弓形虫与弓形虫病最新章节_沈继龙著

第二节
基因分型

弓形虫是一种全球性分布的人兽共患的寄生原虫。近年，通过分子和种群遗传学研究显示，该虫具有高度的遗传多样性和复杂的种群结构特征。人们对弓形虫基因型的研究最早始于20世纪90年代，主要采用多位点酶电泳技术（multi locus enzyme electrophoresis，MLEE）和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP），并据此提出弓形虫种群结构主要为基因Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型的经典基因型分类法，亦称为原型谱系（archetypal lineage）或标准型。这在弓形虫基因分型领域一度成为研究者的参考标准，标准基因型参考虫株也由此确立。早期的研究中，学者大多采用单个遗传标记进行弓形虫基因型分析。单位点扩增在基因分型鉴别中存在较大误差，许多稀有的、非典型基因型不能与标准型进行区分。同时由于不同的研究选取的遗传标记不同，不同实验室得出的结果和结论也不同。随着寄生虫分子遗传学的发展，以核酸扩增技术为基础的多位点基因分型方法的广泛应用，来自全球不同地域和宿主（包括人源和兽源）的弓形虫虫株的逐渐增多，基因分型遗传标记的不断开发以及虫株全基因组测序的完成，为人们理解弓形虫基因型及其全球种群结构特征提供了一个新的维度。

对弓形虫基因型的分析，可为群体生物学、流行病学和基因型相关致病机制的研究等提供重要依据，从而进一步揭示基因型和疾病模式之间潜在的相关性。文献中用于弓形虫基因分型的方法较多，主要为MLEE、可移动遗传元件聚合酶链反应（mobile genetic elements PCR，MGE-PCR）、随机扩增多态性DNA聚合酶链反应（random amplified polymorphic DNA PCR，RAPD-PCR）、PCR-RFLP、微卫星（microsatellite，MS）分型、多位点DNA测序（multilocus DNA sequencing，MLST）以及血清学分型等。其中，以PCR-RFLP方法最为常用（Su等，2006），其次为MS分型（Ajzenberg等，2010），这为我们了解弓形虫遗传多样性和群体遗传学提供了重要手段。这些方法依赖于内切酶识别核苷酸序列中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。虽然弓形虫基因组中SNP突变率较低（为10 ^-9 ～10 ^-10 ），但由于这些方法操作简便经济，在实验室得到广泛应用，我国也大多采用此类方法进行弓形虫基因型研究。血清学分型是人工合成弓形虫抗原的肽类，如致密颗粒蛋白GRA6和GRA7，由于这些肽类是由弓形虫中的多态性位点所编码，所以仅需宿主的血清就可以对弓形虫的遗传学进行鉴定（Kong等，2003）。然而，由于可用的血清学分型标记非常有限，这种方法目前在弓形虫群体遗传学研究中应用并不广泛。

一、MLEE

MLEE分析是先通过电泳技术把酶蛋白分子分离，再用免疫组织化学方法进行特异性染色，从而将酶的位置和活性直接在染色区带以酶谱的形式展示出来。该法在早期被广泛应用于利什曼原虫、锥虫等的遗传学研究，也是对弓形虫分离株进行遗传多样性研究的方法之一。MLEE分析大多选择弓形虫天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GSR）、淀粉酶（amylase，AMY）、磷酸葡萄糖异构酶（glucose phosphate isomerase，GPI）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）和丙酰脂酶（propiobyl esterase，PE）等6个酶分子作为遗传标记。通过对83个弓形虫分离株进行MLEE分析发现，每一种酶有2～3个亚型，总共产生了12个酶谱型（zymodeme，Z），大部分虫株属于Z1、Z2（Z4和Z2型非常相似）和Z3型。后期发现，Z1，Z2和Z3酶谱型恰与弓形虫原型谱系（基因Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型）相一致；而Z5-Z12型与非典型虫株一致。在弓形虫遗传学研究中，MLEE分辨率相对较低，同时因分型费时费力，需预先培养并纯化足够量的弓形虫速殖子，因此目前已很少使用。MLEE可为研究弓形虫遗传多样性及其与疾病表型之间的联系提供线索。

二、PCR-RFLP

RFLP是用限制性内切酶降解目的基因，当酶切位点存在DNA多态性或位点之间存在改变DNA片段长度的更大突变时，就可以用该方法检测出不同物种间的差异。PCR-RFLP是将PCR技术与RFLP相结合而形成的一种DNA检测方法，是对传统RFLP的一种改进。其本质是检测DNA序列内单核苷酸多态性，但是只检测内切酶识别位点内的SNP。该过程首先利用PCR扩增目的基因，然后用限制性内切酶酶切所扩增到的目的基因片段，再将酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，基于片段长度的电泳速度的差异来判读比对不同来源基因序列的差异性。该方法需要样品量少，样品纯度要求不高，适合快速和大量的样品分析。

早期最常用于弓形虫基因分型的特异性遗传标记是SAG2基因，主要是通过对该基因的两个限制性酶切位点进行PCR-RFLP分析。但仅用SAG2单个基因进行基因分型的敏感性有限，特别是对于重组型或非典型基因型弓形虫虫株敏感性就更低。因此，人们开发了多位点PCR-RFLP基因分型方法。

多位点PCR-RFLP分析是选择多个含SNP的遗传标记进行PCR-RFLP分型。该方法后来被广泛应用于世界各地的弓形虫虫株基因多态性分析等分子流行病学研究，并且随着研究的深入，不断地发展和完善。Howe和Sibley（1995）运用6个PCR-RFLP标记对来自北美和欧洲的106个弓形虫虫株进行分型，结果显示这些虫株主要分为3个克隆谱系，分别是基因Ⅰ型、基因Ⅱ型和基因Ⅲ型。只有4个分离株表现为基因Ⅰ型和Ⅲ型，或Ⅱ型和Ⅲ型的重组。由此推断北美和欧洲地域流行弓形虫主要为原型谱系的种群结构。由于不同实验室选用的基因位点不尽一致，因此基因分型结果很难进行标准化。另外，用于基因分型的遗传位点多为单拷贝基因，故当样品量少，DNA含量低，特别是对临床和实验组织样品，该方法的敏感性就大为降低。为此，针对弓形虫10个遗传标记的多重多位点巢式PCR-RFLP方法（Mn-PCR-RFLP）应运而生（Su等，2006）。这10个遗传标记包括SAG1、SAG2［alt. SAG2，（3′+5′）SAG2］、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1和Apico。该方法首先利用外部引物通过多重PCR扩增目片段，最后通过酶切、电泳对图谱进行比对分析。与传统的PCR-RFLP相比，该法的敏感性显著提高，检测下限为10个虫体，另外也简便快速。目前，Mn-PCR-RFLP分型已经成为各实验室通用的弓形虫基因分型技术（Shwab等，2014）。

三、MS分型

MS序列，又称短核苷酸串联重复序列（short nucleotide tandem repeats，STR），是一段均匀分布于真核生物基因组中的简单串联重复序列，其核心序列呈串联重复排列，侧翼DNA序列位于核心序列的两端，为保守的特异单拷贝序列。它们的多态性是基于等位基因的不同重复数量。在弓形虫中，这种重复序列一般比较简单，重复单位最少是2个核苷酸，重复次数为2～20次。一般认为，真核生物中MS序列的进化速度较快，在每次复制中每个位点的突变率为10 ^-2 ～10 ^-5 。Costa等（1997）通过对弓形虫原型谱系的大量分离株的研究发现，弓形虫的MS序列进化速度较慢。虽然对弓形虫SNP和MS序列精确的突变率尚不清楚，但是MS序列的突变率比SNP高，用于多态性分析优于SNP，在遗传学鉴定方面具有更高的分辨率。对MS序列的分析是通过PCR扩增和测序完成的。主要原理是根据重复序列两端的保守序列设计特异性荧光引物，扩增每个位点的MS序列，比较扩增产物的长短变化，其结果可显示不同基因型的个体在每个MS位点的多态性。该法已广泛应用于锥虫、利什曼原虫、疟原虫、隐孢子虫和弓形虫的基因分型研究。到目前为止，包含15个MS标记的多重PCR方法已被广泛应用于弓形虫基因分型研究，这些分型标记主要包括TUB2、W35、TGM-A、B18、B17、M33、MIV.1、MXI.1、M48、M102、N60、N82、AA、N61和N83，它们分布于已知基因的内含子内（如编码β-微管蛋白的TUB2基因）或表达序列标签内等。以［TG/AC］ _n 或［TC/AG］ _n 为重复序列的8个MS标记（TUB2、W35、TGM-A、B18、B17、M33、IV.1和XI.1）具有较低的突变性，能够区分原型系与非典型基因型虫株；而具有［TA/AT］ _n 重复序列的7个MS标记（M48、M102、N60、N82、AA、N61和N83）则具有较高的突变性，可用来区分亲缘关系相近或同一基因型内部弓形虫种群结构（Ajzenberg等，2010）。MS分型分辨率高，准确性好，当样品量比较充足并对成本要求不高时，该方法应是合理的选择。

四、DNA序列分析

DNA序列分析是研究弓形虫基因多态性的一种高分辨率方法，在寄生虫鉴定与分子遗传学研究中已得到广泛应用。20世纪90年代，DNA测序只是作为辅助手段，大部分研究只选取1～2个弓形虫目的基因进行分析。但随着PCR技术的发展及测序成本的降低，全自动DNA测序仪的使用，MLST（基于内含子或管家基因）开始逐步大规模应用于弓形虫基因型鉴定及种群遗传学研究中，特别是非典型基因型弓形虫株的遗传多样性研究。目前DNA序列分析应用于弓形虫基因分型领域主要为MLST和内含子测序分析法。

MLST通过对目的基因进行测序来检测基因序列内的SNP。SNP是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A、G、C、T）突变而引起的多态性，可用于群体遗传学中关于生物起源、演化和迁移等方面的研究。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因编码序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。DNA序列分型标记SAG1、SAG2、SAG3、SAG4、BTUB、c22-8、c29-2、L358、PK1、Apico、GRA6、GRA7和B1基因等，已被广泛用于弓形虫遗传多样性研究，并且对研究毒力效应分子具有重要意义。该方法具有很高的分辨率和准确性，可在脑脊液或泪液中检测低至5～10个弓形虫。但是大量的扩增和测序需要有充足的样本，耗时并且成本相对较高。

内含子测序分析法是对内含子进行扩增测序，检测内含子序列内的单核苷酸多态性。大量分子演化研究发现，内含子对研究种内遗传进化方面具有重要意义。Khan等（2005b）发现PCR-RFLP分型并不能精确区分弓形虫等位基因之间的多态性，而内含子可用于进行种内系统发育的比较。对分离自免疫缺陷患者的10株弓形虫先进行多位点PCR-RFLP分析，发现它们仅是重组基因型，再进一步对其进行内含子测序，结果显示出不同于原型谱系的新的多态性，这对进一步分析弓形虫虫株的起源具有重要意义。Su等通过同时采用Mn-PCR-RFLP分析和内含子测序分析（UPRT1、UPRT7、GRA6、GRA7、EF1和HP2）将138个PCRRFLP基因型分成15个单体型和6个主要演化支（Su等，2010；2012）。这对研究弓形虫遗传进化，区分克隆系、非典型基因型及新基因型提供了非常有力的依据，也为不同实验室间分型结果的比较分析奠定了基础。

五、基因型命名

目前对弓形虫的基因分型命名还没有一个统一的标准。由于在既往的研究中不同实验室采用不同的方法用于不同虫株的分型研究，每种分型方法均有其各自的分类命名的方法，从而导致弓形虫基因分型命名的混乱。表3-2总结比较了常用分型命名方法。传统的基因型命名是基于三个优势谱系的克隆种群结构，即基因Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型（type 1，type 2和type 3）。所有其他基因型均被称之为非典型基因型（atypical genotype）或外来基因型（exotic genotype）。弓形虫PCR-RFLP数据库基因型命名系统（ToxoDB PCR-RFLP genotype naming system）是基于前述的10个PCR-RFLP标记物的检测结果，将每个基因型分别赋予一个编号，依次记录为ToxoDB#1，ToxoDB#2，ToxoDB#3……，迄今已发现近300个基因型，表3-3）。上述标记物可区分基因Ⅱ型和Ⅱ型变异型（type Ⅱ variant）。Ⅱ型的原型在Apico位点为经典Ⅱ型等位基因（PTG株和ME49株），而Ⅱ型变异型在Apico位点为经典Ⅰ型等位基因（PRU株）。弓形虫BRC编码命名系统则是基于15个微卫星标记（TUB2、W35、TGM-A、B18、B17、M33、MIV.1、MXI.1、M48、M102、N60、N82、AA、N61和N83），与原型谱系相一致，通常指其他克隆谱系地理起源，如非洲1型和加勒比海1型等（Ajzenberg等，2010）。单倍群（haplogroup）命名系统是基于5个内含子（UPRT、MIC、BTUB、HP和EF）的DNA测序结果，通过基因分型和聚类分析将全球弓形虫株分为16个单倍群（types 1～16）。此外，基于基因组SNP演化树分析可将各地弓形虫分离株分属6个演化支（Clades A～F）（Su等，2012；Khan等，2007；Behnke等，2016）。流行欧洲和北美的原型谱系弓形虫虫株，其中基因Ⅰ型RFLP分型为ToxoDB#10，属于单倍群type 1和Clade A进化支；基因Ⅱ型和Ⅱ型变异型RFLP分型为ToxoDB#1和#3，属于type 2单倍群和Clade D演化支；基因Ⅲ型RFLP分型为ToxoDB#2，属于type 3单倍群和Clade C进化支。我国弓形虫分离株经PCR-RFLP分型发现，ToxoDB#9型为优势基因型，命名为Chinese 1型，属于type 13单倍群和Clade D进化支。

表3-2　基于弓形虫不同基因分型方法的命名比较