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取鸡、鸽、鹅和鸭的内金部位样品，以及鸡骨、鸡皮、鸡肉样品，分别加入溶剂，回流提取蛋白质。样品用0.22µm滤膜过滤后，取续滤液，加入胰蛋白酶溶液，酶解12小时（图2-6-1）。
采用梯度变换速率较缓的洗脱方法对样品溶液进行检测。带多电荷的肽段在C18色谱柱上保留较弱，大部分有效信息在有机相升至30%时已全部洗脱，因此，在初期的筛选中会采用一个时间较长、梯度上升较缓的方法（时长1小时，有机相比例从3%上升到30%）。在质谱分析方面，采用Full MS+dd MS 2 的模式，同时采集一级质谱以及二级质谱信息（图2-6-2、图2-6-3）。
图2-6-1 样品制备过程
图2-6-2 总离子流图（TIC图）
图2-6-3 一级质谱图（MS图）和二级质谱图（MS/MS图）
将图中所得质谱信息导入Proteome Discoverer软件（简称PD软件），进行序列匹配。匹配完成后，可以得到的信息是：样品中有可能存在的肽段序列（图2-6-4）、蛋白质归属（图2-6-5）、物种归属（图2-6-6），以及二级图谱的匹配程度（图2-6-8）等。
图2-6-4 PD软件匹配界面
图2-6-5 氨基酸序列信息
序列匹配完后，进行数据分析。筛选出鸡内金有，而其他内金和其他鸡部位没有的氨基酸序列（如IDEASIPELQEIGR，m/z 785.41，RT（保留时间）43分钟），进行查看。如图2-6-6，在总离子流图（TIC图）中输入所选中氨基酸序列的母离子m/z 785.41进行提取，可见，在RT 43分钟，仅鸡内金有响应，在鸭内金、鹅内金、鸽内金、鸡骨、鸡皮、鸡肉中均无响应。初步判定此多肽序列为鸡内金的特征多肽。
在动物类配方颗粒特征多肽研究中，特征多肽的合成采用的是Fmoc多肽固相合成法，以下为鸡内金的一段特征多肽的合成流程，简述Fmoc多肽固相合成法的步骤流程（图2-6-7）。
肽段序列：IDEASIPELQEIGR
试验条件：室温
合成方向：C端→N端合成
图2-6-6 母离子m/z 785.41提取离子流图
先将树脂进行“步骤 1”的操作：20% Piperidine（remove the N-terminal Fmoc group with piperidine）反应20分钟，用检测试剂检测验色为蓝色。再进行“步骤2”的操作：HBTU+DIEA加Fmoc-Gly-OH反应1小时，用检测试剂检测验色为无色；再重复“步骤1”的操作：20% Piperidine（remove the N-terminal Fmoc group with piperidine）反应 20 分钟，用检测试剂检测验色为蓝色。重复“步骤2”的操作：HBTU+DIEA加Fmoc-Ile-OH反应1小时，用检测试剂检测验色为无色；继续重复“步骤1”的操作，如此类推直到最后一个氨基酸Ile脱Fmoc后，将树脂抽干切割得到粗品肽。将粗品肽用HPLC纯化，使用三氟乙酸盐体系纯化，后脱盐冻干。冻干后得到产品。
图2-6-7 Fmoc多肽固相合成法的步骤流程（鸡内金）
合成后将对照品和样品进行质谱检测。查看其保留时间、一级质谱图和二级质谱图是否能一一对应。如图2-6-8，样品在保留时间、一级质谱图、二级质谱图与对照品一致，确定所合成肽段（序列：IDEASIPELQEIGR）为鸡内金的特征多肽。
（1）样品处理：
取转移至PVDF膜的供试品，用0.1% TFA溶液清洗3次，待自然晾干后将PVDF膜剪切后上样。
图2-6-8 对照品与样品验证图
（从上到下分别为提取离子流图、一级质谱图、二级质谱图）
（2）测试样品：
将剪切好的PVDF膜供试品放置到反应器中，组装好反应器后将其放置于仪器固定位置，通过软件PPSQ Analysis/Labsolutions设置：样品名称、样品号、测试循环数、选择方法文件，设置完成后开始测试。
（3）数据及图谱处理：
PPSQ产生的原始数据及图谱由PPSQ DataProcessi-ng（Labsolutions）软件识别标峰并导出对应图谱。
对19种PTH-氨基酸进行校准，故先测试19种PTH氨基酸的混合标准品，校准测试混合标准品图谱（图2-6-9）。
图2-6-9 标准品校准测试图谱
PTH氨基酸混合标准品校准测试完成后，测试供试品的N-端序列，进行14个循环测试，供试品测试图谱见图2-6-10。
图2-6-10 供试品N-端序列测试图谱
综上所述，供试品肽段J-2（批号：P200921-LR792903）的N端序列为：NH2-Ile-Asp-Glu-Ala-Ser-Ile-Pro-Glu-Leu-Gln-Glu-Ile-Gly-Arg（IDEASIPELQEIGR）。