第五节
孔雀石绿测定

孔雀石绿（malachite green）又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属有毒的三苯甲烷类化学物，自1933年发现其对水产动物具有较好的药用作用后，主要用于防治水产养殖中的水霉病和控制生物原虫的数量，是药用染料中抗菌效力较强的一类。孔雀石绿具有高毒素的副作用，能引起水生动物急性锌中毒，进入人体或动物机体后，可通过生物转化，还原代谢成脂溶性的无色孔雀石绿，具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变作用，严重威胁人类身体健康。鉴于孔雀石绿的危害性，许多国家都将其列为水产养殖禁用药物，2002年，孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止用于所有食用动物。

一、薄层色谱鉴别

为保证用药安全，本文参考原国家食品药品监督管理局稽查局下发的《中药材及中药饮片药品检验补充检验方法和检验项目批准件》增加检测项青黛的孔雀石绿鉴别方法项下供试品制备方法和薄层条件，采用薄层色谱仪对龟甲、醋龟甲、鳖甲、醋鳖甲、水蛭5种水产品进行孔雀石绿测定。

（一）供试品溶液制备

取本品0.5g，加3%甲酸甲醇溶液10ml，超声处理20分钟，滤过，滤液作为供试品溶液。另取孔雀石绿对照试剂，加甲醇制成每1ml中含有0.1mg的溶液，作为对照试剂溶液。吸取上述供试品溶液和对照试剂溶液各10～20μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷（5∶5）为展开剂，置氨蒸气饱和的层析缸内，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照试剂色谱相应的位置上，不得显相同的蓝色斑点。若供试品色谱中出现与对照试剂相同颜色的斑点，则采用高效液相色谱法验证，必要时可采用高效液相色谱-质谱的方法做进一步验证。

（二）样品测定

对龟甲、醋龟甲、鳖甲、醋鳖甲、水蛭药材和饮片进行薄层色谱鉴别，结果显示：5种动物药薄层色谱鉴别供试品色谱中，在与对照试剂色谱相应的位置上，所有批次的药材和饮片均未显相同的蓝色斑点。本次孔雀石绿薄层色谱鉴别检验122批，未检出122批，未检出率100%。测定结果详见表5-5-1。

二、质谱鉴别

参考河北省地方标准《养殖水体中孔雀石绿残留量的测定液相色谱-串联质谱法》的质谱条件，采用液相色谱-串联质谱法对龟甲、醋龟甲、鳖甲、醋鳖甲、水蛭5种水产品进行孔雀石绿定性鉴别。

（一）色谱和质谱条件

色谱条件：选择Thermo Accucore C ₁₈ （2.1mm×100mm，2.6μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸为流动相B，按表5-5-2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.4ml；柱温为 35℃；进样量为 5μl。

质谱条件：电喷雾正离子模式（ESI ⁺ ），毛细管电压为1.50kV；离子源温度500℃；去溶剂气流速为900L/h；进行MRM模式扫描；监测离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表5-5-3。

（二）对照品溶液制备

取孔雀石绿对照品适量，精密称定，加乙腈溶液制成每1ml含孔雀石绿1.024μg的溶液，作为对照品母液。

取上述对照品母液1ml至10ml量瓶中，加乙腈溶液定容制成每1ml含孔雀石绿0.102μg的溶液，作为对照品参照物溶液。

（三）供试品溶液制备

参照薄层色谱鉴别项下的供试品溶液方法，取本品0.5g，加乙腈溶液10ml，称定重量，超声处理20分钟，放冷，用乙腈补足减失重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

（四）方法学考察

1.专属性考察

精密吸取龟甲、醋龟甲、鳖甲、醋鳖甲、水蛭溶液、加标溶液、空白溶剂和对照品溶液各5μl，注入液质联用仪，按照拟定色谱与质谱条件测定。

结果显示：空白溶剂供试品溶液图谱在与对照品色谱相应的保留时间处未检出特征离子峰，表明空白溶剂对方法中特征离子对的检出无干扰，方法具有专属性。各样品专属性质谱图见图5-5-1～图5-5-3。

2.检测限

通过对一系列已知浓度的标准溶液进行分析，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

稀释对照品溶液至约3倍信噪比的浓度，S/N=2.518，检测最低量为：0.000 5ng。孔雀石绿的检测限为：0.000 5ng。

3.定量限

通过对一系列已知浓度的标准溶液进行分析，试验出能被定量测定的最低浓度或量。

稀释对照品溶液至约10倍信噪比的浓度，S/N=11.210，检测最低量为：0.010 2ng。结果表明，孔雀石绿的定量限为：0.010 2ng。

（五）样品测定

按龟甲、醋龟甲、鳖甲、醋鳖甲、水蛭药材和饮片的质谱鉴别方法，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液质联用仪，测定，即得。

结果显示：5种动物药以质荷比（m/z）329→208，（m/z）329→313离子对提取的供试品离子流色谱中，所有批次的药材和饮片均未呈现与对照品色谱保留时间一致的色谱峰。本次孔雀石绿质谱鉴别检验122批，未检出122批，未检出率100%。测定结果详见表5-5-4。