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水蛭为我国传统活血化瘀药，《中国药典》2020年版规定水蛭药材为水蛭科动物蚂蟥（宽体金线蛭） Whitmania pigra Whitman、水蛭（日本医蛭） Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥（尖细金线蛭） Whitmania acranulata Whitman 的干燥全体，具有破血通经、逐瘀消癥的功能，临床上主要用于脑梗死、脑缺血等疾病。
中药配方颗粒是中药传统饮片与现代科技融合下的新生产物，作为中药传统饮片的补充，质量稳定可控，临床上疗效确切，可供随证加减，应用上即冲即服，更大程度上满足了现代快节奏需求。本研究以水蛭配方颗粒为研究对象，探讨其对正常大鼠和下腔静脉狭窄诱导的深静脉血栓模型大鼠的凝血功能的影响，以及抗凝血酶活性，以期为水蛭配方颗粒临床研究提供实验依据。
水蛭配方颗粒（批号：CG2008039，广东一方制药有限公司），利伐沙班片（批号：H20181086，拜耳医药保健有限公司），AllProtectTM动物组织核酸、蛋白稳定保存液（上海碧云天生物技术有限公司）。
电子天平（型号JJ3000，常熟市双杰测试仪器厂），分析天平［型号EL204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］，涡旋仪（型号XW-80A，海门市其林贝尔仪器制造有限公司），血栓弹力图仪［型号TEG ® 5000，唯美（上海）管理有限公司］。
SPF级SD大鼠，雌雄各半，220～260g，共50只，购自广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK（粤）2013-0020；饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF环境［SYXK（粤）2018-0085］。动物房环境温度范围为22～24℃，相对湿度为50%～60%，12小时照明/12小时黑暗明暗交替，工作照度200～300lx，动物照度15～20lx。自由饮食和饮水。
将SD大鼠按体重完全随机分为5个组：正常组，水蛭配方颗粒低、中、高剂量组，利伐沙班组。每组10只，雌雄各半，共计50 只。
（1）正常组：
灌胃给予超纯水，体积为10ml/（kg·d）；
（2）水蛭配方颗粒：
《中国药典》2020年版中水蛭的人用剂量为 1～3g/（d·人）。按人与动物体表面积等效剂量折算，大鼠的给药剂量为104.2～312.5mg生药/（kg·d）。则水蛭的低、中、高给药剂量为104.2mg生药/（kg·d）、312.5mg生药/（kg·d）、937.5mg生药/（kg·d）。选用批号CG2008039配方颗粒进行配制，该批号1g水蛭配方颗粒相当于生药4.0g。则低、中、高剂量CG2008039配方颗粒的给药剂量为26.04mg配方颗粒/（kg·d）、78.13mg配方颗粒/（kg·d）、234.38mg配方颗粒/（kg·d）。
（3）利伐沙班：
利伐沙班片用于治疗急性深静脉血栓（DVT）的初始治疗推荐人用剂量为每日30mg，按人与动物体表面积等效剂量折算，大鼠的给药剂量为3.125mg/（kg·d）。
大鼠灌胃给予水蛭配方颗粒、利伐沙班溶液，给药体积均为10ml/（kg·d），动物单次灌胃给药，给药1小时后采血。各组具体给药剂量和给药途径见表6-1-1。
表6-1-1 实验动物分组及给药
（1）高剂量水蛭配方颗粒：
给药剂量为234.38mg配方颗粒/（kg·d），大鼠灌胃给药体积为10ml/（kg·d），则溶液浓度为23.438mg/ml。按大鼠平均体重300g计算，该组5只动物需水蛭配方颗粒溶液15ml。因为采用梯度稀释法，因此需要配制22ml。称取约0.515 6g配方颗粒于50ml离心管，加入22ml超纯水，涡旋溶解。现配现用。
（2）中剂量水蛭配方颗粒：
给药剂量为78.13mg配方颗粒/（kg·d），大鼠灌胃给药体积为10ml/（kg·d），则溶液浓度为7.813mg/ml。按大鼠平均体重300g计算，该组5只动物需水蛭配方颗粒溶液15ml。因为采用梯度稀释法，因此需要配制21ml。用移液器取7ml高剂量水蛭配方颗粒于50ml离心管，加入14ml超纯水稀释。现配现用。
（3）低剂量水蛭配方颗粒：
给药剂量为26.04mg配方颗粒/（kg·d），大鼠灌胃给药体积为10ml（kg·d），则溶液浓度为2.604mg/ml。按大鼠平均体重300g计算，该组5只动物需水蛭配方颗粒溶液15ml。现配制15ml，则用移液器取5ml中剂量水蛭配方颗粒于50ml离心管，加入10ml超纯水稀释。现配现用。
（4）利伐沙班溶液的配制：
给药剂量为3.125mg/（kg·d），大鼠灌胃给药体积为10ml/（kg·d），则溶液浓度为0.312 5mg/ml（水溶性＜1mg/ml，25℃）。按大鼠平均体重300g计算，该组5只动物需利伐沙班溶液15ml。现配制15ml利伐沙班溶液，需利伐沙班4.688mg。已知每片含利伐沙班20mg，平均片重90mg，因此所需的利伐沙班片粉末的质量为W 称重 =4.688×90÷20=0.021 0g。精密称定，加入 15ml 超纯水，充分振荡混匀，现配现用。
给药后1 小时，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3.0ml/kg）麻醉。
（1）腹主动脉采血，取3ml血液到普通管（不含抗凝剂，不含促凝剂）中，4℃冰箱静置。以3 000rpm、25℃离心10 分钟，分离得到上清（即血清），于-80℃冷冻保存。
（2）TEG检测：继续取2ml血液于1个3.2%枸橼酸钠抗凝管中（枸橼酸钠∶全血=1∶9），上下翻转5次，室温静置至少15分钟后进行TEG检测，检测需在8小时内完成。
（3）体外凝血时间：将静脉采血针剪断，毛细管一端对准采血管，收集2管血液用于检测凝血时间。从血液充满毛细管开始计时，将毛细管置于玻璃皿上，30秒后开始折断毛细管的一端（接血的另一端开始折），50秒后每隔10秒折一次，当折断处出现血丝时，折另一端进行验证。两端均出现血丝的时间记为凝血时间。
所有数据以均数±标准差（ x ± s ）表示，并使用Graphpad Prism 5软件制图以及统计学分析。分析各组间的统计学差异采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）中的Dunnett多重比较试验。 P ≤0.05为显著差异， P ≤0.01为极显著差异。
由表6-1-2可见，水蛭配方颗粒及利伐沙班组的凝血时间与正常对照组的差异无统计学意义。
表6-1-2 水蛭配方颗粒和标准汤剂对正常大鼠凝血时间的影响（
±
s
，
n
=10）
续表
由表6-1-3可见，与正常对照组相比，给药组（水蛭配方颗粒）和阳性组（利伐沙班）的TEG值差异无统计学意义。
表6-1-3 水蛭配方颗粒和标准汤剂对正常大鼠TEG的影响（
±
s
，
n
=10）
本实验以正常的大鼠为给药对象，通过对凝血时间和TEG的检测考察水蛭配方颗粒对正常大鼠有无影响。结果表明：在本次实验下，水蛭配方颗粒对正常大鼠的凝血时间和TEG检测数值无影响。结果提示，本实验条件下，水蛭配方颗粒对正常大鼠的凝血功能没有影响。
水蛭配方颗粒（批号：CG2008039，广东一方制药有限公司），利伐沙班片（批号：H20181086，拜耳医药保健有限公司），AllProtectTM动物组织核酸、蛋白稳定保存液（上海碧云天生物技术有限公司）。
电子天平（型号JJ3000，常熟市双杰测试仪器厂），分析天平［型号EL204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］，涡旋仪（型号XW-80A，海门市其林贝尔仪器制造有限公司），血栓弹力图仪（型号TEG ® 5000，唯美（上海）管理有限公司）。
SPF级SD大鼠，雌雄各半，220～260g，共70只，购自广东省医学实验动物中心，许可证号SCXK（粤）2013-0020；饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF环境（SYXK（粤）2018-0085）。动物房环境温度范围为22～24℃，相对湿度为50%～60%，12h照明/12h黑暗明暗交替，工作照度200～300lx，动物照度15～20lx。自由饮食和饮水。
将SD大鼠按体重随机分为7组：正常组，假手术组，模型组，水蛭配方颗粒低、中、高剂量组，利伐沙班组。每组7只，雌雄各半，共计70只。
（1）正常组：
灌胃给予超纯水，体积为10ml/（kg·d）；
（2）假手术组：
灌胃给予超纯水，体积为10ml/（kg·d）；
（3）模型组：
灌胃给予超纯水，体积为10ml/（kg·d）；
（4）水蛭配方颗粒：
《中国药典》2020年版中水蛭的人用剂量为 1～3g/（d·人）。按人与动物体表面积等效剂量折算，大鼠的给药剂量为104.2～312.5mg生药/（kg·d）。水蛭的大鼠低、中、高给药剂量为104.2mg生药/（kg·d）、312.5mg生药/（kg·d）、937.5mg生药/（kg·d）。选用批号CG2008038配方颗粒进行配制，该批号1g水蛭配方颗粒相当于水蛭生药4.0g。则低、中、高剂量CG2008038配方颗粒的给药剂量为26.04mg配方颗粒/（kg·d）、78.13mg配方颗粒/（kg·d）、234.38mg配方颗粒/（kg·d）。
（5）利伐沙班：
利伐沙班片用于治疗急性DVT的初始治疗，推荐人用剂量为每日30mg，按人与动物体表面积等效剂量折算，大鼠的给药剂量为3.125mg/（kg·d）。
大鼠灌胃给予水蛭配方颗粒、水蛭标准汤剂、利伐沙班溶液，给药体积均为10ml/（kg·d），给药2次。大鼠术后1小时和24小时给予药物。各组具体给药剂量和给药途径见表6-1-4。
表6-1-4 实验动物分组及给药
同“一、水蛭配方颗粒对正常大鼠血栓弹力图（TEG）的影响”中“溶液配制”。
各组大鼠禁食12小时。腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，注射体积为3.0ml/kg。将动物绑置固定板上并于板左上角贴上标签纸，记录前期给药时间；大鼠腹腔剃毛、擦碘伏。沿大鼠正中线开腹，寻找左肾静脉下方与下腔静脉交界处为结扎点。使用玻璃分针分离下腔静脉与腹主动脉，5-0爱惜康线穿过结扎点，另取针灸针（0.35×50mm）并排于下腔静脉，用5-0号线同时结扎下腔静脉和针灸针，结扎好后抽出针灸针，完成造模并记录造模时间，并在腹腔中注射少量生理盐水以补充术后缺水。使用缝合线逐层关腹，每层缝合完后于伤口处撒头孢曲松钠粉末。
末次给药1小时后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3.0ml/kg）进行麻醉。
（1）血液采集
1）腹主动脉采血，取3ml血液到普通管（不含抗凝剂，不含促凝剂）中，4℃冰箱静置。以3 000rpm、25℃离心10 分钟，分离得到上清（即血清），于-80℃冷冻保存。
2）TEG检测：继续取2ml血液于1个3.2%枸橼酸钠抗凝管中（枸橼酸钠∶全血=1∶9），上下翻转5次，室温静置至少15分钟后送至广东省中医药科学院进行TEG检测，检测需在8小时内完成。
3）体外凝血时间：将静脉采血针剪断，毛细管一端对准采血管，收集2管血液用于检测凝血时间。从血液充满毛细管开始计时，将毛细管置于玻璃皿上，30 秒后开始折断毛细管的一端（接血的另一端开始折），50秒后每隔10秒折一次，当折断处出现血丝时，折另一端进行验证。两端均出现血丝的时间记为凝血时间。
（2）组织采集：
正常组、假手术组剪取空血管，其余组别剪取成栓血管段，于吸水纸上吸干残留血液，称重并测量长度，拍照。
所有数据以均数±标准差（
±
s
）表示，并使用Graphpad Prism 5软件制图以及统计学分析。分析各组间的统计学差异采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）中的Dunnett多重比较试验。
P
≤0.05为显著差异，
P
≤0.01为极显著差异。
下腔静脉狭窄法能够诱导血栓形成。与模型组相比，利伐沙班作为阳性药可抑制血栓的形成，疗效显著（ P ≤0.01）。水蛭配方颗粒可剂量依赖性抑制下腔静脉血栓的形成，中剂量组和高剂量组血栓栓重分别降低40.2%（ P ≤0.05）和49.9%（ P ≤0.01）。结果见表6-1-5。
表6-1-5 水蛭配方颗粒和标准汤剂对DVT大鼠血栓栓重的影响（
±
s
，
n
=10）
注：与假手术组相比， * P ≤0.05， ** P ≤0.01；与模型组相比， # P ≤0.05， ## P ≤0.01。
与模型组相比，阳性药利伐沙班组可显著延长DVT大鼠的凝血时间（ P ≤0.01），但是配方颗粒组对DVT大鼠的凝血时间无影响。结果见表6-1-6。
表6-1-6 水蛭配方颗粒对DVT大鼠凝血时间的影响（
±
s
，
n
=10）
注：与模型组相比， ## P ≤0.01。
水蛭配方颗粒和标准汤剂以及利伐沙班对DVT大鼠的R值、K值、Angle角、MA值、LY30和CI值均无影响。结果见表6-1-7。
表6-1-7 水蛭配方颗粒和标准汤剂对DVT大鼠TEG的影响（
±
s
，
n
=10）
本实验采用下腔静脉狭窄诱导DVT的大鼠模型用以评价水蛭配方颗粒的疗效。通过对血栓栓重、凝血时间、TEG这三种指标的检测，结果显示水蛭配方颗粒对血栓形成的抑制率为18.3%、2.7%、29.7%，结果表明水蛭配方颗粒可显著抑制大鼠DVT。但是对DVT大鼠的凝血时间和TEG检测数值均无影响，这一结果显示水蛭可能是通过恢复静脉内皮损伤发挥作用，对于体循环的凝血功能没有影响。
药材及饮片的测定方法： 取样品粉末（过三号筛）约1.0g，精密称定，精密加入0.9 %氯化钠溶液5.0ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100μl，置试管（8mm ×38mm）中，加入含0.5 %（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（临用配制）200μl，摇匀，置水浴中（37℃±0.5℃）温浸5分钟，滴加每1ml中含10单位的凝血酶溶液（每4分钟滴加1次，每次2μl，边滴加边轻轻摇匀）至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积。
标准汤剂的测定方法： 取水蛭（蚂蟥）标准汤剂冻干粉研细，取约0.1g，精密称定，精密加入0.9 %氯化钠溶液1ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100μl，置试管（8mm ×38mm）中，其他步骤同“药材及饮片的测定方法”项。
配方颗粒的测定方法： 取水蛭（蚂蟥）配方颗粒研细，取约0.1g，精密称定，其他步骤同“标准汤剂的测定方法”项。
计算公式：U=C 1 V 1 /C 2 V 2
U：每1g含凝血酶活性单位，U/g；
C 1 ：凝血酶溶液的浓度，μ/ml；
C 2 ：供试品溶液溶液的浓度，g/ml；
V 1 ：消耗凝血酶溶液的体积，μl；
V 2 ：供试品溶液的加入量，μl；
中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。
取不同产地的16批水蛭（蚂蟥）药材以及对应的饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒按照“水蛭抗凝血酶活性的测定”“（一）测定方法”项下测定方法进行测定，按“水蛭抗凝血酶活性的测定”“（二）计算方法”项下计算方法计算样品的抗凝血酶活性，结果见表6-1-8、图6-1-1。
表6-1-8 水蛭（蚂蟥）抗凝血活性测定
图6-1-1 水蛭（蚂蟥）抗凝血活性测定
实验结果表明，16批水蛭（蚂蟥）药材的活性范围在4～26U/g，均值为11.0U/g，SD值为5.2U/g；16批水蛭（蚂蟥）饮片的活性范围在4～14U/g，均值为10.4U/g，SD值为2.6U/g。16批水蛭（蚂蟥）药材及其对应饮片抗凝血活性均符合《中国药典》2020年版“水蛭”项下含量测定限度要求。
16批水蛭（蚂蟥）标准汤剂的活性范围在16～33U/g，均值为24.1U/g，SD值为5.6U/g，3批水蛭（蚂蟥）配方颗粒的活性范围在9.6～9.9U/g，均值为9.8U/g，SD值为0.2U/g。上述数据表明，水蛭（蚂蟥）经提取后，仍然保持一定的抗凝血活性。