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第一节
人和动物支原体蛋白质组学

一、人支原体蛋白质组学

目前对人支原体蛋白质组学的研究主要集中在肺炎支原体( M. pneumoniae ,Mp)、生殖支原体( M. genitalium ,Mg)、发酵支原体( M. fermentans ,Mf)、穿透支原体( M. penetrans ,Mpe)和人型支原体( M. hominis ,Mh),主要采用的技术方法包括双向凝胶电泳、串联亲和纯化及质谱等。其中,已有专门的包含Mp蛋白质组学的数据库。人支原体蛋白质组学数据库的建立,不仅有助于其致病机制的解析,还有助于支原体进化关系的构建和分析、感染的诊断、有效药物设计及候选疫苗开发等。

(一)肺炎支原体蛋白质组学

近年来,相关学者对Mp的蛋白质组学进行了大量的研究。Mp全菌蛋白质组学数据库的建立为阐明Mp生物学过程奠定了重要基础。Mp的磷酸化蛋白质图谱显示,Mp中有24种蛋白参与了细菌的能量代谢、糖代谢、基因转录和蛋白翻译及黏附等过程。有研究推测,Mp中可能存在新的激酶,以满足Mp对外界环境的适应。

为从蛋白水平上研究Mp与宿主细胞相互作用的分子特性, Sun等利用2-DE和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)研究了Mp感染人肺上皮恶性肿瘤A549细胞12h后细胞中蛋白表达谱,发现Mp感染后能诱导细胞内产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)并引起DNA损伤,为进一步利用蛋白质组学研究Mp感染的致病机制提供了实验依据。分析Mp感染A549细胞过程中细胞的分泌蛋白质组发现Mp感染后主要引起与代谢过程、应激反应及免疫应答相关蛋白的分泌。临床上,已有研究采用基于同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)的蛋白质组学方法获得了Mp患者血清中蛋白质图谱,并鉴定出260种差异表达的蛋白。这些研究为Mp的致病机制研究提供了新视野,对于发现针对Mp感染相关的特异生物标记和药物干预靶点具有重要的指导作用。

(二)生殖支原体蛋白质组学

Mg是引起性传播疾病中的重要病原体,研究者已用蛋白质组学方法和技术系统研究了Mg的功能蛋白(含磷酸化)、膜蛋白及免疫原性蛋白。其中,蛋白质组学鉴定的Mg蛋白能匹配上85.3%的Mg开放阅读框,然而Mg感染宿主细胞过程中,Mg如何影响宿主细胞蛋白质图谱的变化尚待研究。

(三)发酵支原体蛋白质组学

2012年,Liu等首次对人Mf M64的细胞质和脂质相关膜蛋白进行了蛋白质组学研究,鉴定了181个与Mf开放阅读框相匹配的蛋白,并对21个脂质蛋白的信号肽进行了分析,推测某些蛋白是Mf的毒力因子。经与已报道的支原体蛋白进行比较分析,发现Mf特有的蛋白可能有39个。Mf为兼性厌氧细菌,通过蛋白质组学比较Mf在有氧和无氧条件下的蛋白图谱,有助于对Mf生物学过程的理解,也有助于其致病机制的研究。

(四)穿透支原体和人型支原体蛋白质组学

Mpe主要感染人泌尿生殖道和呼吸道。目前对Mpe的蛋白质组学研究较少,Mario首次利用双向凝胶电泳和质谱方法对Mpe的蛋白质组学进行了研究,鉴定出的207个蛋白点与Mpe的153个基因相对应,同时采用Pro-Q Diamond磷酸化蛋白质染色鉴定出26个磷酸化蛋白。

对于Mh,有研究采用比较基因组和代谢组通路分析,发现了Mh的40个代谢通路,并鉴定出179个必需蛋白,其中59个与人蛋白无相似性,最终优选出16个适合药物开发的靶点蛋白。肠侵袭性Mh菌株能改变宿主细胞的功能状态并可能导致前列腺癌的进一步发展。Khan实验室利用Mh全蛋白组数据,采用生物信息学方法预测了多个能作用于宿主细胞线粒体、细胞质、细胞核及内质网的蛋白,这些蛋白可能改变宿主蛋白的性质和功能,进而可能促进前列腺癌的进展。

二、动物支原体蛋白质组学

近年来,研究者对致病动物支原体蛋白质组学进行了广泛研究。涉及的动物支原体主要包括猪肺炎支原体( M. hyopneumoniae ,Mhp)、猪鼻支原体( M. hyorhinis ,Mhr)、猪嗜血支原体( M. suis )、牛支原体( M. bovis )、丝状支原体山羊亚种( M. mycoides subsp . Capri )、无乳支原体( M. agalactiae )、鸡支原体( M. gallinarum )、鸡毒支原体( M. gallisepticum ,MG)、滑液支原体( M. synoviae ,MS)及莱氏无胆甾支原体( Acholeplasma laidlawii )等。这些支原体常在动物呼吸道或泌尿生殖道上皮细胞黏附并定植,引起肺炎、关节炎、乳腺炎及生殖道损伤等疾病,给养殖业造成了巨大的经济损失。动物支原体蛋白质组学的研究对于致病支原体的诊断、预防及治疗具有重要的意义。

(一)猪支原体蛋白质组学

目前,已有猪肺炎支原体Mhp、Mhr及猪嗜血支原体的蛋白质组学研究的相关报道。其中,由Mhp感染引起的肺炎对猪危害巨大,其蛋白质组学的研究备受关注。Jéssica Andrade Paes等(2018)利用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)比较了致病株Mhp 7448、非致病菌株Mhp J及共生菌絮状支原体的全蛋白质图谱,鉴定了许多存在于致病株中而与其他两菌株呈现差异表达的蛋白,其中包括一些潜在的Mhp抗原决定簇,包括黏附素、蛋白酶及氧化还原平衡相关蛋白等。同年,他们利用这三种菌株感染猪气管细胞系NPTr后进行了分泌蛋白质组学分析,发现三种支原体感染NPTr过程中均产生了毒力因子,但致病株Mhp 7448分泌了更高水平的黏附素和未知的蛋白,提示可能是其具有致病力的原因。

2019年,Li等采用iTRAQ的方法比较了致病株Mhp168及传代减毒株168L的蛋白表达谱,总共鉴定出489种蛋白质,其中70种蛋白在两菌株呈现显著的差异表达;进一步发现,在致病株中,参与磷酸肌醇代谢的蛋白的表达水平明显下降,而一些参与核酸代谢的蛋白表达量明显上升。同时,发现了一些潜在的毒力因子,为日后针对Mhp疫苗的研发奠定了基础。

(二)牛支原体蛋白质组学

牛支原体( M. bovis )是导致牛肺炎、乳腺炎及关节炎的病原体,利用蛋白质组学方法筛选关键免疫原蛋白和更新诊断技术对于预防和控制牛支原体的感染至关重要。陈维采用双向电泳与免疫印迹方法对牛支原体的全细菌蛋白进行了免疫蛋白质组学研究,筛选出50个免疫原性蛋白,最终发现P32蛋白具有较强的免疫原性且与其他病原的阳性血清无交叉反应,有望成为牛支原体的诊断抗原。Sun等利用双向凝胶电泳、免疫印迹及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOF/TOF MS)方法,从牛支原体PD株中鉴定出19种具有较强免疫原性的蛋白,并建立了基于丙酮酸脱氢酶复合物的重组E1β亚基的间接ELISA检测方法,进一步为牛支原体的检测提供了新策略。

近年来,对牛支原体进行分泌蛋白质组学分析,共鉴定出60个分泌蛋白,并证实MbovP0581蛋白是一个具有抗原性的分泌蛋白。这为开发针对牛支原体的诊断标记分子及疫苗的研究提供了方向。

(三)禽类支原体蛋白质组学

目前,禽类支原体蛋白质组学的研究主要集中在鸡支原体、MG及MS等。通过分析鸡支原体全蛋白图谱,发现鸡支原体具有与其他支原体同源的黏附蛋白,但缺乏规则的顶端结构。同时,发现了许多氨基肽酶基因同源物,推测其可能参与了鸡支原体的营养获取,进而有利于鸡支原体在宿主中繁殖。采用双向电泳等技术比较分析了MG疫苗株(6/85)和强毒株(K5234)的蛋白质组,共鉴定出29个差异表达的蛋白。与疫苗株相比,假定的毒力决定簇的表达在强毒株中出现升高,而几个与丙酮酸盐代谢相关的蛋白水平出现下降,为进一步研究MG的毒力决定簇及感染机制提供了参考。同时,耐泰乐菌素的MG突变株和对抗生素敏感株的蛋白组表达谱也不同,至少存在13种在两种毒株间差异表达的蛋白,且大多数蛋白具有催化活性,包括促进起始tRNA甲酰化和能量产生过程的催化。同时,延伸因子Tu(EF-Tu)和G(EF-G)在耐药株中出现过表达。这些蛋白酶表达的变化可能导致了耐药鸡毒支原体的产生。也有学者采用蛋白质组学技术对滑液支原体分离株的免疫原蛋白进行了鉴定,或对MS分泌蛋白进行了测定,但仍有待进一步的实验验证和深入研究。 9Uktc9MftVnXvIs8lW39+SqZqh5DfO1G8/EfWMCGtKkjKj0VXRLTRCS5qwbtFdR3

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