第一节
质谱分析与蛋白质组学

蛋白质谱分析技术是一种通过测量蛋白肽段离子质荷比（质量-电荷比）来鉴定蛋白序列的分析方法。首先，使用胰酶等蛋白酶将蛋白质进行酶解，形成不同的肽段。质谱仪的离子源将肽段混合物进行电离化，形成具有不同质荷比的带电离子并根据质荷比对肽段进行分离。随后质谱仪的离子选择装置会对肽段离子进行二级质谱分析，通过比对蛋白质酶解后的理论质谱图对蛋白质进行鉴定。一个蛋白的鉴定通常情况下需要同时鉴定到两个特有肽段。蛋白鉴定的数量与质谱仪的分辨率有密切的关系，通常情况下一次质谱检测能检测到2 000～5 000个蛋白，高分辨率质谱仪则能检测到一万个左右的蛋白。

一、定性蛋白质组学分析技术

由于蛋白质谱技术具有通量高、成本低的特点，现已被广泛应用于蛋白表达、细胞组分的鉴定和分析。在细胞组分的分离鉴定方面，蛋白质谱技术与密度梯度离心、生物素邻近标记联合使用是比较常见的两种蛋白鉴定方法。密度梯度离心主要根据不同细胞组分、细胞器之间的密度和比重不同，通过超速离心对细胞组分和细胞器进行分离，最后通过质谱分析方法对分离到的细胞组分和细胞器进行蛋白鉴定。该方法具有蛋白分离鉴定比较全面的优点，但需要较高的理论基础和操作技术。生物素邻近标记的原理是在已知蛋白上融合一个具有生物素标记功能的酶（例如生物素连接酶或过氧化物酶），通过这些酶介导与融合蛋白相邻或互作的蛋白质发生生物素共价修饰，最后通过生物素亲和纯化和质谱技术鉴定相邻的组分或蛋白。

基于密度梯度离心的空间蛋白质组学技术以及生物素邻近标记蛋白质组学技术是最近几年开发的新技术，可以有效地对细胞组分和互作蛋白进行分离、鉴定。其中，以HyperLOPIT空间蛋白组技术（Mulvey等，2017）、BioID和APEX邻近蛋白标记技术为代表（Samavarchi-Tehrani等，2020）。HyperLOPIT是一种结合超速离心的蛋白质谱技术，能对细胞器蛋白组分进行高效、高通量的鉴定。HyperLOPIT的基本技术原理如下：首先，对细胞进行裂解，通过超速离心对不同的细胞器组分进行分离；然后，利用不同的细胞器标记蛋白鉴定超速离心分离的组分属于什么细胞器；最后，通过质谱技术和机器学习算法对细胞器蛋白进行深入的分析和鉴定。虽然空间蛋白质组学技术能高通量地鉴定细胞器的组分，但其也存在一些缺点。例如，操作技术水平的要求比较高，无法解析蛋白之间的相互作用关系，某些与细胞器短暂互作、但不定位于细胞器的蛋白也可能会被一起鉴定到，故具有一定的假阳性率。生物素邻近标记蛋白质组学技术也同样存在一些缺陷，如用生物素邻近标记进行蛋白组分鉴定也存在鉴定组分假阳性的结果。造成假阳性的原因可能是由于在蛋白翻译、翻译后修饰以及转运过程中生物素连接酶和过氧化物酶标记的蛋白可能会对核糖体蛋白、翻译后修饰蛋白酶、转运蛋白以及某些瞬时互作蛋白进行生物素标记，造成组分鉴定的错误。因此，通过生物素邻近标记鉴定到细胞器组分需要作进一步的分析和筛选。虽然这些技术均存在一定的缺陷，但密度梯度离心和生物素标记结合质谱鉴定的方法具有通量高、成本低的特点，通过多种生物信息学算法进行综合优化、分析，能有效降低假阳性比例。目前，高通量蛋白质组学技术已被广泛应用于弓形虫等生物的细胞器组分以及互作蛋白的鉴定。

虽然定性蛋白质组学技术能有效地对蛋白进行鉴定，但是随着研究的深入和技术的发展，蛋白定性质谱检测已逐渐不能满足科研的需求。基于质谱分析技术的定量蛋白质组学应运而生。定量蛋白质组学能高通量检测生物在不同环境、发育阶段下的蛋白差异表达数据。基于定量蛋白质组学的技术原理，定量蛋白质组学技术可分为标记定量蛋白质组学技术和无标记定量蛋白质组学技术。无标记定量蛋白质组学技术其技术优势在于无需对样品进行标记、成本较低、所需蛋白量少且无样品数量限制；但其缺点是检测的稳定性和重复性较差，对仪器的要求较高。标记定量蛋白质组学技术具有较好的稳定性和重复性，但需要的蛋白量较多、试剂也较为昂贵，对不同样品进行同批次分析时其分析数量受到标记试剂盒的限制。

二、定量蛋白质组学分析技术

标记定量蛋白质组学技术可分为体内标记和体外标记两种。目前，使用比较广泛的蛋白质组学定量技术主要是细胞内氨基酸稳定同位素标记（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）技术。其主要原理是，在细胞培养基中加入同位素标记的氨基酸，经过5～6次传代，细胞的所有蛋白即可标记上相应的同位素。然后等比例混合不同同位素标记的细胞或者蛋白进行质谱鉴定以及相对表达量计算。体外标记定量蛋白质组学技术主要包括同位素标记相对和绝对蛋白质定量（isobaric tagging for multiplexed relative and absolute protein quantitation，iTRAQ）和串联质谱标签（tandem mass tag，TMT）等。iTRAQ和TMT技术分别是由美国AB Sciex公司和ThermoFisher Scientific公司研发的体外多肽标记定量技术。它们的检测原理基本一致。iTRAQ和TMT的试剂标签均包含同位素报告基团、平衡基团和肽反应基团。在质谱分析中，同位素报告基团、平衡基团和肽反应基团之间的键会发生断裂，使带有不同同位素标签的同一肽段产生不同质量的报告离子，根据报告离子的丰度便可获得不同样本间相同肽段的相对定量信息。iTRAQ技术能同时对8个样品进行标记，ThermoFisher Scientific公司的TMTpro 16plex标记试剂则支持同时对16个样品进行标记。无论是体内标记定量蛋白质组学技术还是体外标记定量蛋白质组学技术，这些技术均已被广泛应用于弓形虫领域的研究。 qLBhCi1yYEYdXQDxfe9aJJlzptY/VnjYr2A02Ha1IHthxf1MHrW93HYmKDSTLhqD