黏着蛋白蛋白发生切割，内皮细胞的相互作用和屏障功能减弱。除此以外，肿瘤细胞还能释放大量炎细胞因子，进一步增加肿瘤血管的通透性。例如，组胺的释放可以持续削弱VE-钙黏着蛋白的功能，从而继续减弱血管内皮细胞间的连接。肿瘤组织表达的VEGF则可通过调节内皮细胞中小GTP酶活性，进而影响肿瘤血管的屏障功能。

除了上述细胞连接作用的减弱，肿瘤血管的基底膜也较正常血管也发生了明显改变。将肿瘤组织切片进行Ⅳ型胶原（基底膜标志物）、CD31（内皮细胞标志物）和α-SMA（平滑肌细胞标志物）免疫组化染色时，结果显示血管的不同组成连接松散，出现较大的空隙，甚至在肿瘤间质中检测到血管内膜组织。除了上述肿瘤血管结构的异常，基底膜自身也出现损伤，表现为不规则增厚和穿孔。这些结构的异常和损伤的发生导致肿瘤血管通透性进一步增加，并且容易发生出血。另一方面，肿瘤细胞更加容易通过高通透性的血管进入血液循环，为血行转移的发生建立条件。

（三）血流灌注与缺氧

与正常组织相比，肿瘤的血液灌注更为复杂紊乱，主要表现为肿瘤的血液灌注分布不均和缺氧。根据血供的不同，常将肿瘤组织分为坏死区、半坏死区、边缘区和富血管区。此外，微血管血流阻力增加，进一步导致了肿瘤组织的灌注减少。肿瘤组织在血液循环中断的情况下生长不会超过1～2mm，当肿瘤血管提供的营养和氧气不足以支持肿瘤细胞生长时，伴有代谢产物的聚集，即出现肿瘤微环境的缺氧。缺氧又可以通过调节细胞代谢、影响上皮-间充质转换以及血管生成等多种机制加剧恶性肿瘤的发展。

正常生理情况下，脯氨酸羟化酶结构域蛋白2（prolyl hydroxylase domain protein 2，PHD2）利用氧气将缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）进行羟基化，促进蛋白酶体依赖的泛素化而降解。缺氧环境中，PHD2失活，HIF-1不被降解而转移至细胞核，与HIF-1β亚基形成转录因子复合物，进而与缺氧反应元件结合，启动下游的调控血管新生、细胞生存和糖代谢的基因表达。上调的基因包括：VEGF、胎盘生长因子、血管生成素2（angiopoietin 2，ANGPT2）、HGF和PDGF-B等促血管生成因子。随后，促血管生成因子与内皮细胞或平滑肌细胞表面的相应受体结合，进一步增加肿瘤血管的新生。例如，HIF-1可以通过增强VEGF的转录活性和mRNA的稳定性，促进VEGF的表达，通过与血管内皮细胞表面的VEGFR 1和VEGFR 2结合，从而促进内皮细胞的增殖和迁移，促进肿瘤血管的新生。

目前，改善肿瘤血管使其有序化、纠正缺氧成为抗血管新生的研究热点。临床研究发现，放疗和化疗药物可能对肿瘤血液灌注及缺氧有所影响。例如，局部放疗可以增加肿瘤组织的血液灌注和减少肿瘤组织的缺氧。有趣的是，抗疟药氯喹通过调控内皮细胞Notch1信号通路的激活，NICD入核和靶基因转录水平的调控，增加肿瘤血液灌注，减少缺氧，从而抑制肿瘤细胞的转移和扩散。

（四）骨髓源性细胞的募集

肿瘤微环境中的间质细胞（tumor-associated stromal cell，TASC）来源于骨髓造血干细胞的募集，在肿瘤微环境中分化形成单核-巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等。此外，TASC还可来源于非造血干细胞，例如，骨髓源性的内皮和间充质细胞，共同参与肿瘤微环境的维持和促进血管新生。肿瘤细胞释放髓细胞趋化因子CCL2、CCL11、CSF1、CSF2、CSF3和VEGF-A等，可将循环中的未成熟髓细胞募集到肿瘤组织中；这些髓细胞从血管渗出后，分别分化为TAM、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等。其中，一些髓细胞在肿瘤微环境中还保持未成熟的表型，如M-MDSC和粒细胞MDSC（granulocytic-MDSC，G-MDSC）。髓细胞通过释放VEGF-A、FGF2、趋化因子CXCL8、Wnt7B等促进血管新生作用。此外，髓细胞也可释放炎症因子IL-1β、IL-6、TNF、MMP和组织蛋白酶等协同发挥促血管新生作用。其中，MMP9可以降解肿瘤组织ECM组分，动员与之结合的VEGF-A释放，进而与血管内皮细胞的VEGFR 2结合，启动肿瘤血管的新生。循环中高表达Tie2蛋白的TAM通过与血管内皮细胞相互作用，以旁分泌促血管新生因子和重塑ECM的两种机制促进血管出芽和成熟。同时，内皮细胞来源的ANGPT2则通过自分泌的方式与自身的Tie2受体结合，促进白细胞渗出和介导TAM与内皮细胞的相互作用，进一步加强肿瘤血管的新生。

肿瘤微环境中的细胞和释放的代谢产物、细胞因子和趋化因子对肿瘤微环境进行着精细的调节，发挥促血管新生或抑制血管新生的作用，以满足肿瘤组织快速生长和侵袭转移的需求。肿瘤微环境中主要的细胞组成、分泌的调控因子及血管新生调控作用总结如下（表4-3-1）。

表4-3-1　肿瘤微环境中的血管新生调控因子

注：CAF.肿瘤相关成纤维细胞；CXCL. CXC-chemokine ligand，CXC趋化因子配体；ECM.细胞外基质；FGF2.成纤维细胞生长因子2；HIF.缺氧诱导因子；ROS.活性氧；TAM.肿瘤相关巨噬细胞；TH.T辅助细胞；Treg细胞.调节性T细胞。

三、血管新生在CRC进展中的作用

（一）血管新生与CRC的发生与转移

肿瘤血管新生是CRC肿瘤生长和转移的基础，肿瘤组织的血管密度、形态和功能均出现与正常肠黏膜的明显差异。CRC肿瘤组织的微血管密度（microvessel density，MVD）检测发现，腺癌组织的MVD明显高于正常肠黏膜或结肠息肉组织，并显示出与肿瘤血行转移的相关性。在对重要的促血管生成因子VEGF进行关注时，发现CRC组织中VEGF及其受体蛋白的表达与MVD成正相关，且与局部淋巴管浸润、神经浸润，以及肿瘤的远处转移成正相关。这些研究提示血管新生是CRC恶性转化和进展的危险因素。

炎症反应是CRC演进中的重要环节，也决定了CRC肿瘤组织中特殊的肿瘤微环境构成。其中，COX-2在炎症刺激下激活，通过产生PGE2，调节微环境中VEGF的活性，促进血管内皮细胞的迁移和血管新生。研究证明，COX-2和VEGF的上调在抑癌基因 APC 突变的小鼠肠癌形成中发挥重要的促肿瘤生长和促血管新生双重作用。肿瘤微环境中下调的趋化因子CCL19可通过与趋化因子受体7结合，抑制ERK信号通路及下游的HIF-1α活性及VEGF-A的表达，从而发挥抑制肿瘤血管新生和抑制肿瘤细胞迁移的作用。同属于Tie2配体的Ang1和Ang2是血管成熟的重要调控因子，Ang1激活Tie2而发挥促进新生血管成熟和有序化的功能；而Ang2则很大程度降低血管的稳定性，可促进CRC肿瘤细胞的转移。此外，血管调控因子FGF、PDGF等在CRC中异常升高，通过VEGF通路的激活促进肿瘤血管新生，满足肿瘤生长和扩散的需要。

（二）靶向VEGF通路在CRC中的应用

肿瘤血管新生极大程度促进CRC的生长和转移。抑制肿瘤血管新生通路，促进肿瘤血管的成熟和有序化是目前抗血管新生治疗的策略。研究发现，CRC肿瘤组织中以VEGF上调最为显著，而阻断VEGF通路成为CRC抗血管新生治疗的重要靶点。

靶向VEGF方面，贝伐单抗成为FDA第一个批准临床使用的抗VEGF单克隆抗体。贝伐单抗是CRC临床治疗中应用最广泛的抗VEGF药物，可以有效抑制肿瘤血管新生，抑制肿瘤细胞增殖并且诱导其凋亡。在CRC移植瘤模型中，贝伐单抗与氯喹联合使用，可以显著改善肿瘤血管灌注和抑制肿瘤细胞生长。贝伐单抗与奥沙利铂或伊立替康双联或三联用药，与单独化疗相比，可显著改善转移性CRC患者的无进展生存和总生存。靶向VEGFR方面，雷莫芦单抗是抑制VEGFR的人源IgG1单克隆抗体，已被批准与FOLFIRI方案（氟尿嘧啶、伊立替康和亚叶酸）联合，用于转移性CRC的二线治疗。雷莫芦单抗可以选择性靶向VEGFR 2，诱导其胞外结构域构象改变，从而阻止VEGF与靶向受体结合。在Ⅲ期临床试验中，将雷莫芦单抗添加于FOLFIRI的化疗方案中，可延长接受过贝伐单抗、奥沙利铂和氟尿嘧啶化疗的转移性CRC患者的总生存。可溶性融合蛋白阿柏西普是由VEGFR 1和VEGFR 2的配体结合结构域与人IgG1的Fc片段融合形成的蛋白，以高亲和力结合VEGF，并阻止VEGF与VEGFR相互作用。Ⅲ期临床试验表明，阿柏西普与FOLFIRI方案联合，相较于FOLFIRI单独治疗，可显著改善进展期CRC患者的总生存和无进展生存。酪氨酸激酶抑制剂瑞戈非尼被FDA批准用于治疗对标准化疗无效的转移性CRC患者。通过广泛抑制多种激酶活性（包括VEGFR 1、VEGFR 2、VEGFR 3），发挥抗血管生成，阻断肿瘤细胞增殖、转移及免疫逃逸的作用。Ⅲ期临床试验中，瑞戈非尼显著提高了转移性CRC患者的总生存和无进展生存。

综上，随着肿瘤血管新生调控机制研究的不断深入，靶向肿瘤血管新生药物的开发为难治性和转移性CRC患者的治疗带来新的思路。

（吴华　万珊）

第四节　肿瘤微环境的代谢

代谢是细胞维持能量平衡、结构功能和信号交流的重要基础。CRC在发生发展过程中，不仅肿瘤细胞自身会发生代谢重编程，表现出与正常细胞不一样的代谢特征。肿瘤微环境内的其他细胞，如各种免疫细胞和基质细胞等，也会受到各类信号如缺氧和低pH的调节，代谢途径发生改变并影响这些细胞的生物学功能，进而影响CRC的发生发展。

一、CRC肿瘤微环境的整体代谢特征

CRC肿瘤微环境的代谢特征由肿瘤细胞自身和肿瘤微环境内其他各种细胞的相互作用联合驱动。一方面，肿瘤细胞通过内在机制激活信号分子，这些信号分子直接调节代谢酶的活性和代谢物的产生，从而改变微环境内其他细胞的代谢过程。另一方面，各种外源性信号包括微环境内各种因子或代谢物，可以反过来进一步调控肿瘤细胞的代谢途径。了解肿瘤微环境内驱动细胞代谢的内在和外在机制对于肿瘤的防治非常重要。下面主要介绍CRC肿瘤微环境的整体代谢特征和形成原因（图4-4-1）。

图4-4-1　CRC肿瘤微环境的整体代谢特征

（一）缺氧

众所周知，氧气是生命活动不可或缺的，组织细胞长期暴露在缺氧环境时，会产生不可逆的损伤。在实体肿瘤中，由于肿瘤细胞的快速分裂、血管生成不足和血液流动异常等原因，肿瘤组织内不同区域氧浓度差异很大，很多区域处于缺氧状态。缺氧与肿瘤的恶化、不良预后、放疗和化疗的耐药性等相关。缺氧是肿瘤微环境的一个重要特征，通过激活HIF-1的合成，促进癌细胞合成VEGF、碱性成纤维细胞生长因子等，最终促进肿瘤血管的形成及肿瘤发展和恶化。在结直肠炎患者中发现 NAIL 基因通过核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）调节炎症，并且NF-κB和HIF信号通路在介导炎症发生过程中相互作用。另外有研究显示，缺氧会导致CRC对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性降低。在缺氧条件下CRC细胞也会发生氨基酸代谢的改变。miR-210作为一种缺氧生物标志物，靶向miR-21和氨基酸代谢途径可能提供CRC的治疗策略。

（二）低pH

由于肿瘤细胞会优先利用糖酵解而不是氧化磷酸化来获得能量，因此肿瘤微环境呈现酸性（低pH）状态。肿瘤细胞以葡萄糖作为底物，诱导葡萄糖受体启动糖酵解级联反应，称为厌氧糖酵解。这种代谢变化导致肿瘤细胞内乳酸增加，与此同时细胞内的H ⁺ 扩散转运至细胞间质，引起肿瘤微环境内pH降低。低pH环境促进免疫抑制性微环境的形成，帮助肿瘤细胞产生免疫逃逸。目前科学家基于肿瘤微环境呈现酸性的特点，开发了选择性抗体及CAR-T细胞治疗技术，可以增加抗体和CAR-T对肿瘤组织的靶向性，降低对正常组织的毒性。

（三）营养物质（葡萄糖、氨基酸等）缺乏

肿瘤细胞快速消耗大量葡萄糖和氨基酸等，导致细胞外营养物质含量降低，并进而影响肿瘤微环境内其他细胞的代谢和功能。例如，肿瘤微环境内营养物质缺乏会抑制细胞毒性T细胞的mTOR活性、糖酵解能力和IFN-γ的产生，从而削弱其抗肿瘤活性。在CRC细胞中，利用抗体封锁免疫检查点，能够下调糖酵解代谢酶和糖酵解反应，从而增加肿瘤微环境中葡萄糖的可利用性并协助细胞毒性T细胞发挥作用。因此，通过阻断癌细胞对葡萄糖的摄取，并将更多的葡萄糖供给浸润的T细胞，可以恢复抗肿瘤T细胞的抗肿瘤反应。另外，Treg细胞为了在肿瘤微环境的低糖条件下存活，也会发生代谢重编程，能够依赖叶酸氧化和氧化磷酸化。

肿瘤细胞对精氨酸的利用也会增加，导致微环境内精氨酸的含量减少。充足的精氨酸诱导整体代谢的变化，促进中央记忆T细胞的产生，而精氨酸的限制则抑制效应T细胞的功能。补充精氨酸和抑制精氨酸降解是恢复效应T细胞功能的有效策略。正常细胞可通过自身合成产生谷氨酰胺，但肿瘤细胞依靠自身合成的谷氨酰胺不能满足其快速增殖的需要，需要通过膜上转运体从胞外摄入谷氨酰胺或增强谷氨酰胺代谢通路中关键代谢酶的表达与活性，以维持细胞快速增殖的需要。抑制谷氨酰胺代谢的中间产物对信号转导通路的调节或抑制谷氨酰胺的摄入，可以作为肿瘤治疗的潜在方式。

二、CRC肿瘤微环境内主要细胞群的代谢特征及功能变化

由于肿瘤微环境代谢状态的改变，微环境内的肿瘤细胞和其他细胞既存在营养竞争，又有代谢途径之间的互相调控，例如免疫细胞可以利用多条代谢途径促进肿瘤细胞的生长。另外科学家也发现，肿瘤细胞与免疫细胞的代谢途径之间以及不同免疫细胞的代谢途径之间，既存在相似处又存在很大差异，深入了解这些差异可以特异地针对肿瘤细胞的代谢开展肿瘤治疗。下面主要介绍CRC肿瘤微环境内主要细胞群的代谢特征及由此引起的功能变化（图4-4-2）。

图4-4-2　CRC肿瘤微环境内主要细胞群的代谢特征

（一）MDSC的代谢

骨髓来源的造血干细胞可分化为未成熟的髓样细胞，然后分化为单核细胞和粒细胞。但是在肿瘤等病理情况下，持续的炎症信号使未成熟的髓样细胞偏离正常分化，与生理分化的髓样细胞相比，这些细胞具有表型和形态不成熟，吞噬功能较弱，以及抗炎和免疫抑制等特点，这种异质细胞群体称为MDSC。越来越多的证据表明，MDSC是恶性肿瘤的基本特征之一，也是肿瘤治疗的潜在靶点。在人类和小鼠中主要存在两大类MDSC，即前述的PMN-MDSC和M-MDSC。CRC患者血液和肿瘤组织中MDSC的数量均高于健康个体，这种升高与CRC的肿瘤分期及其恶性转移有关。MDSC能够抑制自体T细胞的体外增殖。将MDSC阻断后，会促进T细胞功能恢复和IFN-γ分泌，抑制肿瘤进展。

肿瘤微环境中营养物质和氧气的缺乏迫使免疫细胞改变其代谢，以适应这种环境。MDSC通过选择最有效的代谢途径来感知环境并做出反应，以维持其免疫抑制和促肿瘤功能。PMN-MDSC内脂肪酸转运蛋白2（fatty acid transport protein 2，FATP2）调控脂肪酸的摄取和PGE2的合成。通过抑制FATP2的活性能够降低PMN-MDSC的免疫抑制功能。M-1α是肿瘤微环境中MDSC分化和功能调节的关键因子，激活HIF-1α诱导MDSC从氧化磷酸化向糖酵解转变。另外，MDSC可以通过从微环境中去除精氨酸、色氨酸和半胱氨酸等必需代谢产物来调节T细胞功能。通过一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）介导的精氨酸分解代谢是MDSC的一个关键抑制机制，其释放的过氧亚硝酸盐可诱导T细胞凋亡以及抑制T细胞功能。吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）依赖的色氨酸代谢是MDSC抑制免疫应答的另一个途径。MDSC通过IDO将色氨酸分解为N-甲酰基犬尿氨酸，从而降低微环境内色氨酸的水平。

（二）TAM的代谢

TAM是CRC肿瘤微环境中最具代表性的炎症细胞之一，TAM的高度浸润与CRC患者生存率有关。TAM还分泌支持肿瘤生长的抗炎细胞因子和生长因子，以及调节组织重塑和肿瘤扩张的蛋白水解酶。M1TAM和M2型TAM的精氨酸代谢方式不同，M1型TAM通过上调NOS2表达以产生瓜氨酸和一氧化氮来实现精氨酸代谢。M2型TAM通过精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）产生尿素、多胺和鸟氨酸。

TAM能够被肿瘤微环境所影响，获得不同的代谢和功能特征，从促炎（M1型）状态转变为抗炎（M2型）状态。M1型TAM通过AKT/mTOR/HIF途径诱导糖酵解，产生MAPK介导的ROS以杀伤肿瘤细胞。另一方面，肿瘤细胞利用有氧糖酵解，将葡萄糖分解并分泌乳酸，诱导TAM中的VEGF和Arg1表达，使其向M2型TAM极化。活化的M2型TAM通过提取、分解或储存脂肪细胞释放的游离脂肪酸以合成甘油三酯并发生脂质代谢重编程。此外，TAM中过氧化物酶体增殖体激活受体γ通路的下调导致衣康酸盐分泌增加，衣康酸盐可调节M2巨噬细胞并促进肿瘤进展。

（三）T细胞的代谢

CD4 ⁺ 和CD8 ⁺ 效应T细胞形成了抗肿瘤免疫反应的关键细胞群。幼稚T细胞在识别抗原提呈和共刺激因子的信号后，进行增殖及代谢重塑反应。很早的研究已经发现有氧糖酵解的上调是T细胞活化的标志，最近也有研究发现三羧酸循环代谢和氧化磷酸化上调也是CD4 ⁺ 和CD8 ⁺ T细胞活化的关键。三羧酸循环代谢在T细胞激活后的24小时内被上调，有氧糖酵解的上调更为迅速，发生在激活后6小时内。

HIF-1的转录活性均在T细胞的活化过程中上调，进而引起糖代谢重编程。HIF-1通过转录调控，促进糖酵解相关酶（如丙酮酸激酶、己糖激酶2和葡萄糖转运蛋白1）的表达上调。糖酵解途径中来自近端代谢产物的途径也是T细胞活化和功能的组成部分。磷酸戊糖途径代谢促进6-磷酸葡萄糖生成NADPH和5-核糖。在CD4 ⁺ T细胞激活后，进入磷酸戊糖途径的葡萄糖显著增加。磷酸戊糖途径是NADPH的主要来源途径，也是新激活的CD8 ⁺ T细胞中脂肪酸和质膜生成所必需。NADPH对于T细胞内的氧化还原稳态的维持也至关重要。激活的T细胞内的ROS水平需要精细调控，ROS在效应T细胞的活化中起着重要作用，已被证明可促进CD4 ⁺ 和CD8 ⁺ T细胞中活化T细胞核因子依赖性的IL-2表达。另一条起源于早期糖酵解反应的途径是己糖胺生物合成途径（hexosamine-biosynthesis pathway，HBP），是糖基化底物的主要细胞来源，HBP依赖于葡萄糖和谷氨酰胺的代谢，并且对它们发生反应。HBP的主要底物UDP-N-乙酰基葡萄糖胺对于效应CD4 ⁺ 和CD8 ⁺ T细胞的扩增和功能至关重要。

活化的T细胞也依赖于氨基酸代谢来支持蛋白质和核苷酸的合成。氨基酸转运蛋白，包括SLC7A5、SLC38A1、SLC38A2和SLC1A5等在T细胞激活后被明显上调。氨基酸代谢可以直接调控T细胞的功能，例如，亮氨酸是效应CD8 ⁺ 和CD4 ⁺ T细胞中mTORC1信号转导、效应功能和分化所必需。活化的T细胞还可以快速代谢精氨酸，外源性精氨酸的补充改善T细胞的适应性并增加记忆T细胞的生成。丝氨酸、色氨酸和半胱氨酸也是T细胞反应的重要营养成分，是抗肿瘤免疫反应的重要介质。色氨酸是一种必需氨基酸，在肿瘤微环境中是决定T细胞反应强度和有效性的重要因素。与正常培养基相比，在不含色氨酸的培养基中，T细胞的增殖和活化受到强烈抑制。

活化的T细胞还可以重新编程脂质代谢，促进脂质合成和胆固醇摄取，这对细胞膜的合成至关重要，这一过程分别由固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1）和SREBP2介导。缺少SREBP1和SREBP2活性的小鼠中，CD8 ⁺ T细胞的增殖、代谢重编程和抗病毒活性都被抑制。此外，在CD8 ⁺ T细胞体外活化和扩增过程中，细胞膜中的胆固醇含量受乙酰辅酶A乙酰转移酶1（acetyl coenzyme A acetyltransferase 1，ACAT1）调节。在过继转移小鼠肿瘤模型中， ACAT1 基因敲除的CD8 ⁺ T细胞中细胞质膜胆固醇增加，改善了T细胞受体聚集和信号转导，从而促进细胞增殖，增强对肿瘤的杀伤力，通过抑制ACAT1的活性可以增强小鼠的抗肿瘤作用。

（四）CAF的代谢

不同于正常成纤维细胞，CAF能够通过调节细胞外基质和产生促肿瘤信号分子，促进肿瘤生长、侵袭和转移。抑制异柠檬酸脱氢酶3复合物α亚基（isocitrate dehydrogenase 3α，IDH3α）能够使细胞从氧化磷酸化代谢途径转变到糖酵解代谢途径。与正常成纤维细胞相比，CRC肿瘤内CAF的IDH3α表达显著降低。IDH3α的下调减少α-酮戊二酸的生成，从而减少向延胡索酸盐和琥珀酸盐的转化并抑制脯氨酰羟化酶2，稳定HIF-1α和驱动糖酵解途径，因此增加CAF中乳酸的产生。

此外，研究发现某些代谢途径在CAF和肿瘤细胞中不同。例如，在癌细胞中，谷氨酰胺抑制细胞凋亡和自噬，同时线粒体活性增加，而在CAF中观察到较低的线粒体活性依赖的自噬增加。CAF中的脂质代谢重编程还促进CRC细胞的迁移。研究发现，与正常成纤维细胞相比，CAF中的脂肪酸、甘油二酯、磷脂酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺显著上调，伴有较高的脂肪酸和磷脂代谢水平。CAF代谢重编程使脂肪酸合成增加，促进CRC细胞中脂肪酸摄取并增强上皮-间充质转换和肿瘤转移。总之，癌细胞和CAF之间的代谢途径存在紧密的相互调控。

三、肿瘤微环境的代谢对CRC发生和进展的影响

CRC属于实体恶性肿瘤，肿瘤内部不仅包含CRC细胞，还包含基质细胞、免疫细胞、内皮细胞及细胞外基质和信号分子，如趋化因子、细胞因子和外泌体等。CRC细胞的新陈代谢受到它们所处微环境的高度影响，因此需要将研究重点从“仅肿瘤细胞”转变到更复杂的网络系统，包括微环境内不同类型的细胞和非细胞成分等。下面主要介绍肿瘤微环境的代谢对CRC发生和进展的影响。

（一）肿瘤微环境的代谢状态影响CRC进展

肿瘤微环境由不同类型的细胞组成并且调控肿瘤进展。例如，内皮细胞和基质细胞可帮助维持肿瘤生长，而细胞毒性T细胞抑制肿瘤进展，Treg细胞又通过抑制细胞毒性T细胞以维持肿瘤生长。一碳代谢、糖酵解和TCA循环等通路不仅对肿瘤细胞的增殖非常重要，而且对肿瘤微环境中内皮细胞、基质细胞、免疫细胞生存和功能发挥也至关重要。因此，肿瘤细胞与肿瘤微环境内的其他类型细胞存在营养竞争。例如，肿瘤微环境内某些氨基酸代谢可能被限制，包括精氨酸、色氨酸、丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸，它们不仅是肿瘤细胞增殖所必需的，也是细胞毒性T细胞功能维持所必需的。另外，营养匮乏引起肿瘤细胞自噬增加，自噬除了帮助肿瘤细胞在营养缺乏时生存，还帮助增加肿瘤微环境的免疫抑制作用。

此外，肿瘤微环境中不同类型细胞之间也存在代谢相互调控，这是肿瘤细胞在不利条件下持续生长的策略。脂质作为细胞膜的结构成分、信号分子和能量提供者，是细胞生命活动所必需的。在侵袭性CRC细胞中检测到大量脂质，这与CRC细胞中脂肪生成上调一致。据报道，脂肪酸代谢途径异常可推动肿瘤的发展和进展，与CRC患者的预后不良相关。目前有研究表明，由 MPC1 和 MPC2 基因产物组成的线粒体丙酮酸载体（mitochondrial pyruvate carrier，MPC）调节丙酮酸氧化。 MPC1 在多种癌症中缺失或表达不足，与癌症预后不良相关。重新表达 MPC1 和 MPC2 的癌细胞线粒体丙酮酸氧化增加，而重新表达MPC会增加线粒体丙酮酸氧化，并损害CRC细胞的非锚定生长。CRC细胞在肿瘤微环境中表现出代谢异质性，即一些癌细胞表现出低MPC的厌氧糖酵解，而其他癌细胞则使用高MPC的氧化磷酸化产生腺嘌呤核苷三磷酸。这种异质性使得肿瘤生态系统中癌细胞和宿主细胞之间的共生代谢交换成为可能。

（二）通过改变肿瘤微环境的代谢来防治CRC的研究进展

CRC细胞通过肿瘤微环境成分的活化及信号通路和代谢物的改变来支持其不受控制的增殖、转移和耐药性。靶向肿瘤微环境中失调的代谢状态并干预其串扰可能为CRC提供治疗机会。

在“反向瓦尔堡效应”中，CAF是肿瘤微环境中最重要的基质细胞，它们进行有氧糖酵解，产生乳酸盐并将其释放到肿瘤微环境中以促进肿瘤细胞的氧化磷酸化。这种CAF供给肿瘤细胞乳酸的方式可以被单羧酸转运蛋白MCT1/MCT4抑制剂来抑制。CAF对肿瘤细胞谷氨酰胺的供给，也可以通过抑制谷氨酰胺合成酶作为靶向治疗的一种方式。

肿瘤微环境中免疫细胞的功能在很大程度上受到肿瘤发展过程中代谢重编程的影响，导致抗肿瘤免疫反应受损，因此修复受损的免疫系统可以成为靶向治疗的策略。免疫检查点蛋白PD-1和CTLA-4是T细胞抗肿瘤活性的负调节因子。PD-1与其配体PD-L1之间的相互作用影响代谢途径，导致肿瘤微环境中T细胞衰竭。在CRC动物模型中发现，使用针对CTLA-4的单克隆抗体阻断CTLA-4可以增强抗肿瘤免疫力。通过基因工程和抗体治疗阻断PD-1不仅抑制CRC细胞的生长，还抑制了它们向肺部的转移。几种靶向PD-1的单克隆抗体，如哌姆单抗（pembrolizumab）和纳武单抗（nivolumab）被FDA批准用于治疗具有转移性的CRC。然而，免疫检查点治疗的效率可能受到肿瘤微环境中代谢失调的限制。因此，将靶向免疫检查点与肿瘤微环境的代谢相结合，可以改善治疗效果。例如，组合谷氨酰胺酶1（glutaminase 1，GLS1）抑制剂与PD-1和PD-L1抗体，能够通过抑制CRC中代谢检查点，逆转T细胞衰竭，从而增强抗肿瘤的效果。目前已有初步研究表明，谷氨酰胺酶抑制剂CB-839和免疫检查点抑制剂纳武单抗（nivolumab）的组合效果良好。因此，代谢调控与免疫治疗相结合，可能会为CRC患者提供新的治疗机会。

（李培山）

第四章 结直肠癌肿瘤微环境

第一节 免疫微环境