第四节
弓形虫遗传多样性及种群结构

早在30年前，基于MLEE和PCR-RFLP分析开始了有关弓形虫遗传多样性的研究。然而，由于当时分离到的弓形虫虫株数量有限，地理来源较单一，在很长一段时间都认为弓形虫为无性系克隆种群，将其简单地分为3种克隆谱系，依次命名为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。因此，曾一度提议只需检测弓形虫的一个基因位点就足以将其分型。然而，即使在早期弓形虫虫株来源单一的情况下，也有一些弓形虫虫株经检测后发现其遗传基因型并不符合上述3种标准克隆谱系。这些弓形虫虫株主要来自于北美或南美洲的野生动物，表明在欧洲和美国以外的其他地区可能存在不同的种群结构（Howe和Sibley，1995；Dardé，1996）。

此后，人们在弓形虫病患者体内分离到一些非克隆株系，发现能够引起严重的弓形虫病，提出弓形虫基因型决定其临床致病性的假设。因此，迫切需要一种全新的、较为完善的基因分型方法（如多位点分型法），能够对来自世界不同大陆、不同生物群体（野生或驯养）以及不同种类宿主的弓形虫虫株进行有效的基因分型。全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）技术的应用，促使人们从全新的角度深入认识弓形虫的遗传结构以及全球种群结构。

有性重组过程能够改变某一物种种群的遗传结构和特性。就寄生虫而言，其寄生的环境因素、寄生宿主的生物学特征和行为以及因人类活动引起的频繁交流均可促使有性重组过程的发生。因此，较为丰富的弓形虫基因型才能更为真实地反映出弓形虫的种群结构。

基于小鼠模型实验，人们对不同弓形虫虫株的毒力特性有了较为全面的了解。然而，由于从人体内分离虫株较难，临床数据有限，因此基于人体实验真实反映弓形虫与宿主之间的相互作用是不现实的。所以，目前对弓形虫基因结构与人类弓形虫病的关系尚不清楚。

一、弓形虫遗传多样性

如前所述，目前相关研究多使用PCR-RFLP、微卫星多位点标记和MLST等技术用于弓形虫遗传多样性研究。但是在任何情况下，基因分型方法都必须依赖于多位点标记才能很好地捕获遗传多样性和遗传重组的信息。基于单基因位点分析的基因分型目前已很少用。目前，人们一致认为至少要选择五个基因标记，且每个标记分别位于不同的染色体。近十年来，由于大规模平行DNA测序技术或二代测序技术在弓形虫基因分型中的应用，促进了人们对弓形虫种群遗传学到种群基因组学的转变。虽然基于微卫星或RFLP技术的标准分型标记被广泛应用，但全基因组测序技术深化了人们对弓形虫遗传结构的认知。

利用比较基因组分析，对存储在NCBI序列阅读档案（sequence read archive，SRA）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）的100多条弓形虫全基因组序列进行分析，证实这些序列归属于16个不同的弓形虫单倍群。

2012年，Su等用PCR-RFLP方法分析了全球956个弓形虫DNA样本，鉴别出138个独特基因型。用PCR-RFLP和4个内含子MLST测序分析可将这138个基因型分为A、B、C、D、E和F等6个进化支（Clade）和15个不同的单倍群（图3-3），显示了全球弓形虫群体遗传学的多样性。2016年，Lorenzi等从包含这6个组群中15个不同的单倍群中选出62株弓形虫，并以ME49（Ⅱ型）为参考株，进行全基因组测序分析，共鉴定出802 764个SNPs。基于邻域网络（neighbor-net network）、外接物（admixture）和主坐标分析法（principle coordinate analysis）与低分辨率的PCR-RFLP和内含子测序分析，同样显示出类似的遗传结构和单倍群模式。该结果表明，尽管多位点PCR-RFLP和内含子测序分析的分辨率有限，但仍然可以捕捉到主要的遗传多样性信息。

二、弓形虫种群结构

弓形虫种群包含了丰富的、多种代表性的克隆基因型，然而这些基因型是经遗传杂交形成的。弓形虫的分布具有明显的地理隔离性，其中克隆基因型广泛分布在北半球，非洲和亚洲等地（ToxoDB #1、#2、#3、#4、#5、#9），而南美洲地区弓形虫基因型呈丰富的多样性（图3-4）。

（一）北美和欧洲的种群结构

弓形虫生活史包含了有性生殖阶段。不同地区的种群结构显示出的克隆谱系可能是由于虫株之间缺少杂交的机会，而主要以自交有性增殖方式扩散。早期基于多位点同工酶分析法对来自欧洲的弓形虫虫株进行分型检测，证实该地区流行弓形虫虫株多样性较低。之后利用RFLP-PCR法对来自北美和欧洲地区更多的弓形虫分离株分型检测，发现一个非常明显的克隆种群结构。从北美和欧洲地区的弓形虫感染患者以及慢性感染动物中分离获得更多的虫株，证实主要是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型克隆谱系。在北美和欧洲地区，Ⅱ型占绝对优势，偶尔发现这三种克隆谱系的重组虫株。此外，个别分离株与三种克隆谱系差别很大，也因此被称为“非典型虫株”。已经证实弓形虫在终末宿主猫体内完成有性增殖，产生许多重组体。然而在欧洲和北美地区，弓形虫克隆谱系能够很好地维持其种群结构。这可能由以下原因所致：①有性增殖并不是弓形虫传播的必要条件，也可以通过摄入肉类或杂食性喂养摄入弓形虫的无性生殖阶段获得感染；②猫同时感染多种基因型弓形虫的可能性很小，因此弓形虫通常会经过自交而产生相同基因型的卵囊；③在猫体内一个弓形虫的单倍体即可增殖完成生活史；④一旦在某一地区形成有限的遗传结构的差异，该种群结构将可能被长期保持（Ajzenberg等，2004）。

（二）南美洲种群结构

2007年，Khan等基于弓形虫的多个内含子序列将来自南美洲地区包括巴西和圭亚那的弓形虫与北美洲地区已鉴定的标准虫株进行分型比较，证实北美和南美洲地区的弓形虫种群是生殖孤立的，并且在缺乏遗传交换的情况下进化出不同的双等位基因多态性。Khan等基于内含子序列构建系统发育树，发现流行于该地区的弓形虫虫株聚类成11个不同的单倍群，为该地区主要的代表谱系（图3-5）（Khan等，2007）。当然，流行于北美和欧洲地区的3个克隆种群（Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型）同样在南美洲有流行分布。此外，ToxoDB#4、#5、#8以及#9（Chinese 1）在南美洲也有流行。通过系统发育树对北美及欧洲地区和南美洲地区弓形虫的种群结构进行比较，可以推测分布于南美洲地区的11个弓形虫单倍群，经过很少的遗传杂交即可经4个祖先谱系重建（Sibley等，2009）。Boyle等曾预测北美地区的3个克隆株系只需经过少量的基因杂交即可产生（Boyle等，2006）。因此，在很长一段时间内，偶然的重组极大地改变了弓形虫的种群结构。尽管流行于北美洲和南美洲的弓形虫虫株各自拥有相对独立的等位基因多态性，但实际上他们拥有共同的祖先。

（Khan等，2007）

（三）亚洲种群结构

与北美和欧洲地区情况相似，流行于亚洲地区的弓形虫其种群结构较单一，以ToxoDB#9（Chinese 1）株为主要流行谱系。当然主要流行于欧洲和北美地区的克隆株（如Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型）在亚洲地区也有分布，但是以Chinese 1基因型虫株为该地区的优势虫株。近年来，中国学者多使用多位点RFLP-PCR分型技术对流行中国地区的弓形虫虫株分型，证实该地区大部分流行株为Chinese 1基因型。但是，同样属于Chinese 1型的不同虫株对小鼠毒力差异很大。因此，可推测RFLP并不能捕获该地区弓形虫虫株的所有变异特性。之后，高江梅等基于MLST分型技术对流行于中国的多个弓形虫虫株重新进行分型，发现RFLP分型后属于同一个单倍群的虫株不再是同一单倍群，有一些和Ⅰ型典型株聚类，有的和Ⅲ型标准株聚类，但多数虫株还是和Ⅱ型标准株聚类。与南美洲情况相似，该地区的弓形虫单倍型同样经遗传杂交由祖先谱系形成。

（四）弓形虫起源及传播

目前，对弓形虫的遗传多样性的驱动因素仍知之甚少，对弓形虫谱系的起源亦有不同观点。早期对北美及欧洲地区和南美洲地区弓形虫的种群结构比较显示，弓形虫虫株各自拥有相对独立的等位基因多态性。由于两地弓形虫长期的地理隔离，漫长的进化过程中经随机突变和基因飘移逐渐累积了各具特色的单核苷酸多态性。通过计算流行于各地理区域弓形虫虫株的等位基因（以ChrIa例）多样性的程度，推测这种地理隔离大约发生在100万年前。其中一种可能是伴随着300万年前巴拿马地壳上升并连接了南北美大陆之后，弓形虫跟随其宿主猫一起迁移到了南美洲。推测弓形虫最初源于北半球（Khan等，2007）。在1万～3万年前，曾有人类迁徙到南美，导致一些植物和动物引入南美洲后的多样性变化。类似的人类活动事件可能是促进南美洲地区弓形虫遗传多样性复杂化的基础。

如果弓形虫起源于北半球，然后随着猫科动物的扩散而进入南半球，那么北半球的弓形虫有更长的进化时间，应该有更多的遗传多样性。有一个可能的解释是，大约一万年前源于中东地区和稍后在中国东部的农业革命彻底改变了人们的生活和自然环境，大大降低了物种的多样性，同时导致家鼠和家猫的数量增加，因此形成了一个新的弓形虫的繁殖传播途径，即家畜循环链（Shwab等，2018）。在之后的数千年里，随着农业生产的大面积扩散以及人口的增长和迁徙，弓形虫家畜循环链也随之扩散。这个新的传播方式所带来的遗传选择压力导致少数弓形虫克隆谱系快速扩增，最终取代了原有的遗传谱系。这个推论可以解释北半球弓形虫的克隆型群体遗传结构。由于家畜循环链在南美洲的影响时间较短，规模也相对较小，再加上热带雨林地区动物种类的高多样性，使得弓形虫的遗传多样性仍然得以保持（Shwab等，2018）。

然而，最近有学者推测当下流行的弓形虫虫株可能起源于南美洲的哥伦比亚（Bertranpetit等，2017）。Bertranpetit等在全球范围内收集了来自13个种群的168株弓形虫分离株，对其5个基因片段（GRA6、GRA7、SAG3、UPRT1和UPRT7）进行了测序。运用基于最大似然法的系统进化估算最新共同祖先时间（time to the most recent common ancestor，TMRCA），以统计学方法对弓形虫的起源进行了研究。结果显示，现存的弓形虫虫株很可能是从150万年前的南美祖先进化而来，并引起了弓形虫随后在世界范围内的传播。弓形虫在不同宿主之间的传播使一些基因型迁移到北美洲，然后通过白令海峡迁移到亚洲和欧洲，最后通过两条不同的迁徙路线进入非洲（图3-6）。在非洲、亚洲和欧洲，弓形虫的种群结构以少数克隆株为主，这可能与家猫数量大量增加有关，它们大量扩增了预先适应的基因型。弓形虫祖先谱系的出现推测大约发生在1 100万年前，随着猫科动物来到南美洲之后出现的。据此推测弓形虫的一个祖先谱系很可能与猫科动物一起抵达南美洲，并且通过食肉动物经口感染和该地区猫科动物的播散，从而进一步进化，使得某个新的虫株能够超越祖先谱系，并引起大范围的播散。

（仿Bertranpetit等，2017） ejCh5ABHPNBEUy7jqrcdKyEsFM1rQO5kaze0z5txc3hawaVz5zvDtFq4HZdob9T0