第三节
鸡内金配方颗粒标准汤剂研究

一、鸡内金标准汤剂的制备

鸡内金标准汤剂的制备工艺研究，均按照国家药典委员会起草的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》中“标准汤剂的制备”有关要求进行，根据研究结果，确定鸡内金标准汤剂的制备方法如下：

取鸡内金饮片100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加入9倍量水，浸泡30分钟后，武火（功率500W）煮沸后文火（功率200W）保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热滤过，滤液迅速用冷水冷却。第二次加7倍量水，武火（功率500W）煮沸后文火（功率200W）保持微沸25分钟，煎液用350目筛网趁热滤过，滤液迅速用冷水冷却，合并两次煎液。将煎液转移至圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩（温度：65℃；真空度：-0.08MPa～-0.1MPa），转速50～90r/min，浓缩至体积约为100ml；在磁力搅拌下，精密吸取煎液2ml均匀分装于10ml西林瓶中，转移至真空冷冻干燥机中冻干，真空冷冻干燥工艺参数见表7-3-1，冻干曲线见图7-3-1，取出，轧铝盖，即得。鸡内金标准汤剂样品制备测定数据见表7-3-2。

二、含量测定

（一）色谱条件

选择Thermo Acclaim C ₁₈ （4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈-0.1mol/L醋酸钠溶液（用醋酸调节pH值至6.5）（7∶93）为流动相A，以乙腈-水（4∶1）为流动相B，按表7-3-3中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为254nm；进样量为5μl。

（二）对照品溶液的制备

取甘氨酸对照品4.282mg、丙氨酸对照品2.570mg、脯氨酸对照品3.830mg、苯丙氨酸对照品3.813mg，精密称定，置25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml含甘氨酸171.28μg、丙氨酸102.80μg、脯氨酸153.05μg、苯丙氨酸152.52μg的混合溶液。

（三）供试品溶液的制备

取鸡内金标准汤剂适量，研细，取约0.1g，精密称定，置氨基酸水解管中，精密加入6mol/L盐酸溶液10ml，分别置150℃水解3小时，取出，放冷，滤过，滤液移至蒸发皿中，水解管与滤渣再用水10ml分次洗涤，滤过，滤液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。

精密量取上述供试品溶液及对照品溶液各5ml，分别置于25ml量瓶中，加0.1mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5ml，1mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5ml，摇匀，室温放置1小时后，加50%乙腈至刻度，摇匀。取10ml，加正己烷10ml，振摇，放置10分钟，取下层溶液，滤过，取续滤液，即得。

（四）方法学验证

方法学考察合格（具体内容略）。

（五）测定结果

鸡内金标准汤剂的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸含量测定及转移率结果见表7-3-4～表7-3-7。

三、特征图谱

测定方法同本章第二节鸡内金药材和饮片研究“三、药材及饮片质量标准”下“（三）特征图谱”项。

（一）方法学考察

1.专属性考察

取鸡内金标准汤剂溶液、空白溶剂和参照物溶液，精密吸取上述溶液各5μl，注入液相色谱仪，按拟定色谱条件测定，记录色谱，详见图7-3-2。

结果显示，供试品色谱在与对照品色谱相应的保留时间处有相同的色谱峰，且空白溶剂无干扰，说明该方法专属性良好。

2.精密度考察

取鸡内金标准汤剂供试品溶液，连续进样6次测定分析，以脯氨酸峰为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算连续6次进样结果的RSD值，实验结果见表7-3-8、表7-3-9。

结果显示，同一份供试品溶液连续进样6次，以脯氨酸峰为参照峰S，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD值在0.01%～0.04%范围内，相对峰面积RSD值在0.09%～0.73%范围内，均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

3.稳定性考察

取鸡内金标准汤剂特征图谱供试品溶液，于常温下放置，分别在0、2、3、7、16、24小时进样测定，以脯氨酸峰为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，结果见表7-3-10、表7-3-11。

结果显示，同一份供试品溶液分别在0、2、3、7、16、24小时进行分析，以脯氨酸峰为参照峰S，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD值在0.01%～0.17%范围内，相对峰面积RSD值在0.90%～3.61%范围内，表明供试品溶液在24小时内相对稳定。

4.重复性考察

取同一批鸡内金标准汤剂，平行6份，按鸡内金标准汤剂特征图谱供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，进样测定分析，以脯氨酸峰为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，结果见表7-3-12、表7-3-13。

结果显示，同一批样品重复测定6次，以脯氨酸峰为参照峰S，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD值在0.01%～0.05%范围内，相对峰面积RSD值在0.76%～2.98%范围内，均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

5.中间精密度考察

由其他分析人员在不同日期取同一批鸡内金标准汤剂适量，按鸡内金标准汤剂特征图谱项下供试品溶液制备方法制备样品，平行6份，并在不同色谱仪下操作，进样测定分析，以脯氨酸峰为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值，实验结果见表7-3-14、表7-3-15。

人员1 仪器：Thermo U3000；编号：208034；实验日期：2020年3月26日

人员2 仪器：Waters ARC；编号：208021；实验日期：2020年3月27日

结果显示，由不同的分析人员在不同时间于不同的仪器上操作，同一批样品重复测定6次，以脯氨酸峰为参照峰S，各特征峰与S峰的相对保留时间RSD值在0.02%～0.09%范围内，相对峰面积RSD值在0.58%～2.79%范围内，相对保留时间与重复性试验6个数据的RSD值在0.16%～0.81%范围内，相对峰面积与重复性试验6个数据的RSD值在1.05%～3.43%范围内，相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于5.0%，说明该方法中间精密度良好。

（二）测定结果

按照高效液相色谱法建立特征图谱测定方法，并进行方法学考察，对18批鸡内金标准汤剂特征图谱测定，最终确定了鸡内金标准汤剂特征图谱标准：规定鸡内金标准汤剂供试品溶液特征图谱中应呈现11个特征峰（图7-3-3～图7-3-5），其中9个峰应分别与相应对照品参照物峰保留时间相对应，与脯氨酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和RSD值，其相对保留时间应该在规定值的±10%之内［规定值为：1.07（峰5）、1.48（峰 8）］。实验结果见表 7-3-16。

峰1：甘氨酸；峰2：苏氨酸；峰3：丙氨酸；峰4（S）：脯氨酸；峰6：酪氨酸；峰7：缬氨酸；峰9：异亮氨酸；峰10：亮氨酸；峰11：苯丙氨酸。

峰1：甘氨酸；峰2：苏氨酸；峰3：丙氨酸；峰4（S）：脯氨酸；峰6：酪氨酸；峰7：缬氨酸；峰9：异亮氨酸；峰10：亮氨酸；峰11：苯丙氨酸。

四、质谱鉴别

测定方法同本章第二节鸡内金药材和饮片研究“三、药材及饮片质量标准”下“（四）质谱鉴别”项。

（一）方法学验证

1.专属性考察

精密吸取鸡内金标准汤剂溶液、空白溶剂溶液和对照品溶液各2μl，注入液质联用仪，按照拟定色谱与质谱条件测定（图7-3-6、图7-3-7）。

结果显示：缺鸡内金的空白溶剂供试品溶液图谱在与鸡源多肽1和鸡源多肽2对照品色谱相应的保留时间处未检出特征多肽离子峰，表明空白溶剂对方法中特征多肽离子对的检出无干扰，方法具有专属性。

2.稳定性考察

取鸡内金标准汤剂供试品溶液，分别在0、2、3、5、7、8、10、12小时精密吸取2μl注入液质联用仪，按拟定的色谱与质谱条件进行测定，以离子对的峰面积对溶液稳定性进行评价，测定结果见表7-3-17。

结果显示，供试品溶液在常温下放置12小时，4个特征多肽离子均能明显检出。表明供试品溶液在常温下放置12小时内，不影响特征多肽离子的鉴别。

3.耐用性考察

（1）不同色谱柱考察：

比较了 Agilent SB C ₁₈ 色谱柱（100mm×2.1mm，1.8μm）、Waters BEH C ₁₈ 色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm）和 YMC Triart C ₁₈ 色谱柱（100mm×2.1mm，1.9μm）3种不同品牌和类型的色谱柱对鸡内金标准汤剂特征多肽离子峰的检出影响。

取鸡内金标准汤剂供试品溶液，精密吸取2μl注入液质联用仪，按拟定的色谱与质谱条件进行测定，实验结果见表7-3-18、图7-3-8、图7-3-9。

注：1# 色谱柱为 Agilent SB C ₁₈ ；

2# 色谱柱为 Waters BEH C ₁₈ ；

3# 色谱柱为 YMC Triart C ₁₈ 。

结果显示：所使用的3种色谱柱均能明显检出规定的特征多肽离子，表明不同品牌和型号的色谱柱对鸡内金标准汤剂的特征多肽离子的检出鉴别无影响。

（2）不同流速考察：

比较0.27ml/min、0.30ml/min、0.33ml/min不同流速对鸡内金标准汤剂特征多肽离子峰的检出影响。

取鸡内金标准汤剂供试品溶液，精密吸取2μl注入液质联用仪，按拟定的色谱与质谱条件进行测定，实验结果见表7-3-19，图7-3-10、图7-3-11。

结果显示：通过考察3个不同的流速，均能明显检出规定的特征多肽离子，表明流速的小范围调整对鸡内金标准汤剂的特征多肽离子的检出鉴别无影响。

（3）不同柱温考察：

比较27℃、30℃、33℃不同柱温对鸡内金标准汤剂特征多肽离子峰的检出影响。

取鸡内金标准汤剂供试品溶液，精密吸取2μl注入液质联用仪，按拟定的色谱与质谱条件进行测定，实验结果见表7-3-20，图7-3-12、图7-3-13。

结果显示：通过考察3个不同的柱温条件，均能明显检出规定的特征多肽离子，表明柱温的小范围调整对鸡内金标准汤剂的特征多肽离子的检出鉴别无影响。

（4）不同液质联用仪的考察：

考察使用不同牌子的液质联用仪（岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪）对鸡内金标准汤剂特征多肽离子峰的检出影响。

取鸡内金标准汤剂供试品溶液，精密吸取2μl注入液质联用仪，按拟定的色谱与质谱条件进行测定，实验结果见表7-3-21、图7-3-14、图7-3-15。

结果显示：使用其他品牌（岛津）的三重四极杆液质联用仪，鸡内金标准汤剂的特征多肽离子对仍能明显检出。

综上所述，对鸡内金标准汤剂质谱鉴别分析方法进行了专属性考察，特征峰不受溶剂峰干扰，方法专属；对方法的溶液稳定性进行了考察，表明供试品溶液能在12小时内保持稳定。并对方法的耐用性进行了考察，表明不同色谱柱、不同流速、小范围的柱温变动以及不同品牌的液质联用仪，对特征多肽离子的检出无明显影响，方法的耐用性良好。

（二）样品的测定

1.标准汤剂的质谱鉴别 鸡内金标准汤剂质谱鉴别方法，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入液质联用仪，测定，即得。

以质荷比（m/z）379.21（双电荷）→ 571.36 和 m/z 379.21（双电荷）→ 385.26，m/z 785.41（双电荷）→941.51和m/z 785.41（双电荷）→245.08离子对提取的供试品离子流色谱中，所有批次的鸡内金标准汤剂均同时呈现与对照品色谱保留时间一致的色谱峰（表7-3-22）。

2.鸡不同部位标准汤剂的质谱鉴别6种不同品种鸡的鸡肉、鸡骨和鸡皮的标准汤剂，按鸡内金标准汤剂谱鉴别方法，分别制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入液质联用仪，测定，即得。

以质荷比（m/z）379.21（双电荷）→ 571.36 和 m/z 379.21（双电荷）→ 385.26，m/z 785.41（双电荷）→941.51和m/z 785.41（双电荷）→245.08离子对提取的供试品离子流色谱中，鸡肉、鸡骨和鸡皮的标准汤剂中均未同时呈现与对照品色谱保留时间一致的色谱峰（图7-3-16～图7-3-18）。

3.伪品禽类内金的质谱鉴别 鸡内金、鸭内金、鹅内金和鸽内金药材，按鸡内金药材和饮片的质谱鉴别方法，分别制备供试品溶液。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入液质联用仪，测定，即得。

以质荷比（m/z）379.21（双电荷）→ 571.36 和 m/z 379.21（双电荷）→ 385.26，m/z 785.41（双电荷）→941.51和m/z 785.41（双电荷）→245.08离子对提取的供试品离子流色谱中，鸭内金、鹅内金和鸽内金的标准汤剂中均未同时呈现与对照品色谱保留时间一致的色谱峰（图7-3-19、图7-3-20）。

本研究对鸡内金标准汤剂提取、固液分离、浓缩和冻干工艺进行了考察，制订了鸡内金标准汤剂制备工艺；建立鸡内金标准汤剂中4种氨基酸含量测定方法并根据出膏率及转移率确定了鸡内金标准汤剂中4种氨基酸的含量范围及转移率范围；建立鸡内金标准汤剂特征图谱，规定供试品色谱中应呈现11个特征峰，其中9个峰应分别与相应对照品参照物峰保留时间相对应，与脯氨酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间和RSD值，其相对保留时间应该在规定值的±10%之内［规定值为：1.07（峰5）、1.48（峰8）］。并确定了鸡内金标准汤剂的质谱鉴别方法，以质荷比（m/z）379.21（双电荷）→571.36和 m/z 379.21（双电荷）→ 385.26，m/z 785.41（双电荷）→ 941.51 和 m/z 785.41（双电荷）→245.08离子对提取的供试品离子流色谱中，供试品溶液色谱应同时呈现与对照品色谱保留时间一致的色谱峰。 lGDtCN3jbfEnlNi7HptRd14V608Nch0jj4m+qakOBOlo5igvV5RC7Z2RdWv830i+