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从目前实验室采用的14家试剂盒中，肌酸激酶（CK）样品体积分数为1∶25的有荣盛等8家，科华、中生、贝克曼、申索佑福为1∶50，柏定、赛诺迈德为1∶30，希森美康为1∶42；镁离子浓度大多为10.0mmol/L，科华为12.0mmol/L，荣盛为14.4mmol/L，而希森美康为100mmol/L。由于试剂盒中钙、镁离子浓度和样品体积分数设置不同，造成样本中肌酸激酶活性的激活/抑制不同，肌酸激酶结果变化很大。
参照中华医学会检验医学分会肌酸激酶推荐方法配制试剂：采用钙离子浓度为1.20mmol/L，分别与0、0.30、0.60、0.90、2.00、5.00、10.0、20.0mmol/L不同浓度的镁离子配制肌酸激酶测定试剂盒，采用镁离子浓度为0.90mmol/L，分别与0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40、2.80mmol/L不同浓度的钙离子配制肌酸激酶测定试剂盒。试剂1∶100mmol/L咪唑缓冲液中有D-葡萄糖24.0mmol/L、己糖激酶4.8KU/L、二磷酸腺苷2.4mmol/L、一磷酸腺苷6.0mmol/L、五磷酸腺苷0.12mmol/L、N-乙酰半胱氨酸24.0mmol/L、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶2.0KU/L、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）2.4mmol/L、醋酸钙1.20mmol/L、醋酸镁0.90mmol/L、Proclin-300防腐剂200μl/L。试剂2∶100mmol/L咪唑缓冲液中有磷酸肌酸180.0mmol/L、醋酸钙1.20mmol/L、醋酸镁0.90mmol/L、Proclin-300防腐剂200μl/L。
从天津医科大学宝坻临床学院心血管内科住院的患者中随机抽取15例，男性8例，平均年龄52.5岁；女性7例，平均年龄51.5岁。空腹采血2ml，离心10分钟，取血清备用。
取上述混合血清在Beckman AU5800全自动生化分析仪上，仪器自动将10μl样品加至250μl试剂1中混匀，37℃孵育3分钟，加入50μl试剂2混匀，37℃孵育5.1分钟，全自动分析仪在340～660nm波长处检测。仪器自动计算出肌酸激酶活性结果，测定3次，取平均值。
计算公式为：CK=ΔA/min×TV×1 000/6.33×SV×L
其中，ΔA/min为每分钟吸光度变化，TV为反应总体积，6.33为NADH在340nm处的毫摩尔消光系数，SV为样品体积，L为比色杯光径（cm）。
（1）同一标本按钙离子浓度1.20mmol/L，分别与0、0.30、0.60、0.90、2.00、5.00、10.0、20.0mmol/L的镁离子配制肌酸激酶测定试剂盒。测定结果如表2-26，图3-16。
图3-16 结果变化趋势图
表3-26 测定结果（mmol/L）
（2）同一标本按照镁离子浓度0.90mmol/L，分别与0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40、2.80mmol/L的钙离子配制肌酸激酶测定试剂盒。测定结果如表2-27，图3-17。
表3-27 测定结果（mmol/L）
图3-17 结果变化趋势图
（3）按照EP9-A3评价方法对钙离子浓度1.20mmol/L和镁离子浓度0.90mmol/L配制的肌酸激酶试剂盒进行方法学评价。
方法学评价：批内精密度为1.36%，批间精密度为3.12%，线性范围为4.3～1 246U/L，参考范围为6.5～24.0U/L。本研究方法性能验证指标达到实验室要求，可以进行患者的检测；但由于本方法试剂组成存在钙离子，不适用于与国家卫健委临检中心室间质量评价比较。
临床实验室常用酶法测定肌酸激酶，按照中华医学会检验分会肌酸激酶推荐方法：咪唑缓冲液（pH6.5，37℃）溶解HK、镁离子、葡萄糖、EDTA、AMP、ADP、NADP、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷酸腺苷、磷酸肌酸、N-乙酰半胱氨酸、催化剂、稳定剂、防腐剂，其中二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、五磷酸腺苷为抑制腺苷酸激酶活性，N-乙酰半胱氨酸保护CK上的游离巯基，镁离子为肌酸激酶和己糖激酶的激活离子。在临床实验室常用试剂盒中，镁离子浓度10.0mmol/L以上，而且使用EDTA去除血清中钙离子，这种方法使体外测定的肌酸激酶的活性远高于体内血液中肌酸激酶的实际活性。为了更好地反映人体血液中肌酸激酶活性，本研究建立了肌酸激酶检测新方法。
从表3-26和图3-16中可以看出，随着镁离子浓度的增高，肌酸激酶活性逐渐升高。从表3-27和图3-17中可以看出，随着钙离子浓度的增高，肌酸激酶活性逐渐降低。在目前测定方法中，镁离子浓度10mmol/L以上不等，而且使用了EDTA去除血清中钙离子。由于试剂盒中镁离子激活剂浓度不同，这样很难进行实验室间比对。高值稀释标本由于钙离子及镁离子稀释度的改变，稀释后结果可靠性更低。肌酸激酶受样品体积分数影响大于其他酶类。在正常人群中，血清镁离子浓度为0.75～1.02mmol/L，血清钙离子浓度为1.10～1.34mmol/L。在本研究中，参照人群中钙、镁离子浓度均值配置肌酸激酶试剂盒，NADH摩尔吸光系数在本研究中采用相同来源物质及测定条件，在各反应系统中，于340nm处的毫摩尔消光系数为6.33，其体外测定的结果更能够真实反映体内肌酸激酶的水平。从本实验方法学评价中看，本研究方法性能验证指标达到实验室要求。
通过以上研究可以看出，临床实验室应建立肌酸激酶测定统一规范，包括试剂盒中镁离子和钙离子浓度要求，以及高活性肌酸激酶试剂应采用钙离子浓度1.20mmol/L和镁离子浓度0.90mmol/L的稀释液稀释等。在肌酸激酶测定中，稀释效应十分明显，微小变动会导致测定结果的明显变化，因此，必须严格掌握。钙离子和镁离子浓度对于正确测定体内肌酸激酶活性，高值稀释结果可靠性，实验室间结果比对具有重要的临床意义。
（李立和 编，
解传芬 审）