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前已述及，世界范围内弓形虫株具有丰富的遗传多样性及其地域分布特征。其中，北美和欧洲流行的弓形虫以原型克隆谱系为主，而南美弓形虫株则表现为高度的遗传多样性。此外，南美弓形虫株（type 4-10单体型）对小鼠的急性毒力强于原型克隆谱系；同时，人类严重急性播散性弓形虫感染通常与这些基因型有关，显示弓形虫基因型和毒力密切相关（Weilhammer和Rasley，2011）。一般而言，弓形虫毒力的强弱取决于其对宿主细胞的侵袭力、胞内增殖速率以及能否在宿主体内成囊及对宿主的致病性和致死性等。弓形虫原型克隆谱系中，基因Ⅰ型虫株为强毒株，对小鼠的致死剂量为1，即小鼠感染1个速殖子即可致死，并产生重度虫血症，主要代表虫株为RH株和GT1株；基因Ⅱ型、Ⅲ型以及Chinese 1型的弱毒株（例如Wh6株）等为弱毒株，对小鼠的致死剂量大于或等于1 000个速殖子，易在宿主脑、骨骼肌、心肌等组织中形成包囊，代表虫株为PRU株、ME49株、Wh6株，以及VEG和CTG株。在细胞培养中，基因Ⅰ型虫株比基因Ⅱ型或Ⅲ型弓形虫增殖更快，并且从速殖子到缓殖子转化速度慢于基因Ⅱ型虫株。据报道，欧洲的人体感染弓形虫多为基因Ⅱ型虫株，从先天性弓形虫病患者病理组织中分离的虫株亦多为基因Ⅱ型虫株，其次为基因Ⅰ型虫株，基因Ⅲ型虫株多见于动物感染（Ajzenberg等，2002）。但是最近我国也发现严重播散性弓形虫病患者（接受心脏移植）体内分离出Ⅲ型虫株，并导致患者死亡。南美洲先天性弓形虫感染多为非典型基因型虫株。值得指出的是，尽管基因型与虫株毒力在某些情况下存在相关性，但也未必尽然。RH株和GT1株同为基因Ⅰ型弓形虫株，两者对小鼠的急性毒力亦有不同，其差异与毒力效应分子激酶样棒状体蛋白18（ROP18）等的多态性有关。作为自然感染途径的经口传播，基因Ⅱ型虫株能够引起更为严重的回肠炎（Liesenfeld，2002）。
我国弓形虫基因分型及毒力研究起步较晚。迄今国内各课题组从不同地域和宿主体内共分离得到305份人兽分离株样本（或弓形虫基因组DNA），基因分型结果共发现12个基因型，其中Chinese 1型占所有分离株的74.0%，为我国优势基因型。动物接种和细胞培养结果显示，Chinese 1型弓形虫分离株Wh3和Wh6，同样也存在着毒力的显著差异：前者毒力较强，1 000个速殖子感染昆明小鼠30天内死亡率达92.9%；后者毒力较弱，感染同期小鼠死亡率低于45%。PRU株死亡率仅为16.7%。Wh6和PRU株均可在小鼠体内成囊（Li等，2014；Wang等，2013a，2013b）。鉴于同一基因型虫株存在着不同毒力株，提示PCR-RFLP分型并不能区分我国Chinese 1型虫株的毒力特征。为进一步揭示Chinese 1基因型弓形虫的毒力相关分子，宜采用组学技术及基因编辑技术进行深入研究。有趣的是，无论是欧洲或北美的弓形虫原型克隆谱系还是南美的非典型虫株，ROP16被认为是一种重要的毒力效应分子（Alvarez等，2015）。但是我国Chinese 1型虫株兼具ROP16 Ⅰ/Ⅲ 和GRA15 Ⅱ 两个调控宿主免疫应答的关键效应分子，并且敲除ROP16的Wh3虫株并未见到毒力减弱（Cheng等，2015；Wang 等，2018）。这些结果提示我国的Chinese 1优势基因型弓形虫株具有迥异的宿主免疫应答特点和毒力特征。
在模式动物中，可以采用性状决定基因来进行连锁分析，通过人为设计的实验性遗传杂交分析后代不同表型的比例，计算基因间的遗传距离，并据此绘制遗传图谱。弓形虫遗传图谱绘制是通过能够区分不同单倍体型虫株的RFLP标记结合脉冲场凝胶电泳技术（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）分离染色体，并通过Southern杂交将与多态位点互补的核酸探针定位到凝胶所分离条带，并通过放射自显影技术在膜上显现出来，从而生成遗传连锁图谱。随着研究的深入，弓形虫遗传作图方法也在不断革新，主要基于技术效率、成本及可用性。使用基于PCR的方法来扩增包含定义RFLP的位点，可以实现更高效率的基因分型。弓形虫Affymetrix基因芯片的建立为基于EST差异的单特征多态性和基于PCR-RFLP遗传标记进行基因分型提供了一种替代手段。前已述及，随着测序成本的降低，全基因组测序也广泛应用于弓形虫基因分型。弓形虫原型克隆谱系代表性虫株全基因组序列的完成和基因组数据库的建立（www.ToxoDB.org）为数量性状基因定位提供了框架。基因组的组装与连锁图谱的产生密切相关，连锁图谱被用来识别属于单个染色体的重叠群和支架。值得注意的是，不管标记的密度如何，遗传作图的限制性条件是杂交的频率，因此作图精度受可用后代数量的限制。
弓形虫遗传连锁图谱的构建经历了几个阶段。利用Southern杂交从Ⅱ型虫株单倍体型和Ⅲ型虫株单倍体型遗传杂交中鉴定出64个可识别RFLP的遗传标记，在19个重组后代中解离，得到了第一代遗传连锁图谱。在这一阶段，共识别出11条染色体，总遗传图谱距离小于150cM。随后，通过Ⅰ型虫株单倍体型和Ⅲ型单倍体型虫株杂交，在基于PCR分型的基础上利用112个遗传标记从两个平行杂交组合中得到遗传连锁图谱。染色体数目虽保持不变，但连锁谱图扩大到400cM。最后，利用250个基于PCR-RFLP遗传标记对Ⅱ型和Ⅲ型杂交及Ⅰ型和Ⅲ型虫株杂交的71个后代进行分析，使用MapMaker EXP 3.0软件生成连锁图谱。综合上述两个平行杂交组合的结果，发现弓形虫遗传连锁图谱由14个连锁群组成，总长度为590cM。弓形虫的交叉率平均约为100kb/cM，但在Ia染色体上的最低交叉率为42kb/cM，在VⅡb染色体上的交叉率最高为150kb/cM。弓形虫的平均交叉概率明显低于恶性疟原虫（17kb/cM），这使得精细定位弓形虫遗传性状更加困难。根据遗传标记的位置和连锁图谱，以及插入文库中BAC末端和粘粒末端序列，将支架组装并排序成假定的染色体。弓形虫基因组中（65Mb）超过95%是通过这一策略组装，从而为遗传图谱和鉴定目的基因提供基础。
细胞学研究证实，弓形虫生活史中大多阶段为单倍体，但通过配子生殖形成的卵囊为二倍体，卵囊的减数分裂是导致单倍体子孢子形成的主要原因。弓形虫在减数分裂期间的有性重组产生了含有双亲本基因型的子代，对于某些二元性状，可利用连锁关联定位靶基因。但许多表型性状，如增殖和毒力，受多个基因位点调控，数量性状遗传位点分析就成为对复杂性状定位靶基因的一种有效的统计学方法。Lanser和Botstein研究表明，基于遗传标记的区间定位可以可靠定位QTL。进行QTL分析需具备2个基本特征：能够绘制足够详细的遗传图谱和亲本之间存在表型差异。QTL分析不仅评估了不同位点的贡献，还提供了统计方法来解释出现在大数据集上的假阳性关联的可能性。这通常表示为似然比，该似然比将给定关联是真实的概率与它可能偶然发生的概率相关联。这些计算的结果称为对数似然比，即LOD（logarithm of odds）分数。当所有位点的LOD按照染色体位置排序并绘制成图表时，具有显著LOD峰值的位点即被识别。这些数量性状遗传位点包含表型遗传的遗传基础，其数量和效应大小取决于关联的强度。
弓形虫可自然感染各种啮齿动物，并具有在中间宿主及猫科动物终宿主肠上皮内分别进行无性生殖和有性生殖的复杂异种生活史过程。针对这一事实，Pfefferkorn及其同事开发出了在猫体内的经典的遗传杂交实验。遗传杂交分析是由化学诱变研究促进的，其以培育具有抗性基因的突变体虫株为前提，如抗氟脱氧尿嘧啶核苷（fluorodeoxyuridine，FUDR）和抗西奈芬净（sinefungin，SNF）弓形虫株，将两株独立耐药突变体虫株同时平行感染同一只猫，可导致亲本虫株异型杂交而获得双重耐药重组后代弓形虫株。这些研究证实了弓形虫遗传杂交实验遵循孟德尔遗传定律，即亲本等位基因的独立分离，为弓形虫遗传连锁图谱的建立及利用遗传杂交研究表型的遗传基础创造了条件。
QTL最初被用来评估弓形虫在小鼠模型中的急性毒力，使用强毒的Ⅰ型虫株GT1与无毒的Ⅲ型CTG虫株之间的遗传杂交（表3-9），杂交后代通过近交系小鼠分析毒力表型，并通过不同剂量速殖子感染的累积死亡率来确定急性毒力，并对子代进行基因分型，以确定急性死亡率与特异性标志物的分离情况（Taylor等，2006）。重组后代的表型分析揭示了从强毒到无毒的一系列表型，甚至包括在双亲本虫株中都没有的中间毒力水平。当急性死亡率被认为是单基因模型时，将其定位在染色体Ⅶa中心区的单个QTL上。这一发现证实了正向遗传学在分析毒力分子基础方面的应用。完成Ⅱ型虫株ME49的基因组序列和使用遗传图谱组装基因组，使得将性状映射到确定的基因组区间和鉴定控制重要生物表型的基因成为可能。通过QTL对表型特征分析表明，软琼脂迁移、跨越极化上皮细胞迁移、急性毒力和存活小鼠的血清反应都定位在Ⅶa染色体上的一个单峰。最初，急性毒力和迁移表型QTL的分辨率受到遗传标记密度的限制，其只允许定位到大约1.5～2Mbp。这些性状的精细定位是通过在Ⅶa染色体的中心区域加入额外遗传标记，并通过鉴定在该区域有交叉的额外重组后代来实现。这导致了不同的QTL的解析，一个QTL与跨越极化上皮迁移和从感染病灶迁移有关，另一个QTL则与急性死亡率和血清反应有关。因为弓形虫基因组结构由遗传图谱构建，因此有可能将这些区域直接固定在基因组上，从而识别候选基因。包含毒力表型的QTL区域有140kb且含有21个预测基因，通过微阵列杂交对其表达谱进行分析，发现该区域末端一个称为ROP18的基因表达水平截然不同，这是根据蛋白质组学研究或功能分析中所描述的棒状体蛋白的顺序编号而命名的。对预测的开放阅读框架研究发现：①ROP18含有一个信号序列，预测为一种分泌型蛋白；②其含有一个保守的前结构域和加工位点，为典型的ROP2蛋白家族；③氨基末端区域含有一个由三个低复杂性区域组成的簇，以两亲性α-螺旋区为代表；④含有一个预测具有催化活性的丝氨酸/苏氨酸（S/T）激酶结构域。用Ⅰ型虫株的ROP18 Ⅰ 等位基因转染Ⅲ型虫株，将导致弓形虫在纳虫泡内的增殖效率急剧增加，对小鼠模型的致死率提高4～5个数量级，证实了该激酶在弓形虫致病中的作用。
表3-9 弓形虫克隆谱系之间遗传杂交概述
通过Ⅱ型和Ⅲ型杂交后代的初步研究表明，基因重组可导致比双亲本虫株更高的毒力水平（Saeij等，2006）。对该杂交后代的进一步分析可用于鉴定多个性状的遗传位点，如不同剂量感染后的死亡时间，以及在任何剂量下存在死亡率或无死亡率的二元性状。在第一次QTL扫描中，位于Ⅻ染色体SAG3遗传标记附近的一个名为VIR1的基因位点被发现。对比其他性状，如多态性程度，表达水平差异，被分泌可能性及与宿主相互作用，导致ROP18作为Ⅶa染色体上VIR3候选基因被鉴定。Ⅰ型和Ⅱ型等位基因具有高度多态性，它们之间存在28个氨基酸差异，这种高多态性伴随着高dN/dS比率和在该位点的强阳性选择。除了ROP18之外，利用Ⅱ×Ⅲ型遗传杂交鉴定了另外四个毒力QTL。VIR1是LOD得分最高的毒力QTL，被证明其提升毒力是由Ⅰ型和Ⅲ型虫株ROP5位点所驱动。VIR2位于X染色体左臂，存在两个候选基因，分别为TGME49_226380和TGME49_225160。VIR4是由于ROP16调节宿主细胞中STAT3/STAT6活性而发挥作用。VIR5尚未被证实，但普遍认为是由于腺苷激酶在Ⅲ型亲本背景中发生突变。在Ⅱ型虫株中引入ROP16 Ⅰ /ROP16 Ⅲ 等位基因将导致Ⅱ型虫株毒力减弱，与QTL预测相一致。
在Ⅰ型和Ⅱ型虫株之间进行遗传杂交，确定了编码多态性假激酶的ROP5位点，虽然ROP5含有激酶结构域并结合三磷酸腺苷，但其通过构象改变并不催化磷酸转移。ROP5为拷贝数变异基因，在基因Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型虫株中分别为4、10和6个拷贝，这些拷贝中每个毒力株至少含有3个不同的等位基因，其中基因Ⅰ型和Ⅲ型弓形虫等位基因相似，暗示存在正向选择的证据。此外，将南美的type 10单倍体型VAND虫株与type 2单倍体型ME49虫株进行杂交分析，亦证实ROP5为毒力差异的主要决定因素。Behnke等（2016）使用CRISPR/Cas9技术敲除ROP18或ROP5位点，证实上述位点与属于Clade B进化支的南美弓形虫株TgCtBr5和TgCtBr18的急性毒力直接相关。总而言之，ROP18和ROP5等位基因在所有四个弓形虫遗传杂交中都证实与急性毒力表型相关，并在Clade A、B、C、D、F 5个进化支的代表性虫株中显现功能（图3-3）。有趣的是，通过ROP18和ROP5位点并不能预测同属Clade C进化支的type 9单倍体型和type 3单倍体型虫株毒力表型，两者均含有无毒的ROP18等位基因和有毒的ROP5等位基因，但type 9单倍体型虫株如P89对小鼠表现出急性毒力，而type 3单倍体型虫株如VEG或CTG对小鼠无毒，这表明可能存在其他因子介导毒力表型。最后，不同地域的优势虫株如中国的type 13单倍体型，非洲type 14单倍体型，欧洲type 16单倍体型，北美type 11单倍体型的毒力表型的QTL分析还未经过杂交验证，有待进一步研究。
（苏春雷 余 莉 王 林 高江梅）