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本研究通过对动物药中小分子化合物的提取与分离鉴定，丰富动物药专属性成分，建立标准汤剂及配方颗粒的特征性成分（专属性成分）鉴别、含量测定及特征图谱方法，以更好地控制动物药药材、饮片及配方颗粒质量，为解决动物药掺伪问题提供支持（图3-2-1）。
图3-2-1 化合物分离鉴定一般流程图
根据现有文献及现有数据，包括但不限于液相色谱、质谱等，判断所需分离鉴定的化合物或化合物类型，了解该类型化合物的理化性质，以确定该类化合物提取分离方法。
动物药有效小分子成分的提取方式与植物药有效成分的提取方式极为相似，主要有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法及升华法，后两种的应用较有局限性，大多数情况下是采用溶剂提取法。
动物药中的小分子成分主要为氨基酸、生物碱（蛤蚧及全蝎中的肉毒碱；河豚卵巢中的河豚毒素；动物胆汁中的胆红素；蟾蜍色胺；地龙中的次黄嘌呤）、多糖类（动物组织中的肝素；甲壳动物和昆虫体壁外的甲壳素；棘皮动物中的黏多糖和深海软骨鱼骨骼中的杂多糖；软体动物中的葡聚糖）、甾体类（性激素或性信息素如紫河车中的黄体酮；动物胆汁中的胆汁酸；蟾蜍中的甾体；棘皮动物的海参纲和海星纲含有的皂苷）、萜类（斑蝥中的斑蝥素；鲨鱼肝油中的鲨烯；海绵属动物中含有的环烯醚萜类成分）、酚酮酸类（海绵中siphonodictyal-A、siphonodictyal-B；麝香中的麝香酮；地龙中的花生四烯酸等）等。以上类型化合物大多均可使用溶剂提取法进行小分子化合物的提取。
溶剂提取法是根据相似相溶以及扩散作用的原理进行提取，要求药材粉碎并且需要防霉。选择溶剂提取法，需要溶剂对有效成分溶解度大而对杂质溶解度小，不能与中药的成分起化学变化，且经济、易得、使用安全等。常用的提取溶剂有水、亲水性有机溶剂、亲脂性溶剂。水是强极性溶剂，中药中亲水性成分如动物药中的糖类、分子不太大的多糖类、氨基酸、有机酸盐、生物碱盐及苷类等都能被水溶出。加入酸或碱可以增加某些成分的溶解度，如常见的生物碱提取方法为酸提碱沉，如河豚毒素（TTX），TTX粗品的提取方法基本是先用水浸泡、酸提取、盐沉淀除杂质，再用氨水沉淀。胆红素不溶于水，但溶于苯、氯仿、氯苯、二硫化碳等有机溶剂，且分子中有两个丙酸基侧链，呈弱酸性，能与碱土金属离子如Ca 2+ 生成不溶性盐，不溶性盐与强酸如盐酸反应，可置换出胆红素。加碱则可以使有机酸、黄酮及酚类成分溶出。常用的亲脂性溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等，其中乙醇最为常用，亲水性的成分除蛋白质、黏液质、部分多糖外均能在乙醇中溶解。亲脂溶剂较多，有石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、苯等，这些溶剂的选择性较强，不能或较难提取亲水性杂质。如张普照等采用有机溶剂甲醇提取的方法，制备液相色谱分离纯化从林麝麝香中分离得到胆固醇、雄甾-4-烯-3，17-二酮等化合物。
提取方法常用有浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法、超临界CO 2 流体萃取技术、超声波提取技术、微波提取法等。煎煮法不适用于含挥发性成分或有效成分遇热不稳定的药材；应用挥发性有机溶剂提取中药有效成分，以连续提取法为好，且需要的溶剂量较少，提取成分也较为完全，如麝香中的麝香酮，多用乙醚置于Soxhlet提取器回流提取。超声提取相比传统的提取方法有很多优势和特点，如提取时间短、节约溶剂、提取率高等，在动物药有效成分的提取中逐渐被更多的研究者所接受和利用，并取得了良好的效果。张国平等采用超声辅助提取蟾皮中蟾蜍噻咛活性成分，与传统水加热回流提取法相比，缩短了提取时间，降低了成本，并得到较高的蟾蜍噻咛提取率。
分离纯化是有机化合物分析必不可少的过程，不同的有机化合物样品有不同的纯化方法，需根据样品中有机化合物的性质和杂质的性质差别来选择分离纯化的方法。
动物药的纯化分离方式与植物药的分离纯化方式基本一致，常用的分离和纯化方法可以根据分离原理概括为：根据溶解度差别（结晶与重结晶）、物质在两相溶剂中的分配比不同［液-液萃取法、纸色谱、液滴逆流色谱法（DCCC）、高速逆流色谱（HSCCC）、气液分配色谱（GC/GLC）、液-液分配色谱（LC/LLC）等］、物质的吸附性差别（硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行的吸附色谱，硅胶、氧化铝均为极性吸附剂，活性炭则是非极性吸附剂）、物质分子的大小（透析法、凝胶过滤法、超滤法、超速离心法）、物质解离程度（离子交换或电泳技术）不同进行分离。接下来就最常用的几种提取分离方法进行简单的阐述：
利用同组溶剂中各物质分配系数不同或同种物质在不同溶剂组中分配系数不同而分开，可选择合适的溶剂，反复进行分配。萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。如果在水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取；如果有效成分是偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。还可以在氯仿、乙醚中加入适量乙醇或甲醇以增大其亲水性。提取黄酮类成分时，多用乙酸乙酯和水的两相萃取。一般有机溶剂亲水性越大，与水做两相萃取的效果就越不好，因为能使较多的亲水性杂质伴随而出，对有效成分进一步精制影响很大。
柱层析技术（chromatography）又称柱色谱技术，主要原理是根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离开来。柱层析分为吸附色谱、分配色谱和凝胶色谱。
吸附色谱中吸附剂种类有氧化铝、硅胶、硅藻土、纤维素、氧化镁、碳酸钙、活性炭等。硅胶、氧化铝均为极性吸附剂，活性炭则是非极性吸附剂；化学吸附具有选择性、吸附十分牢固、有时不可逆的特点，如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝吸附、生物碱被酸性氧化铝吸附。为避免发生化学吸附，酸性物质宜用硅胶、碱性物质宜用氧化铝进行分离；半化学吸附如聚酰胺对黄酮类、醌类等化合物之间的氢键吸附，特别适用于分离醌类、酚类、黄酮类化合物；大孔吸附树脂吸附性能取决于吸附剂的表面性质，如比表面积、表面电性、能否与化合物形成氢键等，常用大孔吸附树脂将中药的化学成分和糖分离，同时，大孔树脂本身就是一种分子筛，可按分子量大小将物质分离。
分配色谱分为正相色谱和反相色谱，通常分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物时，采用正相色谱进行分离；当分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等时，采用反相分配色谱进行分离。
凝胶色谱的原理为分子筛效应，即凝胶具有区分分子大小不同的物质的能力。当含有大小分子的混合物样品进入到层析柱中后，这些物质随洗脱液的流动而向前移动，小分子可在筛孔中自由的扩散、渗透，而大分子则被排阻于颗粒之外，由此相对分子质量大小不同的物质因受阻滞程度不同而分离。赵玉红等采用DEAE-52离子交换层析和Sepharose20CL-6B凝胶排阻层析对鹿茸粗多糖进行分离纯化，糖分离效果较好，可以分离纯化得到一种单一多糖。杨毅等采用乙醇提取和硅胶柱色谱、Sephadex20LH-20柱色谱等手段对短雌海马样品进行分离纯化得到了9个化合物。
薄层色谱与柱色谱相似，也是一种应用非常广泛的分离分析手段，具有分离提纯简单、快速的特点，对于小数量样品有良好的分离效果，但分离容量不及柱色谱大，无法同时处理大量样品，效果也不及柱色谱好，塔板数有限。对于化合物成分少、分离度较好的混合物可尝试使用制备薄层色谱进行分离纯化。
是指采用色谱技术制备纯物质，即分离、收集一种或多种色谱纯物质。制备色谱中的“制备”这一概念指获得足够量的单一化合物，以满足研究和其他用途。随着科学技术的不断发展，高效液相色谱制备化合物的使用逐渐普遍，采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器，从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准确。制备型高效液相色谱可利用相同填料的分析柱，选择最适合于分离目的和要求的流动相组成，将其直接或略加修改后用于制备分离，一般不采用梯度洗脱，制备型高效液相色谱制备迅速、制备量大、自动化程度高，现大多数化合物单体的分离纯化均采用该方法结合其他方法共同完成。如曾瑶波等运用小孔树脂（MCI）、硅胶、高效液相反相制备色谱等技术手段从斑蝥的95%乙醇提取物中分离得到10个化合物；TTX的纯化工艺主要采用氧化铝柱色谱、活性炭柱色谱、大孔树脂、离子交换树脂或高效液相色谱等方法。
长期以来，研究工作者已经发展了一整套应用于化合物的结构鉴定分析技术，其中，质谱和核磁共振是最重要的结构解析技术，此外，还有各种光谱技术的应用，图3-2-2为一般结构研究的程序流程图。
图3-2-2 结构研究程序图
TLC：薄层色谱；LC：液相色谱；GC：气相色谱；HR-MS：高分辨质谱；UV：紫外光谱；IR：红外光谱；MS：质谱；1H-NMR：核磁共振氢谱；13C-NMR：核磁共振碳谱；CD：圆二色光谱；ORD：旋光光谱；NOE：核效应；2D-NMR：二维核磁共振谱。
质谱在药物领域的主要应用为药物的定性鉴别、定量分析和结构解析。
用质谱法鉴定已知有机化合物结构时，应首先与标准图谱进行对照，常用的图集有：Registry of Mass Spectral Data，Eight Peak Index of Mass Spectral以及质谱仪配有的高效计算机程序库搜索系统。
若化合物为未知化合物，可使用高分辨率质谱得到离子的精确质量数，然后计算出该化合物的分子式，或者用参照物做峰匹配可以确定分子量和分子式。分子离子的化学键发生断裂后形成碎片离子，由此丰富的碎片离子峰可推断其裂解方式，得到相应的结构信息，但质谱对于互为异构体的化合物较难鉴别。
核磁共振是磁矩不为零的原子核，在外磁场作用下自旋能级发生塞曼分裂，共振吸收某一定频率的射频辐射的物理过程。核磁共振波谱是天然有机化合物结构解析中最重要的手段之一，目前作为最常用的技术手段在结构鉴定包括手性确定中发挥着重要的作用，主要包括一维谱（氢谱、碳谱等）、二维谱（HSQC、HMBC、COSY、NOESY等），从一维谱和二维谱中获得丰富的化合物结构信息，同时结合高分辨质谱、红外光谱、紫外光谱、旋光、圆二色谱等确定化合物结构。
红外光谱是分子能选择性吸收某些波长的红外线，而引起分子中振动能级和转动能级的跃迁，不同的化学键或官能团吸收频率不同，在红外光谱上将处于不同位置，从而可获得分子中含有何种化学键或官能团的信息。
紫外吸收光谱是由于分子价电子的跃迁而产生的。获得吸收光谱图，可推断分子中的骨架信息，但不能完全确定物质的分子结构，需结合其他谱图信息。适用于分析分子中具有不饱和结构的化合物。
X射线单晶衍射是利用单晶体对X射线的衍射效应来测定晶体结构的实验方法。在材料学、化学、矿物学及晶体学中有着极其重要的作用，它是研究一切结晶物质结构和物相的主要手段。单晶结构分析是有机合成、不对称化学反应、配合物研究、新药合成、天然提取物分子结构、矿物结构以及各种新材料结构与性能关系研究中不可缺少的最直接、最有效、最权威的方法之一。可用于中小分子直至大分子晶体的分子结构分析、绝对构型测定及精密电子密度测定，对孪晶、微小晶体有优良的适应性。