第一节
聚合酶链式反应技术研究概述

一、聚合酶链式反应法技术简介

聚合酶链式反应是一种基于微量核酸进行体外序列扩增的技术。它与分子克隆和DNA序列分析是现代分子生物学技术的实验基础。其中，PCR方法在理论上出现最早，也是目前在实践中应用得最广泛的，且极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。PCR技术是由美国科学家 Kary mullis在1983年设想出的，后经过2年的努力，在实验上经证实了其关于PCR的构想，并于1985年申请了有关PCR的第一个专利，并在 Science 杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，从此PCR技术得到了生命科学界的普遍认同。

目前在聚合酶链式反应技术在动物药应用中，以位点特异性PCR技术和荧光定量PCR技术应用较为广泛。位点特异性PCR技术是基于DNA序列分析和PCR扩增的一种鉴定方法，通过比较待鉴定种及其混伪品的某段DNA序列，找到特异的变异性位点，并根据该变异位点设计特异性的扩增引物，通过设置退火温度差异，达到正确物种具扩增条带，而其他物种不能扩增的目的。位点特异性PCR技术由于其操作简单、快速的特点，其在中药鉴定方面应用广泛。最早，有研究采用位点特异性PCR技术对蛇、鹿类中药材进行了鉴定。此外，该方法还已广泛应用于龟甲、鹿茸、蜈蚣、蛤蚧、鸡内金等动物药及饮片。

实时定量 PCR 技术又称为实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantita- tive PCR，q-PCR）技术是指以荧光基团加入PCR反应体系中，通过对PCR的整个反应进程利用荧光信号积累进行实时监测，最后通过标准曲线定量分析所测未知样品模板的浓度的方法。该技术是在普通定性技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术。美国Applied Bio systems公司在1996年首先推出成熟的实时荧光定量技术，因其操作简便、快速高效，而得到快速广泛的应用。目前qPCR技术广泛使用于病毒检测、转基因成分检测及中药鉴定等领域。范瑞强等运用荧光定量PCR技术探讨中药抗病毒胶囊治疗生殖器疱疹的研究，检测豚鼠生殖道单纯疱疹病毒（HSV-2DNA）的含量，能有效测定脊髓神经节单纯疱疹病毒HSV的含量。杨爱文等通过基因芯片和实时荧光定量PCR技术平台，从基因表达水平阐释蟾酥组方成麝香保心丸的配伍机制。Yajun Wu等运用SYBR Green I实时荧光PCR技术快速检测燕窝的真伪，对于制品中的燕窝成分检测灵敏较高。

二、聚合酶链式反应法技术原理及技术流程

（一）技术原理

AS-PCR技术的理论基础是引物3'末端的末位碱基在很大程度上影响着TaqDNA聚合酶的延伸效率。研究资料表明，引物3'末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异，如当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链的合成，当末位碱基为T时，错配时引发效率大大降低，而G、C居于中间。因此引物的正反向主要由3'末端的末位碱基决定。同时为保证方法的特异性扩增效率，一般在下游引物3'末端第三个碱基进行人为错配。并对扩增后的产物测序以验证方法的准确性。

（二）技术操作流程

AS-PCR技术一般包括4个基本步骤。第一步，根据基因名称查询序列，设计引物；第二步，提取基因组DNA；第三步，进行PCR扩增；第四步，产物凝胶电泳。其流程图如图4-1-1。

三、聚合酶链式反应法技术应用举例

本节以鳖甲为研究材料，针对鳖甲配方颗粒的特异性PCR鉴别进行研究，其具体研究内容如下：

（一）仪器与试剂

一般仪器包括电子天平、离心机、冰箱、恒温仪、紫外分光光度仪、可对温度进行连续控制并实现核酸指数级扩增的PCR仪、具有稳压直流电源和平板电泳槽电泳仪、紫外凝胶成像仪（或紫外透射仪）等。一般试剂包括所涉及的试剂组成或试剂盒等。

（二）模板DNA制备方法依据

常用的药品DNA提取方法包括十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、十二烷基硫酸钠（SDS）法、DNA碱裂解法及试剂盒法等。具体方法参照各自提取步骤，原则上模板DNA质量浓度宜不低于100ng/μl，OD260/OD280宜在1.8～2.0，进行不同提取方法考察时，其判断依据一般包括提取DNA浓度、OD260/OD280、OD260/OD230等。

（三）引物选择的依据

一般引物设计以Genbank等公共核酸数据库为来源，通过Bioedit、MEGA等软件进行Clustal W多重比对。经序列对比发现（图4-1-2），在289位鳖甲位点为C而其他为A或T，确定该SNP位点后，使SNP位点接近正向引物3'端，借助Primer Premier 5软件，调节反向引物位置，通过最终引物评分以确定最佳组合，设计鉴别引物（10μmol/L）上游：5'-CTACCCCCCTCATTACTACTTCTC-3'和下游：5'-ACGGGAGTTTGGTATTGTGA-3'。经特异性PCR扩增后，扩增产物长度为236bp。

（四）PCR反应条件考察

一般来说，PCR反应体系应由脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs，如dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 2.5mmol/L）、引物溶液（10～30μmol/L）、耐热Taq DNA聚合酶（具有5'-3'聚合酶活性）1～2.5U及其缓冲液（含镁离子）、模板和无菌水组成，总体积为25或30μl。具体体系参照各引物说明书。

PCR的反应条件，预变性时间一般为94℃保温3～5分钟，对于鸟嘌呤和胞嘧啶所占比例较高的品种，可适当延长预变性时间至10分钟或升高预变性温度至 98℃。PCR循环可以为3步或2步PCR循环，反应循环次数一般在30～40次，退火温度一般在45～65℃。当PCR反应产物长度小于500bp时，退火延伸时间一般在20～45秒。终延伸温度一般为72℃或68℃，可根据使用的 Taq DNA 聚合酶特性决定。特异性PCR对反应条件要求严格，其退火温度、酶量、引物量、循环数、模板浓度、Taq 酶种类均可影响鉴别结果。因此一般通过单因素考察退火温度、Taq 酶种类、酶量、循环数、引物量及不同PCR仪等条件对实验结果的影响。

（五）方法适用性考察

此项包括检出限及专属性考察。

考察鳖甲特异性PCR法的灵敏度。选择鳖甲药材及配方颗粒各1批，分别稀释10、100、1 000倍，并测定DNA模板浓度。按鳖甲特异性PCR体系和扩增条件进行扩增。确定最低检出限。

考察鳖甲特异性PCR法的灵敏度。选择鳖甲阳性对照、鳖甲配方颗粒及阴性样品，按鳖甲特异性PCR体系和扩增条件进行扩增。确定该方法的准确鉴定率、真阳性率、真阴性率、假阳性率及假阴性率。

结果如图4-1-3。

M.DNA maker DL 500，1.鳖甲对照药材，2～16.鳖甲饮片，17～23.鳖甲标准汤剂，24～26.鳖甲配方颗粒，27～28.龟甲药材，29～30.角鳖药材，31～32.佛罗里达鳖药材，33.山瑞鳖药材，34.空白（ddH ₂ O）

结果对于鳖甲配方颗粒的鉴定率为100%，真阳性率为100%，真阴性率为100%，假阳性率为0%，假阴性率为0%，表明该方法能用于鳖甲配方颗粒的特异性鉴别。 0dIlzdiK9QQbDC0vPP/vwQGqEcbCUI9NIoDsjY+sdZinIjgfeoB+TZQT1gz/RCg7