第二节
鸡内金药材和饮片研究

一、药材来源

鸡内金为雉科动物家鸡 Gallus gallus domesticus Brisson的干燥砂囊内壁。杀鸡后，取出鸡肫，立即剥下内壁，洗净，干燥。本研究共收集鸡内金药材18批（JNJ-YC-01～JNJYC-18），其中山东临沂3批、山东菏泽3批、山东聊城3批、浙江金华3批、辽宁鞍山3批、山西吕梁3批。经广东一方制药有限公司质量中心鉴定，研究样品均为《中国药典》2020年版一部鸡内金项下规定的品种。

二、饮片炮制

按照《中国药典》2020年版一部鸡内金项下进行炮制，取鸡内金原药材，洗净，干燥，即得鸡内金饮片（JNJ-YP-01～JNJ-YP-18）。

三、药材及饮片质量标准

（一）性状

鸡内金药材为不规则卷片，厚约2mm。表面黄色、黄绿色或黄褐色，薄而半透明，具明显的条状皱纹，质脆，易碎，断面角质样，有光泽，气微腥，味微苦。

鸡内金饮片同药材（图7-2-1）。

（二）检测

按照《中国药典》2020年版一部鸡内金项下有关要求，对上述鸡内金药材及饮片进行检测，所有样品均符合规定，测定结果见表7-2-1、表7-2-2。

（三）特征图谱

1.色谱条件

以Thermo Acclaim C ₁₈ （4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；以乙腈-0.1mol/L醋酸钠溶液（用醋酸调节pH值至6.5）（7∶93）为流动相A；以乙腈-水（4∶1）为流动相B，表7-2-3中的规定进行梯度洗脱；按流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为254nm；进样量为 5μl。

2.参照物溶液制备

取甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、脯氨酸对照品、苯丙氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml含甘氨酸170μg、丙氨酸100μg、脯氨酸150μg、苯丙氨酸150μg的混合溶液。

取苏氨酸对照品、酪氨酸对照品、缬氨酸对照品、异亮氨酸对照品、亮氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml含苏氨酸95μg、酪氨酸140μg、缬氨酸100μg、异亮氨酸95μg、亮氨酸140μg的混合溶液。

取鸡内金对照药材适量，约0.1g，精密称定，置于氨基酸水解管中，精密加入6mol/L盐酸溶液10ml，150℃水解3小时，放冷，取出，滤过，滤液移至蒸发皿中，水解管与滤渣再用水10ml分次洗涤，滤过，滤液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀。

3.供试品溶液制备

取本品粉末（过三号筛）约0.1g，精密称定，置氨基酸水解管中，精密加入6mol/L盐酸溶液10ml，置150℃水解3小时，取出，放冷，滤过，滤液移至蒸发皿中，水解管与滤渣再用水10ml分次洗涤，滤过，滤液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。

精密量取上述供试品溶液及对照品溶液各5ml，分别置于25ml量瓶中，加0.1mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5ml，1mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5ml，摇匀，室温放置1小时后，加50%乙腈至刻度，摇匀。取10ml，加正己烷10ml，振摇，放置10分钟，取下层溶液，滤过，取续滤液，即得。

4.方法学验证

方法学考察合格（具体内容略）。

5.特征图谱的建立及共有峰的标定

（1）药材特征图谱的建立及共有峰的标定：

按鸡内金药材及饮片特征图谱方法，精密吸取5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

供试品色谱中应呈现11个特征峰（图7-2-2、图7-2-3），并应与对照药材参照物色谱中的11个特征峰保留时间相对应，其中9个峰应分别与相应对照品参照物峰保留时间相对应，以脯氨酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的±10%之内［规定值为：1.07（峰5）、1.48（峰8）］（表7-2-4）。

峰1：甘氨酸；峰2：苏氨酸；峰3：丙氨酸；峰4（S）：脯氨酸；峰6：酪氨酸；峰7：缬氨酸；峰9：异亮氨酸；峰10：亮氨酸；峰11：苯丙氨酸。

（2）饮片特征图谱的建立及共有峰的标定：

按鸡内金药材及饮片特征图谱方法，分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得（图7-2-4～图7-2-5）。

峰1：甘氨酸；峰2：苏氨酸；峰3：丙氨酸；峰4（S）：脯氨酸；峰6：酪氨酸；峰7：缬氨酸；峰9：异亮氨酸；峰10：亮氨酸；峰11：苯丙氨酸。

以脯氨酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间（表7-2-5）。

（四）质谱鉴别

1.色谱和质谱条件

以Agilent SB C ₁ （ ₈ 100mm×2.1mm，1.8μm）为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液作流动相B，按表7-2-6规定的梯度进行洗脱；柱温为30℃，流速为每分钟0.3ml，电喷雾正离子模式（ESI+），进行多反应监测（MRM），以质荷比（m/z）379.21（双电荷）→ 571.36 和 m/z 379.21（双电荷）→ 385.26，m/z 785.41（双电荷）→ 941.51和m/z 785.41（双电荷）→245.08作为检测离子对进行检测。进样2μl，按上述检测离子对测定的MRM色谱峰的信噪比均应大于3∶1。

2.对照品溶液的制备

取鸡源多肽1、鸡源多肽2对照品适量，精密称定，加1%碳酸氢铵溶液制成每1ml含鸡源多肽1、鸡源多肽2分别为2μg的混合溶液，即得。

3.供试品溶液制备

取本品粉末0.1g，加1%碳酸氢铵溶液25ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，再称定重量，用1%碳酸氢铵溶液补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液1ml，加胰蛋白酶溶液100μl（取序列分析用胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用时配制），摇匀，37℃恒温酶解12小时，作为供试品溶液。

4.方法学验证

方法学考察合格（具体内容略）。

5.样品的测定

药材及饮片的质谱鉴别：按鸡内金药材和饮片的质谱鉴别方法，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各2μl，注入液质联用仪，测定，即得。

以质荷比（m/z）379.21（双电荷）→ 571.36 和 m/z 379.21（双电荷）→ 385.26，m/z 785.41（双电荷）→941.51和m/z 785.41（双电荷）→245.08离子对提取的供试品离子流色谱中，所有批次的鸡内金药材均同时呈现与对照品色谱保留时间一致的色谱峰（图7-2-6、图7-2-7、表7-2-7、表7-2-8）。

以鸡内金标准汤剂质量标准和《中国药典》2020年版一部鸡内金项下质量标准为基础，研究制定了高于中国药典且具有与标准汤剂质量指标一致性的药材和饮片标准：①鸡内金药材二氧化硫残留量标准提高（规定不得过50mg/kg，药典一般要求不得过150mg/kg）；②新增重金属及有害元素含量检测项；③新增4种氨基酸的含量测定；④新增鸡内金药材特征图谱标准，并规定了11个特征峰的相对保留时间；⑤新增鸡内金两个鸡源多肽的质谱鉴别方法。饮片相关项同药材。后续研究将对原料、成品建立重金属及有害元素、33种禁用农残残留量检测，并长期积累数据，防止原料及生产过程中外源性有害物质的带入和累积，保证产品临床用药的安全性；所建立的质量标准，能定性、定量评价鸡内金质量，为鸡内金配方颗粒提供质量安全、品质优良、稳定的原药材。 kMf+22SKhxM/hTssQt/6rbmAL7WJeZZicdTldYquSTvPt5NXqv5aAe//R068veyg